一株甲基营养型芽孢杆菌及其降解羽毛产寡肽的应用的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株甲基营养型芽孢杆菌及其降解羽毛产寡肽的应用。

背景技术：

近年来，随着我国禽畜养殖规模不断扩大，产生了大量的畜禽废弃物，如羽毛、毛发、角、蹄等，其中废弃羽毛年产量达数十万吨，造成严重的环境负担。分析结果表明，羽毛等的主要成分是角蛋白，其粗蛋白含量可达到80％以上，且含有多种氨基酸，还含有较多常量元素、微量元素以及一些未知生长因子，是一种潜在价值很高的饲料蛋白源。然而，由于羽毛角蛋白分子间存在大量的二硫键、氢键和疏水基相互作用，分子结构紧密而复杂，使其难以被动物来源的蛋白酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶降解。

国内外对羽毛降解产蛋白饲料做了大量的研究，目前主要有物理法、化学法、酶法和微生物发酵法，与前三种方法相比，微生物发酵法不仅工艺简单，避免了大量动力和能量的消耗，而且菌体本身就是蛋白源、营养成分更加平衡，适口性也更好，因此受到国内外研究人员的高度重视，具有广泛的用途和广阔的开发应用前景。但实际上，由于发酵产品中大分子蛋白含量高，消化率低，在动物饲料中可添加量不足10％，造成大量的资源浪费。

羽毛角蛋白降解产物除了可溶性蛋白，还有小分子肽类、氨基酸等。肽是氨基酸脱水聚合的产物，通常把由10～100个氨基酸分子脱水缩合而成的化合物叫多肽，把由2～10个氨基酸组成的肽称为寡肽(小分子肽)。根据现代消化理论，寡肽可不经消化直接被动物体吸收，具有吸收速度快，耗能低，不易饱和等特点，而且不与氨基酸的吸收相竞争，能够大大提高蛋白的吸收利用率。此外，很多研究已经证实，给动物饲喂低水平蛋白质并补充合成氨基酸日粮并不能获得最佳的生产性能和饲料效率，而要达到这两个目的，日粮必须要有一定数量的原蛋白质和寡肽。

现有技术中，对羽毛角蛋白降解的研究大都集中在提高其降解效率、提高角蛋白酶含量和活性的研究上，例如，申请号为2011102816561的专利提供一种单胞菌，该菌在优选的发酵条件下培养24h，角蛋白酶活力可达150u/ml，优于国内外报道的大多数菌株。而对于羽毛角蛋白降解发酵产物中寡肽的产率，尤其是在生产动物饲料中的应用方面，尚未得到较多关注，这就导致了高效降解发酵得到的大量再生资源，难以被充分利用和快速消耗，造成再生资源的积压，不利于实现畜禽废弃物再生利用的工业生产。

技术实现要素：

本发明的首要目的是提供一株发酵产物中寡肽产率高的甲基营养型芽孢杆菌(bacillusmethylotrophicus)h0，于2017年6月22日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏编号为：cgmccno.14263，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。

本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌h0从养鸡场长期堆放羽毛废弃物的土壤中筛选得到，其形态特征为：细胞形态为杆状，长1.27～3μm，无鞭毛，革兰氏染色为阳性；其菌落特征为：在牛肉膏蛋白胨平板上培养48h后，菌落近圆形，扁平状，中间凸起，边缘有缺刻，不透明，干燥易挑取；其培养条件的ph值范围为2.0～11.0，最适ph值为7.0，生长温度为20～45℃，最适温度为31℃，在牛肉膏蛋白胨培养基中生长迅速，8h后进入稳定期。

本发明的另一个目的是提供甲基营养型芽孢杆菌h0在降解羽毛生产羽毛寡肽粉和寡肽溶液的应用。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：包括以下步骤：

1)、制备二级种子液：挑取斜面保存的甲基营养型芽孢杆菌h0一环，接种到牛肉膏蛋白胨试管培养基中31℃活化12h得到一级种子液，再将一级种子液按照2％接种量接种至30ml牛肉膏蛋白胨培养基中31℃培养12h，即得二级种子液。

所述牛肉膏蛋白胨培养基包括：蛋白胨10g/l，牛肉膏5g/l，氯化钠5g/l，ph值为7.0，在121℃灭菌20min。

2)、发酵降解羽毛：将甲基营养型芽孢杆菌h0的二级种子液按2％的接种量接入发酵培养基中，在温度20～45℃、ph值为6～11的条件下发酵72h，对发酵液进行抽滤，分别收集滤液和滤渣。

优选的：对所述的发酵产物进行干燥、粉碎制备得到羽毛寡肽粉。

优选的：对所述发酵产物进行固液分离，超滤后得到寡肽溶液，进一步对其干燥、粉碎得到寡肽粉。

优选的：所述的发酵培养基包括：羽毛10g、nacl0.5g、k2hpo40.7g、kh2po40.35g，蒸馏水1000ml，121℃灭菌20min。所述的甲基营养型芽孢杆菌h0降解羽毛产寡肽的发酵可以为液体发酵，也可以为固态发酵。

