一种靶向疗法和免疫疗法联合的多肽的制作方法

本发明涉及生物工程制药技术领域，具体涉及一种靶向疗法和免疫疗法联合的多肽及其用途。

背景技术：

肿瘤疾病已成为全球卫生保健和卫生资源的沉重负担，也是卫生革命的头号敌人。《柳叶刀》(lancet.2015，385(9972):977-1010)的全球癌症生存监测报告显示我国癌症5年相对生存率仅为30.9％，其中肺癌为16.1％，结直肠癌47.2％。

缺乏肿瘤靶向性和逃避免疫系统监护是导致许多抗肿瘤药物失效或耐药的重要原因，因此寻找一种将免疫疗法和靶向疗法联合的药物是治疗肿瘤的重要方向。根据douglashanahan和roberta.weinberg(cell,2011，144(5):646-674)总结的肿瘤细胞的十大特征，其中一个特征就是避免免疫摧毁(avoidingimmunedestruction)。无容置疑的是免疫系统在清除肿瘤中发挥着重要的作用。而实体肿瘤为了能恶性增殖却发展出不同的路径来摆脱人体免疫系统监视。因而针对肿瘤的这个“避免免疫摧毁”的特征，免疫疗法不失为一个重要的崭新的抗癌方法(biochempharmacol.2016，102:1-6)。

在癌症治疗中，如何将抗癌药物有效地特异性地靶向甚至进一步地穿透至肿瘤内部是一个重要的亟待解决的命题。如果这个命题能得到有效解决，这将极大限度发挥现有抗癌药物的疗效并避免其对正常组织例如骨髓，粘膜，皮肤和小肠等进行快速细胞更新和连续细胞分裂的器官的大量损伤，从而降低病人的痛苦。

整合素是一类广泛存在于细胞表面的细胞外基质成分的受体家族，也是细胞表面受体的主要家族，属于一类细胞粘附分子。大量研究表明，含αν亚基的整合素选择性地在肿瘤细胞表面高度表达(desgrosellierjs等.natrevcancer.2010，10(1):9-22.)。如果一个分子具有了与含αν亚基的整合素高的亲和力，那就意味着其具有肿瘤细胞的靶向性。而一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arg-gly-asp，简称rgr)的小分子多肽被发现可以与含有αν亚基的整合素特异性结合(pasqualinir等natbiotechnol.1997，15(6):542-6.)从而可实现肿瘤细胞靶向性效果，可以有效地减少肿瘤治疗中对正常组织或器官的损害。

胸腺五肽是一类具有抗肿瘤作用的免疫调节因子，但其作用的多样性和非肿瘤靶向性极大限制其在抗肿瘤方面的应用。

技术实现要素：

本发明将胸腺五肽(以下简称tp5)和一个包含精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-精氨酸的四肽(简称rgdr)在c端进行连接，构建一个具有与αν类整合素和神经菌毛素-1特异结合的特性的新型的抗肿瘤药物。其氨基酸序列如seqidno:1所示。所获产物与原型tp5相比，具有更高效的抗肿瘤效果。

本发明在胸腺五肽(插入序列)的c端链接rgdr序列，其氨基酸序列如seqidno:1所示。为了比较本发明多肽序列的实际效果，本发明同时合成了原型胸腺五肽,其氨基酸序列如seqidno:2所示；也合成了tp5-rgr作为对比，其氨基酸序列如seqidno:3所示,tp5-rgr含有原型胸腺五肽的全部氨基酸序列，且在其羧基端含有肿瘤细胞靶向性多肽片段精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列。

下面是部分药效学实验及结果：

1.动物体内抗肿瘤实验1

(1)将小鼠乳腺癌4t1细胞复苏，以含有10％胎牛血清的rpmi1640培养基孵育，37℃,5％co2培养箱中培养，换液，至细胞长至对数期时，进行传代，获得足够的细胞数量；收集小鼠黑色素瘤b16f10细胞细胞，胰酶消化，1000转每分钟，离心5分钟，pbs清洗三次，用生理盐水(0.9％nacl)重悬细胞，在显微镜下进行细胞计数，稀释成1×10⁷个/ml的细胞悬液。

(2)使用4到6周龄雌性balb/c小鼠。

(3)在每只balb/c小鼠前肢左侧皮下注射0.1ml细胞悬液，十天左右，接瘤处出现80mm³-100mm³肿瘤块；小鼠按照瘤块体积大小分组，分别为给药组、对照组。给药组包括本发明多肽tp5-rgdr,还包括tp5-rgd和tp5，剂量皆为0.22μmol/kg。每天在小鼠前肢右侧皮下给药0.1ml，利用游标卡尺测量肿瘤的长与宽，并且计算肿瘤大小，肿瘤体积公式：体积＝0.5×长×宽²，称量小鼠体重。待阴性对照组小鼠的肿瘤体积平均约达1000mm³时，处死小鼠，取血，解剖肿瘤，称量瘤重，进行分析。elisa检测各组肿瘤模型中ifn-γ含量。肿瘤抑制率＝(1-治疗组肿瘤体积/阴性对照组肿瘤体积)×100％。肿瘤体积测定结果如图1所示，当治疗至第21天时，本发明多肽tp5-rgdr的肿瘤抑制率为21％，而tp5的抑制率为9％，而tp5-rgd的抑制率为17％；实验结果说明本发明多肽tp5-rgdr确实能够显著一直小鼠体内的肿瘤生长，不仅比原型tp5具有更好的肿瘤抑制效果，还比tp5-rgd也具有更强的抗肿瘤生长作用。肿瘤最终重量测定结果如表1所示，此结果也说明本发明多肽tp5-rgdr也确实比tp5-rgd及tp5有着更强的抑制肿瘤生长的活性。ifn-γ含量测定的结果如图2所示，结果表明本发明多肽tp5-rgd比tp5具有更好促进抗肿瘤免疫因子ifn-γ的分泌作用，也比tp5-rgd具有更强的促ifn-γ分泌作用，也就是说本发明多肽tp5-rgd具有更好的抗肿瘤免疫调节作用。

