一种大黄鱼的抗氧化反应指示物的制作方法

本发明涉及反应指示物领域，尤其是涉及一种大黄鱼的抗氧化反应指示物。

技术背景

氧化应激产生的活性氧ros（reactiveoxygenspecies）直接或间接地损伤细胞内蛋白质、脂质、核酸等大分子物质的生理功能，是众多疾病发生的病理生理基础。机体形成了一套复杂的氧化应激应答系统，当暴露于亲电子试剂或活性氧刺激时，能诱导出一系列的保护性蛋白，以缓解细胞所受的损害。nf-e2相关因子2（nf-e2-relatednuclearfactor2，nrf2）在细胞抗氧化反应中发挥重要作用。正常生理状态下，nrf2与kelch样ech相关蛋白1（kelch-like-ech-associatedprotein1，keap1）大量结合并在细胞质中快速降解。一旦细胞受到应激，nrf2与keap1分离，进入细胞核中调控抗氧化酶相关基因的表达。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种大黄鱼的抗氧化反应指示物的用途，大黄鱼的抗氧化反应指示物有助于考察海水中的重金属污染情况，具有较高的现实意义。

本发明的目的之二在于提供一种大黄鱼的抗氧化反应指示物的确定方法，本抗氧化反应指示物的确定方法较为简单，精确度较高。

本发明针对

背景技术：
中提到的问题，采取的技术方案为：一种大黄鱼的抗氧化反应指示物，大黄鱼中nrf2转录因子的表达与cu/zn-sod、mn-sod、cat、gpx1a、gpx1b和gr的基因表达水平存在正相关，nrf2转录因子的表达与nrf2的蛋白含量也存在正相关，因此，nrf2的mrna丰度和蛋白含量可作为大黄鱼抗氧化反应的指示物，这有助于人们了解水中重金属离子对鱼的抗氧化反应的分子机制，进而有助于通过大黄鱼来考察海水中的重金属污染物，因此具有较高的现实意义。

作为优选，确定nrf2的mrna丰度和蛋白含量作为大黄鱼抗氧化反应指示物的方法包括：驯化大黄鱼、提取肝脏物质、rt-pcr实时荧光定量检测，具体包括以下步骤：

驯化大黄鱼：将大黄鱼在圆形玻璃缸中圈养15-20天，每天2-3次投喂商业饲料，饲料中脂质与蛋白质的干物含量分别为10-11%与48-50%，选取135条均一尺寸、重量为86-92g的大黄鱼随机分配到9个玻璃缸中，玻璃缸连续曝气，每天换水，每天维持14-15小时光照、9-10小时黑暗，水质参数如下：水温20-28℃，盐度25.5-26.5、溶氧量6.8-7.2mg/l，ph值为7.52-8.04，水质硬度为碳酸钙浓度120-125mg/l；将hgcl2加入到养殖水缸中配成含hg溶液，hg的含量分别为32、64μghgl^-1，取暴露在含hg溶液中的大黄鱼浸泡在苯佐卡因中被麻醉过量致死，取肝脏样本待用；经测定，大黄鱼在急性无机汞环境下暴露96小时的半数致死率（lc50）为160μghgl^-1，在大黄鱼的拟生长环境下进行检测不仅可以精细化地测定抗氧化反应指示物的特异性，而且基于人道主义考虑，同时保护了生态；

提取肝脏物质：肝脏样本被均质到10-15倍的冰冷的缓冲液中，缓冲液组成为：1.0-1.2mmedta、1.0-1.2mmdtt、0.5-0.6m蔗糖溶液、0.15-0.18mkcl、0.13-0.15μm（s）-4-苄基-2-唑烷酮，ph为7.6-7.8；肝脏匀浆在0-4℃下以900-1000g离心8-10分钟以沉淀大粒子，然后再次在0-4℃下以12000-14000g离心15-20分钟，收集漂浮物并于-80~-100℃保存以供生化分析；通过肝脏组织可以对铜/锌超氧化物歧化酶（cu/zn-sod）、锰超氧化物歧化酶（mn-sod）、过氧化氢酶（cat）、谷胱甘肽过氧化物酶1a（gpx1a）、谷胱甘肽过氧化物酶1b（gpx1b）和谷胱甘肽还原酶（gr）等抗氧化酶的酶活性进行定量检测；缓冲液中的（s）-4-苄基-2-唑烷酮能够与肝脏组织中的铅离子、铜离子、汞离子等二价重金属离子形成络合物，将重金属离子从组织中分离入溶液中，同时缓冲液还可以分离肝脏样本中无用的脂肪、杂蛋白等杂质，不会对肝脏组织中各抗氧化酶与总rna造成分解与影响，提高检测的精确度；