优选的：所述的发酵温度为40℃。

优选的：所述的发酵条件ph值为11。

本发明具有以下有益效果：能够将完整羽毛几乎完全降解，降解产物中羽毛寡肽含量高，可用于生产易消化、高附加值的羽毛寡肽粉。具体来说，本发明提供的甲基营养型芽孢杆菌h0对羽毛角蛋白废弃物有很强的降解能力，能够将其降解为动物易吸收的寡肽，其降解产物用于生产动物饲料时可以大大提高蛋白的吸收利用率，有利于获得最佳的生产性能和饲料效率。这样解决了羽毛角蛋白降解产物中大分子蛋白含量高、消化率低的问题，显著提高了降解产物在动物饲料中的可添加量，实现了资源的充分循环利用。本发明提供的菌株在降解羽毛角蛋白生产羽毛寡肽粉方面具有广阔的开发应用前景。

附图说明

图1为甲基营养型芽孢杆菌h0的扫描电镜图；

图2为甲基营养型芽孢杆菌h0的革兰氏染色图；

图3为甲基营养型芽孢杆菌h0在牛肉膏蛋白胨培养基中的生长曲线图；

图4为甲基营养型芽孢杆菌h0产寡肽的发酵温度优化柱形图；

图5为甲基营养型芽孢杆菌h0产寡肽的发酵ph优化柱形图；

图6为甲基营养型芽孢杆菌h0产寡肽的发酵时间优化柱形图；

图7为发酵培养基发酵前后的对比照片。

图8为羽毛寡肽粉、寡肽溶液及寡肽粉的制备过程。

具体实施方式

下面具体提供优选的实施例，以使本领域技术人员更加清楚本发明的技术方案和效果。

实施例1：菌株的筛选

1、富集和驯化：取长期堆积羽毛的土壤、发酵池沼渣和下水沟淤泥的混合样品，与水按照1:5的质量比混合均匀。从中取10ml分装到盛有80ml一号富集培养基的250ml三角瓶中，在37℃、ph值为7、150r/min的条件下摇床培养至羽毛基本腐烂；然后取瓶中富集液按5％的接种量接种至二号富集培养基中，在与上述相同的条件下培养至羽毛基本腐烂，传代两次。

所述的一号富集培养基的成分为：nh4cl0.5g、nacl0.5g、k2hpo40.7g、kh2po40.35g、mgso4·7h2o0.2g、酵母膏0.1g、葡萄糖1g，ph值7.0，加入羽毛5g，115℃灭菌30min。

所述的二号富集培养基的成分为：nacl0.5g、k2hpo40.7g、kh2po40.35g、mgso4·7h2o0.2g、ph值7.0，加入羽毛5g，121℃灭菌20min。

2、初筛和复筛：取步骤1中得到的富集液0.1ml涂布于初筛培养基上，重复三次以上至纯化；挑取有透明圈的菌落接种至种子培养基上过夜培养，然后将其按20％的接种量接种于含有5ml复筛培养基的试管中进行复筛，记录各菌株降解羽毛的快慢，筛选出的菌株保存于4℃的冰箱中。

所述的初筛培养基的成分为：nh4cl0.5g、nacl0.5g、k2hpo40.7g、kh2po40.35g、mgso4·7h2o0.2g、酵母膏0.1g、酪蛋白7g，ph值7.0，121℃灭菌20min。

所述的复筛培养基的成分为：nacl0.5g、k2hpo40.7g、kh2po40.35g、mgso4·7h2o0.2g、ph值7.0，羽毛6g，121℃灭菌30min。

所述种子培养基的成分为：蛋白胨10g、牛肉膏5g，氯化钠5g，ph值7.0，121℃灭菌20min。

3、二次复筛：将步骤2中筛出的菌株在种子培养基中活化24h，然后按2％的接种量接入装有50ml发酵培养基的250ml三角瓶中，在37℃、ph值为7、150r/min的条件下培养72h，根据各菌株对羽毛的降解情况、多肽和寡肽产率的高低进行二次复筛。

所述的发酵培养基的成分为：羽毛10g、nacl0.5g、k2hpo40.7g、kh2po40.35g，蒸馏水1000ml、ph值7，121℃灭菌20min。

实施例2：菌株鉴定

1、菌落及菌体的形态观察：将纯化分离的甲基营养型芽孢杆菌h0在牛肉膏蛋白胨平板培养基上进行划线培养，在37℃恒温培养48h，肉眼观察菌落近圆形，扁平状，中间凸起，边缘有缺刻，不透明，干燥易挑取。扫描电子显微镜下观察，如图1所示，菌体呈杆状，长1.27～3μm，无鞭毛，革兰氏鉴定为阳性(如图2所示)。

2、培养特征观察：将甲基营养型芽孢杆菌h0按相同的接种量分别接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，置于不同温度下摇床培养18h，在20～45℃环境中的菌株能够生长，且28℃环境下的菌株生长最快；置于不同初始ph值环境下摇床培养18h，在ph值范围为2～11的环境中菌株能够生长，且在ph值为7的环境中生长最快。