表1.tp5-rgdr对小鼠体内移植乳腺癌(4t1)的实验治疗作用

2.动物体内抗肿瘤实验2

(1)体外培养人乳腺癌mcf-7细胞，胰酶消化收集人乳腺癌mcf-7细胞，1000转每分钟，离心5分钟，pbs清洗三次，用生理盐水(0.9％nacl)重悬细胞，在显微镜下用血细胞计数板进行细胞计数，稀释成1×10⁷个/ml的细胞悬液。

(2)使用实验用4-6周龄雌性balb/c裸鼠。

(3)在每只balb/c裸鼠前肢左侧皮下注射0.1ml细胞悬液，十天左右，接瘤处出现80mm³-100mm³肿瘤块；小鼠按照瘤块体积大小分组，分别为给药组、对照组。给药组包括本发明多肽tp5-rgdr,还包括tp5-rgd和tp5，剂量皆为0.22μmol/kg。每天在小鼠前肢右侧皮下给药0.1ml，利用游标卡尺测量肿瘤的长与宽，并且计算肿瘤大小，肿瘤体积公式：体积＝0.5×长×宽²，称量小鼠体重。待阴性对照组小鼠的肿瘤体积平均约达1000mm³时，处死小鼠，解剖肿瘤，称量瘤重，进行分析。肿瘤体积测定结果如图3所示，当治疗至第21天时，本发明多肽tp5-rgdr的肿瘤抑制率为32％，而tp5的抑制率为18％，而tp5-rgd的抑制率为26％；实验结果说明本发明多肽tp5-rgdr确实能够显著一直小鼠体内的肿瘤生长，不仅比原型tp5具有更好的肿瘤抑制效果，还比tp5-rgd也具有更强的抗肿瘤生长作用。肿瘤最终重量测定结果如表2所示，此结果也说明本发明多肽tp5-rgdr也确实比tp5-rgd及tp5有着更强的抑制肿瘤生长的活性。

表2.tp5-rgdr对裸鼠体内移植人乳腺癌(mcf-7)的实验治疗作用

附图说明

图1是多肽体内抑制4t1肿瘤效果

图2是多肽体内促进抗肿瘤免疫因子ifn-γ分泌效果

图3是多肽体内抑制mcf-7肿瘤效果

图4是本发明多肽的纯度测定

图5是本发明多肽的分子量测定

具体实施方式

实施例1

首先将氨基酸序列如seqidno:1所示的c端的第一个氨基酸先用fmoc(9-芴甲氧羰基)基团对α-氨基进行保护，然后通过一个氯甲基聚苯乙烯树脂作为不溶性的固相载体将羧基端共价连接，随后在三氟乙酸的作用下，将α-氨基脱保护，用溶液洗涤氨基酸—支臂—树脂，这样第一个氨基酸就接到了固相载体上了。第二个氨基酸的羧基通过dcc(n，n-二环己基碳二亚胺)法活化，再与已接在固相载体的第一个氨基酸的氨基反应形成肽键，缩合反应完成后，用溶液洗涤，重复进行脱保护、偶联，重复上述肽键形成反应，使肽链从c端向n端生长，直至达到所需要的九个肽的长度。最后脱去保护基，用hf(氢氟酸)水解肽链和固相载体之间的酯键，就得到了目的肽如seqidno:1所示。

多肽纯化使用反相柱c18柱进行，检测波长为220nm，缓冲体系为含tfa的溶剂，ph2.0。buffera为含0.1％tfainddh2o，bufferb为1％tfa/acn/ph2.0。纯化之后用hr-hplc进行纯度测定，检测波长为220nm，流速为1ml/min；流动相为：buffera为含0.1％tfainwater，bufferb为1％tfainacetonitrile，梯度洗脱40％-60％bufferb,20min。纯度鉴定结果如图4所示，经计算表明最终纯化多肽纯度为98.35％。所得多肽再经过esi-ms进行分子量鉴定，流速为0.2ml/min，运行时间1min，流动相为：buffera为含ch3coohinwater，bufferb为ch3coohinacetonitrile。分子量测定结果如图5所示，经计算表明合成的多肽的分子量为1164.30道尔顿，与理论分子量一致。

序列表

<110>中国药科大学

<120>一种靶向疗法和免疫疗法联合的多肽

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>9

<212>prt

<213>人工序列(artificial)

<400>1

arglysaspvaltyrargglyasparg

15

<210>2

<211>5

<212>prt

<213>人工序列(artificial)

<400>2

arglysaspvaltyr

15

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<212>prt

<213>人工序列(artificial)

<400>3

arglysaspvaltyrargglyasp

15