一种基于数字微流控技术的掌上焦磷酸测序系统的制作方法

本发明属于数字微流控技术领域，具体为一种基于数字微流控技术的掌上焦磷酸测序系统。

背景技术：

自2003年人类基因组计划完成以来，dna测序技术已经取得了巨大的进步。由此发展而来的许多方法已经实现了商业化，并且具备迅速完成整个基因组测序的能力。现阶段，使用dna测序技术完成整个基因组测序工作已经变成生命科学研究中的“例行公事”。然而，随着dna测序的应用环境变得越来越多样化，期望任何单一测序平台满足所有的使用需求已经成为不可能的事情。因此，现阶段更多的是需要对平台进行定制从而满足各种应用程序的特定需求和使用环境。那么通量更低,更便宜,更便于进行即时快速测定的dna测序平台就成为了近期科研工作的热点。

微流控作为一种微纳流体处理技术在dna测序领域备受关注。其成本低、通量高、分析速度快、试剂消耗少的优势，对于提高dna测序的通量及降低处理成本具有重要意义，代表着未来dna测序走向微型化、集成化的发展方向。微流控芯片利用结构各异的微通道和形式多样的外加力场，对微量流体或样品在微观尺度上进行操纵、处理与控制，从而实现了dna测序的部分乃至全部功能在一块微芯片上的集成。然而，常规微流控芯片的局限性也是非常明显的：结构复杂，加工难度大；需要机械泵、阀配合使用，集成化难度大；对多试剂位置和反应时间的精确控制稍显无力。这一系列尚未解决的问题意味着用于dna测序的集成微流控芯片迄今难谈成熟。

数字微流控技术(digitalmicrofluidics,dmf)作为一种新兴的离散化微液滴操纵手段，由于具有一系列传统微流控技术无法比拟的优点有望改变这一现状。dmf是一种基于微电极阵列来实现离散液滴精确控制(包括移动、合并、分配和分裂等操作)的新型液滴操纵技术，其利用液滴在疏水化表面上的介电润湿现象实现了对微液滴的操控。通过外部电信号的控制，dmf可以驱动微液滴沿着预先设定好的路径运动，实现大通量离散化液滴的可控精准操纵。这种操纵方式具有高并行性和全自动化的特点，能够实现多通路实时可控反应，对于实现样品制备、反应、分离、检测等生化实验基本操作的完全集成化具有重要的意义，因此特别适用于高集成度、高性能、操作复杂的微生化分析系统。

在诸多测序体系中，焦磷酸测序是一种对在dna聚合反应中生成的无机焦磷酸盐(ppi)进行实时检测的方法，其通过观察每轮碱基配对的荧光强度即可以定量地确定一个特定的核苷酸是否添加到链，从而实现边合成边测序。焦磷酸测序本质上是一系列基于阵列的重复液体处理步骤，因此与基于电极阵列的dmf能快速、实时、自动化进行微液滴处理的特点非常匹配。

因此为了解决上述问题，我们提出了基于印制电路板(printedcircuitboard,pcb)的、以焦磷酸测序作为反应体系的全自动数字微流控掌上焦磷酸测序技术。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种基于数字微流控技术的掌上焦磷酸测序系统，可以实现焦磷酸测序的小型化。

实现本发明的技术方案为：一种基于数字微流控技术的掌上焦磷酸测序系统，包括数字微流控芯片(1)、集成电路(2)、电磁模块(3)和化学发光采集模块(4)；所述数字微流控芯片(1)和电磁模块(3)与集成电路(2)连接，化学发光采集模块(4)和电磁模块(3)分别位于数字微流控芯片上下两侧的同一直线上，集成电路(2)和化学发光采集模块(4)分别连接至计算机上；

所述数字微流控芯片(1)为双极板结构，包括一个下极板(11)、一个上极板(12)和间隙层(13)，上、下极板平行放置，上极板置于下极板上方并由具有固定高度的间隙层(13)分隔开来，形成间隙内含液滴的三明治结构；