另取甲基营养型芽孢杆菌h0以2％的接种量接入牛肉膏蛋白胨培养基，在37℃、ph值为7的条件下培养，每隔2h取培养液0.5ml，置于盛有4.5ml蒸馏水的试管中，混合均匀后于600nm波长下测定吸光值并绘制成曲线，绘制结果如图3所示，即为该菌株的生长曲线，在培养8h后进入稳定期，稳定期达10h。

3、分子生物学鉴定：采用细菌全基因组快速抽提试剂盒，提取纯菌株的全基因组，通过选用细菌16srdna通用引物27f和1492r进行pcr，然后测序分析。测序结果经blast比对，鉴定该菌株为本发明的保藏菌株甲基营养型芽孢杆菌h0，遗传序列如序列表。

实施例3：产寡肽发酵条件优化

1)、制备二级种子液：挑取斜面保存的甲基营养型芽孢杆菌h0一环，接种到牛肉膏蛋白胨试管培养基中31℃活化12h得到一级种子液，再将一级种子液按照2％接种量接种至30ml牛肉膏蛋白胨培养基中31℃培养12h，即得二级种子液。

所述牛肉膏蛋白胨培养基包括：蛋白胨10g/l，牛肉膏5g/l，氯化钠5g/l，ph值为7.0，在121℃灭菌20min。

2)、发酵降解羽毛：将甲基营养型芽孢杆菌h0的二级种子液按2％的接种量接入发酵培养基中，采用单因素实验考察不同发酵ph、发酵温度和发酵周期对羽毛降解率以及寡肽产率的影响，摇瓶初始发酵条件为：2％接种量，ph值为7，在37℃、180r/min条件下摇床培养72h。

发酵温度优选实验：其它发酵条件为初始发酵条件，分别于20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃条件下摇床培养72h后测定寡肽产率。测定结果如图4所示，发酵温度为40℃时，寡肽产率最高，为50.85％，故选择发酵温度为40℃。

发酵ph值的优选实验：其它发酵条件为初始发酵条件，调整初始ph值分别为6、7、8、9、10、11，摇床培养72h后测定产率含量。测定结果如图5所示，初始ph值为11时，寡肽产率最高，为54.23％，故选择初始ph值为11。

发酵周期的优选实验：其它发酵条件为初始发酵条件，每隔24h取样测定寡肽产率，确定菌株发酵的最优周期。测定结果如图6所示，发酵72h，寡肽产率最高，达58.60％，故选择发酵周期为72h。

实施例4：降解羽毛产寡肽

1)、制备二级种子液：挑取斜面保存的甲基营养型芽孢杆菌h0一环，接种到牛肉膏蛋白胨试管培养基中28℃活化12h得到一级种子液，再将一级种子液按照2％接种量接种至30ml牛肉膏蛋白胨培养基中28℃培养12h，即得二级种子液。

2)、发酵降解羽毛：将甲基营养型芽孢杆菌h0的二级种子液按2％的接种量接入发酵培养基中，在温度40℃、ph值为12的条件下发酵72h，观察发酵过程中羽毛降解现象。随着发酵时间增加，羽小枝脱落，培养基逐渐浑浊，待发酵结束时，完整羽毛几乎被完全降解，如图7所示，发酵液呈乳白色。收集发酵产物，测得羽毛的降解率达90.86％，总肽产率达83.39％，寡肽产率达58.28％。

实施例5：不同处理对羽毛降解产寡肽的影响

设置3组对照实验，实验条件分别设置为：1)自然ph，培养基不灭菌，不接种；2)ph调整为11，121℃灭菌20min；不接种；3)ph调整为11，121℃灭菌20min，按照2％接种量接种甲基营养型芽孢杆菌h0；其他条件同实施例3，研究不同处理对羽毛降解产寡肽的影响，结果如下表所示：

表1不同处理下的羽毛降解产寡肽率

实施例6：羽毛寡肽粉制备

在实施例4的基础上，将收集的发酵产物进行烘干、研磨处理得到羽毛寡肽粉。

实施例7：寡肽溶液制备

在实施例4的基础上，对发酵产物进行固液分离，超滤后得到寡肽溶液，进一步将寡肽溶液烘干、研磨得到寡肽粉。

由表1可见，本发明提供的菌株和发酵方法大大提高了降解产物中寡肽的含量，使羽毛等畜禽废弃物快速降解，并产生能够在动物饲料中大量添加的羽毛寡肽粉，进而利用该羽毛寡肽粉生产最佳生产性能和饲料效率的日粮。这样就显著提高了畜禽废弃物再生资源的利用率，避免了高效生产出的再生资源的积压，为羽毛寡肽粉的工业生产奠定了基础。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110>中国科学院成都生物研究所

<120>一株甲基营养型芽孢杆菌及其降解羽毛产寡肽的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1462

<212>dna

<213>甲基营养型芽孢杆菌(bacillusmethylotrophicus)

<400>1

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