rt-pcr实时荧光定量检测：依据trizol（invitrogen）试剂盒说明进行肝脏总rna的提取，用2-3mg总rna作为模板，按照first-strandcdnasynthesiskit(fermentas)说明书合成第一链cdna，cdna稀释入200μl蒸馏水中；rt-pcr放大总反应体系为20μl，包含10μlsybrpremixextaqmastermix(takara)、1.98-2.03μlcdna、0.19-0.21μm上游引物、0.19-0.21μm下游引物；按照以下程序进行pcr反应：94-95℃1分钟，其次是93-95℃5秒、55-57℃10秒、70-72℃30秒一个循环周期，循环运行45-48个周期；rt-pcr具有灵敏度高、准确性好、可操作性强的优点，可以方便地对nrf2、cu/zn-sod、mn-sod、cat、gpx1a、gpx1b和gr等微量基因的表达进行检测并定量分析，进而分析出nrf2与cu/zn-sod、mn-sod、cat、gpx1a、gpx1b、gr的相关性；经测定，如图10所示，nrf2转录因子的表达与cu/zn-sod，mn-sod，cat，gpx1a，gpx1b和gr的基因表达水平存在正相关，nrf2转录因子的表达与nrf2的蛋白含量存在正相关，因此，nrf2的mrna丰度及其蛋白含量可作为大黄鱼抗氧化反应的指示物。

作为优选，采用rt-pcr测定大黄鱼nrf2基因的mrna丰度，引物序列：

f：ccctcaaaatccctttcact，r：gctaccttgttcttgccgc；内参基因为β-actin，引物序列为：f：tcgtcggtcgtcccaggcat，r：atggcgtggggcagagcgt；所用引物序列详见图1。

与现有技术相比，本发明的优点在于：1）缓冲液中的（s）-4-苄基-2-唑烷酮能够与肝脏组织中的铅离子、铜离子、汞离子等二价重金属离子形成络合物，将重金属离子从组织中分离入溶液中，同时缓冲液还可以分离肝脏样本中无用的脂肪、杂蛋白等杂质，不会对肝脏组织中的总rna造成分解与影响，提高检测的精确度；2）本发明方法中大黄鱼的抗氧化指示物的确定方法简单，易于操作，而且精确度较高，大黄鱼抗氧化指示物的确定有助于人们了解水中重金属离子对鱼的抗氧化反应的分子机制，进而有助于通过大黄鱼考察海水中的重金属污染情况，具有较高的现实意义。

附图说明

图1是本发明中所用到的引物序列；

图2是本发明中hg作用后缓冲液对nrf2基因的mrna相对表达水平的影响；

图3是本发明中hg作用后mda与gsh的含量示意图；

图4是本发明中hg作用后sod与cat的酶活性图；

图5是本发明中hg作用后gpx与gr的酶活性图；

图6是本发明中hg作用后gst的酶活性图；

图7是本发明中hg作用后cu/zn-sod与mn-sod的基因相对表达图；

图8是本发明中hg作用后cat与gpx1a的基因相对表达图；

图9是本发明中hg作用后gpx1b与gr的基因相对表达图；

图10是本发明中hg作用后nrf2与keap1的基因相对表达图；

图11是本发明的nrf2的基因表达与cu/zn-sod、mn-sod、cat、gpx1a、gpx1b、gr的mrna水平之间及与nrf2的蛋白含量之间的相关性示意图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：