所述下极板包括印制电路板(111)、介电层(112)和疏水层(113)，印制电路板(111)优选由电路板印刷技术直接生成，作为数字微流控芯片的下极板基底和电极层，介电层(112)均匀涂覆于印制电路板上表面，疏水层(113)在下极板的上表面；所述上极板从下至上依次包括疏水层(121)、接地导电层(122)和上极板基底(123)；

印制电路板(111)上具有一层通过快速打印形成的具有一定形状的铜(镀金)电极阵列作为电极层，电极层作为芯片结构的具体结构实现载体，可以根据需要形成单路、双路、多路甚至高通量的dna测序结构。典型的单路电极层包括八个贮液池电极单元(1111)、八组液滴生成通道电极阵列(1112)、液滴混合(信号生成)电极阵列区(1113)，八组液滴生成通道电极阵列(1112)分别与八个贮液池电极单元(1111)相连，并以液滴混合(信号生成)电极阵列区(1113)为中心对称分列于其两侧。

所述电磁模块(3)包括可控的磁性生成装置，用于数字微流控芯片所操纵液滴内磁珠的移动、混合和聚拢，所用磁铁材料是永磁铁、电磁铁中的一种；所用磁铁控制材料是pmma、3d打印材料中的一种。

所述化学发光采集模块(4)包括光圈，滤光片，光电倍增管，光电倍增管模块，操作暗箱；

当包含磁珠的液滴移动于对应位置并产生化学发光信号时，光信号依次通过光圈、滤光片后进入光电倍增管被检测，产生电信号经光电倍增管模块采集放大后输出并显示到计算机上。

为了保护电极表面、防止液滴的挥发，在间隙层中加入氟油(特别是fc-40)，同时起到促进液滴移动的作用。

依据电极通电顺序的不同，所述贮液池电极单元可以生成单电极大小液滴、1.5倍电极大小液滴和2倍电极大小液滴等不同尺寸的液滴，在不同高度的间隙层体系下，所生成液滴体积可实现从1ul至10ul的变化。

为了保证焦磷酸体系液滴的移动，在液滴中加入pluronic基于数字微流控技术的掌上焦磷酸测序系统f68用以防止生物黏附，加入浓度为0.01％-0.2％。

焦磷酸测序体系的多种试剂分别对应于数字微流控芯片上的贮液池电极单元，典型的单路数字微流控芯片上的贮液池电极单元具体为a、d、e、h-分别为含a、c、g、t四种核苷酸和aps底物的液滴；f-带有磁珠-待检测序列-测序引物复合物的液滴；b-包含atp硫酸化酶、荧光素酶和dna聚合酶的酶体系液滴；c-焦磷酸测序洗液；g-洗涤废液。

一种基于数字微流控技术的掌上焦磷酸测序系统，典型的单路数字微流控焦磷酸测序步骤如下：

步骤1、将带有磁珠的液体置于数字微流控芯片的贮液池电极单元内，转入步骤2；

步骤2、集成电路(2)的控制电路控制电极驱动电路，按一定次序进行电极的通断电控制，从而从贮液池电极单元产生一个液滴，通过与其连接的通道电极阵列将液滴移动至液滴混合(信号生成)电极阵列，转入步骤3；

步骤3、按照步骤2的操作分别生成含磁珠-待检测序列-测序引物复合物的液滴、包含atp硫酸化酶、荧光素酶和dna聚合酶的酶体系液滴和含a、c、g、t四种核苷酸中一种和aps底物的液滴，转入步骤4；