实施例1：

确定nrf2的mrna丰度和蛋白含量作为大黄鱼抗氧化反应指示物的方法包括：驯化大黄鱼、提取肝脏物质、rt-pcr实时荧光定量检测，具体包括以下步骤：

1）将大黄鱼在圆形玻璃缸中圈养15天，每天2次投喂商业饲料，饲料中脂质与蛋白质的干物含量分别为10%与48%，选取135条均一尺寸、重量为86-90g的大黄鱼随机分配到9个玻璃缸中，玻璃缸连续曝气，每天换水，每天维持14小时光照、10小时黑暗，水质参数如下：水温20℃，盐度25.5、溶氧量6.8mg/l，ph值为7.52，水质硬度为碳酸钙浓度120mg/l；将hgcl2加入到养殖水缸中配成含hg溶液，hg的含量分别为32、64μghgl^-1，取暴露在含hg溶液中的大黄鱼浸泡在苯佐卡因中被麻醉过量致死，取肝脏样本待用；2）肝脏样本被均质到10-15倍的冰冷的缓冲液中，缓冲液组成为：1.0mmedta、1.0mmdtt、0.5m蔗糖溶液、0.15mkcl，ph为7.6；肝脏匀浆在0℃下以900g离心8分钟以沉淀大粒子，然后再次在0℃下以12000g离心15分钟，收集漂浮物并于-80℃保存以供生化分析；3）依据trizol（invitrogen）试剂盒说明进行肝脏总rna的提取，用2mg总rna作为模板，按照first-strandcdnasynthesiskit(fermentas)说明书合成第一链cdna，cdna稀释入200μl蒸馏水中；rt-pcr放大总反应体系为20μl，包含10μlsybrpremixextaqmastermix(takara)、1.98μlcdna、0.19μm上游引物、0.19μm下游引物；按照以下程序进行pcr反应：94℃1分钟，其次是93℃5秒、55℃10秒、70℃30秒一个循环周期，循环运行45个周期；rt-pcr具有灵敏度高、准确性好、可操作性强的优点，可以方便地对nrf2、cu/zn-sod、mn-sod、cat、gpx1a、gpx1b和gr等微量基因的表达进行检测并定量分析，进而分析出nrf2与cu/zn-sod、mn-sod、cat、gpx1a、gpx1b、gr的相关性。

采用rt-pcr测定大黄鱼nrf2基因的mrna丰度，引物序列：f：ccctcaaaatccctttcact，r：gctaccttgttcttgccgc；内参基因为β-actin，引物序列为：f：tcgtcggtcgtcccaggcat，r：atggcgtggggcagagcgt；所用引物序列详见图1。

实施例2：

一种大黄鱼的抗氧化反应指示物，大黄鱼中nrf2转录因子的表达与抗氧化酶（cu/zn-sod、mn-sod、cat、gpx1a、gpx1b和gr）的基因表达水平存在正相关，nrf2转录因子的表达也与nrf2的蛋白含量存在正相关，因此，nrf2的mrna丰度和蛋白含量可作为大黄鱼抗氧化反应的指示物，有助于人们了解水中重金属离子对鱼的抗氧化反应的分子机制，进而有助于通过大黄鱼来考察海水中的重金属污染物，因此具有较高的现实意义。

确定nrf2的mrna丰度和蛋白质含量作为大黄鱼抗氧化反应指示物的方法包括：驯化大黄鱼、提取肝脏物质、rt-pcr实时荧光定量检测，具体包括以下步骤：

1）驯化大黄鱼：将大黄鱼在圆形玻璃缸中圈养18天，每天2次投喂商业饲料，饲料中脂质与蛋白质的干物含量分别为11%与48%，选取135条均一尺寸、重量为86-92g的大黄鱼随机分配到9个玻璃缸中，玻璃缸连续曝气，每天换水，每天维持15小时光照、9小时黑暗，水质参数如下：水温25℃，盐度26.0、溶氧量7.0mg/l，ph值为7.80，水质硬度为碳酸钙浓度120mg/l；将hgcl2加入到养殖水缸中配成含hg溶液，hg的含量分别为32、64μghgl^-1，取暴露在含hg溶液中的大黄鱼浸泡在苯佐卡因中被麻醉过量致死，取肝脏样本待用；经测定，大黄鱼在急性无机汞环境下暴露96小时的半数致死率（lc50）为160μghgl^-1，在大黄鱼的拟生长环境下进行检测不仅可以精细化地测定抗氧化反应指示物的特异性，而且保护了生态，同时基于了人道主义考虑；

2）提取肝脏物质：肝脏样本被均质到12倍的冰冷的缓冲液中，缓冲液组成为：1.0mmedta、1.2mmdtt、0.6m蔗糖溶液、0.16mkcl、0.14μm（s）-4-苄基-2-唑烷酮，ph为7.6；肝脏匀浆在2℃下以1000g离心8分钟以沉淀大粒子，然后再次在2℃下以12000g离心20分钟，收集漂浮物并于-90℃保存以供生化分析；通过肝脏组织可以对cu/zn-sod、mn-sod、cat、gpx1a、gpx1b和gr等抗氧化酶的酶活性进行定量检测；缓冲液中的（s）-4-苄基-2-唑烷酮能够与肝脏组织中的铅离子、铜离子、汞离子等二价重金属离子形成络合物，将重金属离子从组织中分离入溶液中，经离心去除，同时缓冲液还可以分离肝脏样本中无用的脂肪、杂蛋白等杂质，不会对肝脏组织中的各抗氧化酶与总rna造成分解与影响，提高检测的精确度；

3）rt-pcr实时荧光定量检测：依据trizol（invitrogen）试剂盒说明进行肝脏总rna的提取，用2mg总rna作为模板，按照first-strandcdnasynthesiskit(fermentas)说明书合成第一链cdna，cdna稀释入200μl蒸馏水中；rt-pcr放大总反应体系为20μl，包含10μlsybrpremixextaqmastermix(takara)、2.0μlcdna、0.2μm上游引物、0.2μm下游引物；按照以下程序进行pcr反应：95℃1分钟，其次是95℃5秒、55℃10秒、72℃30秒一个循环周期，循环运行45个周期；rt-pcr具有灵敏度高、准确性好、可操作性强的优点，可以方便地对nrf2、铜/锌超氧化物歧化酶（cu/zn-sod）、锰超氧化物歧化酶（mn-sod）、过氧化氢酶（cat）、谷胱甘肽过氧化物酶1a（gpx1a）、谷胱甘肽过氧化物酶1b（gpx1b）和谷胱甘肽还原酶（gr）等微量基因表达进行检测并定量分析，进而分析出nrf2与cu/zn-sod、mn-sod、cat、gpx1a、gpx1b、gr的相关性；经测定，如图10所示，nrf2转录因子的表达与cu/zn-sod、mn-sod、cat、gpx1a、gpx1b和gr的基因表达水平存在正相关，nrf2转录因子的表达与nrf2的蛋白含量存在正相关，因此，nrf2的mrna丰度及其蛋白含量可作为大黄鱼抗氧化反应的指示物。

采用rt-pcr测定大黄鱼nrf2基因的mrna丰度，引物序列：

f：ccctcaaaatccctttcact，r：gctaccttgttcttgccgc；内参基因为β-actin，引物序列为：f：tcgtcggtcgtcccaggcat，r：atggcgtggggcagagcgt；rt-pcr实时荧光定量检测所用引物序列详见图1。

实施例3：

确定nrf2的mrna丰度和蛋白质含量作为大黄鱼抗氧化反应指示物的方法包括：驯化大黄鱼、提取肝脏物质、rt-pcr实时荧光定量检测，具体包括以下步骤：

驯化大黄鱼：将大黄鱼在圆形玻璃缸中圈养18天，每天2次投喂商业饲料，饲料中脂质与蛋白质的干物含量分别为10%与50%，选取135条均一尺寸、重量为86-90g的大黄鱼随机分配到9个玻璃缸中，玻璃缸连续曝气，每天换水，每天维持14小时光照、10小时黑暗，水质参数如下：水温24℃，盐度26.5、溶氧量7.2mg/l，ph值为8.00，水质硬度为碳酸钙浓度125mg/l；将hgcl2加入到养殖水缸中配成含hg溶液，hg的含量分别为32、64μghgl^-1，取暴露在含hg溶液中的大黄鱼浸泡在苯佐卡因中被麻醉过量致死，取肝脏样本待用；在大黄鱼的拟生长环境下进行检测不仅可以精细化地测定抗氧化反应指示物的特异性，而且保护了生态，同时基于了人道主义考虑；

提取肝脏物质：肝脏样本被均质到12倍的冰冷的缓冲液中，肝脏匀浆在2℃下以900g离心10分钟以沉淀大粒子，然后再次在1℃下以13000g离心20分钟，收集漂浮物并于-85℃保存以供生化分析；通过肝脏组织可以对cu/zn-sod、mn-sod、cat、gpx1a、gpx1b和gr等抗氧化酶的酶活性进行定量检测；缓冲液可以分离肝脏样本中无用的脂肪、杂蛋白等杂质，不会对肝脏组织中各抗氧化酶与总rna造成分解与影响，提高检测的精确度；

rt-pcr实时荧光定量检测：依据trizol（invitrogen）试剂盒说明进行肝脏总rna的提取，用2mg总rna作为模板，按照first-strandcdnasynthesiskit(fermentas)说明书合成第一链cdna，将cdna稀释入200μl蒸馏水中；rt-pcr放大反应体系为20μl，包含10μlsybrpremixextaqmastermix(takara)、1.98μlcdna、0.19μm上游引物、0.19μm下游引物；rt-pcr具有灵敏度高、准确性好、可操作性强的优点，可以方便地对nrf2、cu/zn-sod、mn-sod、cat、gpx1a、gpx1b和gr等微量基因的表达进行检测并定量分析，进而分析出nrf2与cu/zn-sod、mn-sod、cat、gpx1a、gpx1b、gr的相关性。

提取肝脏物质时的缓冲液组成为：1.2mmedta、1.2mmdtt、0.6m蔗糖溶液、0.18mkcl、0.55mm3-羟基丙醛，ph为7.7；3-羟基丙醛在水溶液中易发生聚合生成二聚体，二聚体的醛基与二硫苏糖醇（dtt）的羟基之间可以通过氢键连接，二聚体与二硫苏糖醇的作用有助于提高二硫苏糖醇对dna以及酶的保护作用，从而提高检测结果的精确度。

rt-pcr实时荧光定量检测反应程序设定为：95℃1分钟，其次是95℃5秒、55℃10秒、72℃30秒一个循环周期，循环运行48个周期，最后于72℃保温5分钟；首选使dna充分变性，然后进入扩增循环过程，扩增循环中依次进行模板变性、复性、延伸，扩增结束后保温使产物延伸完整。

rt-pcr实时荧光定量检测中所用到的全部引物序列如图1所示，利用各基因的正向与方向引物可以方便地对nrf2、cu/zn-sod、mn-sod、cat、gpx1a、gpx1b和gr等微量基因的表达进行检测并定量分析，进而分析出其相关性。

实施例4：

脂质过氧化是由硫代巴比妥活性物质（tbars）测定，测定了硫代巴比妥酸与丙二醛(mda)的反应产物，根据livingstone等人(livingstone，d.r.，martinez，p.g.，michel，x.，narhonne，j.f.，o'hara，s.，rihera，d.，winston，g.w.，1990.oxyradicalproductionasapollution-mediatedmechanismoftoxicityintheconunonmussel，mytilusedulisl.，andothermolluscs.funct.ecol.3.415-424.)所描述的方法。谷光氨肽（gsh）水平测试由vandeputteetal.(vandeputte，c.，guizon，i.，genestie-denis，i.，vannier，b.，lorenzon，g.，1994.amicrotiterplateassayfortotalglutathioneandglutathionedisulfidecontentsincultured/isolatedcells:performancestudyofanewminiaturizedprotocol.cellbinl.tnxicol.10，415-421.)描述的方法来测定。超氧化物歧化酶(sod)活性被超氧自由基在535nm处的nbt有氧还原为基础，被beauchamp和fridovich(beauchamp，c.，fridovich，i.，1971.superoxidedismutase:improvedassaysandanassayapplicabletoacrylamidegels.anal.biochem.44，276-287.)所描述。根据aebi(aebi，h.，1984.[13]catalaseinvitro.methodsenzymol.105，121-126.)所述，过氧化氢酶(cat)活性可被测定。以drotar等(drotar，a.，phelps，p.，fall，r.，1985.evidenceforglutathioneperoxidaseactivitiesinculturedplantcells.plantsci.42，35-40.)为例，测定了谷胱甘肽过氧化物酶(gpx)的活性。谷胱甘肽还原酶(gr)的活性可以由tanaka等人(tanaka，k.，sano，t.，ishizuka，k.，kitta，k.，kawamura，y.，1994.comparisonofpropertiesofleafandrootglutathionereductasesfromspinach.physiol.plant.91，353–358.)所描述的方法测定。根据habigetal.(habig，w.h.，pabst，m.j.，jakoby，w.b.，1974.glutathiones-transferasesthefirstenzymaticstepinmercapturicacidformation.j.biol.chem.249，7130–7139.)的方法，谷胱甘肽转硫酶(gst)活性被测定。根据bradford等（bradford，m.m.，1976.arapidandsensitivemethodforthequantitationofmicrogramquantitiesofproteinutilizingtheprincipleofprotein-dyebinding.analrinchem.72.248-254.）的方法，采用碧云天生物技术研究所的蛋白浓度测定试剂盒对蛋白浓度进行测定。所有的酶活性表达为u(单位)每毫克的可溶性蛋白。

基于大黄鱼基因组数据的基因组序列(wu，c，zhang，d.，kan，m.，lv，z.，zhu，a.，su，y.，zhou，d.，zhang，j.，zhang，z.，xu，m.，2014.thedraftgenomeofthelargeyellowcroakerrevealswell-developedinnateimmunity.nat.commun.5，5227.)，在实时荧光定量pcr仪(appliedbiosystemsprism7500sequencedetectionsystem)上进行了基因表达水平的测定，在此分析中使用的每一个基因的引物序列如图1所示。

1）缓冲液对nrf2的mrna基因相对表达水平的影响：

如图2中，在64μghgl^-1组中，实施例1（example1）与实施例2（example2）中的缓冲液对nrf2的mrna基因相对表达水平有一定影响，不同组分缓冲液提取下nrf2的mrna基因相对表达水平差异较小，但是缓冲液中添加（s）-4-苄基-2-唑烷酮（example2）后，其nrf2的mrna基因相对表达水平的误差范围较小，指示精确度更高。因此后续检测选用实施例2为样本。

2）汞对mda和gsh含量的影响：

在32μghgl^-1组中，mda含量在6-12小时内显著降低，在更长暴露时间内保持相对恒定；在64μghgl^-1组，mda含量在6-12小时内急剧降低，然后在曝光结束前（96小时）显著增加(图3a)。

在32μghgl^-1组，gsh含量在6-12小时先降低后显著升高，在更长的曝光时间内回归正常水平；在64μghgl^-1组中，gsh含量在12-48小时内显著增加，在曝光结束前急剧减少(图3b)。

3）汞对抗氧化酶活性的影响：

sod酶活性(图4a)、cat酶活性(图4b)、gr酶活性(图5d)和gst酶活性(图6)分别在32和64μghgl^-1组两相的模式指出，在暴露于hg中的早期阶段，所有经过测试的酶的活性均由增加的趋势，在恢复到控制水平或在暴露的后期阶段急剧下降。例如，在32μghgl^-1组，sod、cat和gst在暴露12-48小时，12-24小时，6-24小时和12-48小时均显著地增加，持续暴露则返回控制水平。gr在6-24小时显著增加，然后在96小时时显著下降。64μghgl^-1组，sod、cat和gr在6-24小时、6-24小时、6-12小时均显著增强，在96小时处显著降低。gst活力在6-12小时显著增强，然后返回至控制水平。

然而，gpx的酶活性基本没有变化(图5c)。

4）汞对抗氧化酶基因表达的影响：

cu/zn-sod(图7a)、gpx1a(图8d)、gpx1b(图9e)、gr(图9f)和nrf2(图10g)的mrna基因相对表达水平上表现出两相模式。在32μghgl^-1组，cu/zn-sod在24-48小时、gpx1a在12小时、gpx1b在12-48小时、gr在12-96小时和nrf2在12-48小时暴露后显著增加。在64μghgl^-1组，cu/zn-sod在6-48小时、gpx1a在6-24小时、gpx1b在6-24小时、gr在6-24小时和nrf2在6-48小时都显著提高。

在mn-sod(图7b)、cat(图8c)和keap1(图10h)的mrna基因相对表达水平上观察到了三相的模式。在32μghgl^-1组中，mn-sod的mrna基因相对表达水平分别在12小时、24小时和96小时出现了高峰；cat的mrna基因相对表达水平分别在6小时、24小时和96小时出现了高峰；keap1的mrna基因相对表达水平分别在6小时、48小时和96小时出现了高峰，keapl的mrna基因相对表达水平的最低峰值出现在12小时。64μghgl^-1组中，cat的mrna基因相对表达水平分别在12小时、24小时和96小时出现了高峰。

5）相关性分析：

mda含量和抗氧化酶活性之间的皮尔森关联系数显示：mda含量与sod活性(r=-0.520，p=0.000)，cat活性(r=-0.453，p=0.000)，gpx活性(r=-0.260，p=0.013)，gr活性(r=-0.597，p=0.000)和gst活性(r=-0.384，p=0.000)存在负相关。

酶活性与mrna基因水平之间、nrf2转录因子的mrna基因水平与nrf2转录因子的蛋白质含量之间的皮尔森关联系数在氧化应激方面的表现体现在图11中。在cat、gr的活性与基因表达水平之间具有正相关。在sod活性与cu/zn-sod基因表达、gpx活性与gpx1b基因表达之间同样看到了正相关。而在sod活性与mn-sod基因表达、gpx活性与gpx1a基因表达之间没有看到正相关。nrf2转录因子的mrna水平与cu/zn-sod、mn-sod、cat、gpx1a、gpx1b和gr的mrna水平之间存在正相关，而且，nrf2转录因子的表达与nrf2蛋白浓度存在较强的正相关性，因此nrf2的mrna丰度和及其蛋白含量可作为大黄鱼抗氧化反应的指示物。

本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。