步骤4、将步骤3中生成的三个液滴在液滴混合(信号生成)电极阵列位置混合，使液滴完全混合均匀；

步骤5、在混合一分钟后，使用电磁模块将磁珠聚拢；

步骤6、使用光电倍增管实时检测光信号，并从计算机中显示出来；

步骤7、利用电磁模块使磁珠从液滴中分离出来，并使用焦磷酸测序洗液进行洗涤，直至该液滴无光信号输出，废液排至洗涤废液贮液池中；

步骤8、返回步骤2，如此循环，直至检测到化学发光信号才进入下一轮测序。

本发明与现有技术相比，其优势在于：

(1)内反应物的隔离可以防止反应产品的稀释，减少试剂消耗，实现快速流畅的交流；

(2)可以独立并行执行多个测序反应条件(如每个反应的核苷酸顺序)；

(3)包括dna聚合反应、atp生成反应和发光反应等在内的酶反应可以隔离成单独的液滴，使之在时间或空间上分离，以分别优化反应条件和反应动力学等；

(4)数字微流控可以实现对产生的离散微液滴更加直接和更大程度的时空控制，在全自动处理和完全集成化上具有先天上的优势。

数字微流控掌上焦磷酸测序系统是一种可以通过外部电路控制实现芯片上全自动微液滴焦磷酸测序的反应平台。与传统的焦磷酸测序技术相比，其反应成本可以忽略不计，反应时间大大缩短，反应速率大大提高，同时又无需复杂的操作技巧。因此，可以适用于中、低端测序需要的科研院所甚至是个人，其应用前景非常广阔。

附图说明

图1为本发明基于数字微流控技术的掌上焦磷酸测序系统的整体结构示意图。

图2为本发明基于数字微流控技术的焦磷酸测序芯片的结构示意图；其中(a)为其剖面结构示意图，(b)为单路数字微流控芯片平面结构示意图。

图3为本发明在图2的数字微流控芯片上实现焦磷酸测序的原理图，以典型的单路数字微流控芯片为例，其中a、d、e、h-分别为含a、c、g、t四种核苷酸和aps底物的液滴；f-带有磁珠-待检测序列-测序引物复合物的液滴；b-包含atp硫酸化酶、荧光素酶和dna聚合酶的酶体系液滴；c-焦磷酸测序洗液；g-洗涤废液；i、j、k分别为对应贮液池大液滴所生成的小液滴；l为i、j、k三液滴混合后所形成的反应液滴。

具体实施方式

下面结合附图以数字微流控芯片上单路dna焦磷酸测序为例，对本发明进行进一步细致描述。

如图1所示，一种基于数字微流控技术的掌上焦磷酸测序系统，包括数字微流控芯片(1)、集成电路(2)、电磁模块(3)和化学发光采集模块(4)；所述数字微流控芯片(1)和电磁模块(3)与集成电路(2)连接，化学发光采集模块(4)和电磁模块(3)分别位于数字微流控芯片上下两侧的同一直线上，集成电路(2)和化学发光采集模块(4)分别连接至计算机上。

如图2(a、b)所示，所述数字微流控芯片(1)为双极板结构，包括一个下极板(11)、一个上极板(12)和间隙层(13)，上、下极板平行放置，上极板置于下极板上方并由具有固定高度的间隙层(13)分隔开来，形成间隙内含液滴的三明治结构；

所述下极板包括印制电路板(111)、介电层(112)和疏水层(113)，印制电路板(111)由电路板印刷技术直接生成，作为数字微流控芯片的下极板基底和电极层，介电层(112)均匀涂覆于印制电路板上表面，疏水层(113)在下极板的上表面；所述上极板从下至上依次包括疏水层(121)、接地导电层(122)和上极板基底(123)；

印制电路板(111)上具有一层通过快速打印形成的具有一定形状的铜(镀金)电极阵列作为电极层，该电极层包括八个贮液池电极单元(1111)、八组液滴生成通道电极阵列(1112)、液滴混合(信号生成)电极阵列区(1113)，八组液滴生成通道电极阵列(1112)分别与八个贮液池电极单元(1111)相连，并以液滴混合(信号生成)电极阵列区(1113)为中心对称分列于其两侧。

本发明的数字微流控制作工艺如下：

下极板的制作：

(a)下极板基底采用电子工业pcb加工工艺制成，在基底上形成具有特定结构的沉金电极层；

(b)介电层材料为具有高介电常数、厚度均匀、抗击穿能力强的绝缘材料，如光刻胶、pdms、paralyene-c、si3n4等材料，一般通过旋涂或沉积的方式形成；

(c)疏水层材料一般为teflon，通过旋涂退火工艺形成。

上极板的制作：

(a)上极板基底为任意绝缘透明材料，如玻璃；

(b)接地导电层材料选择透光率高、可见性好的材料，如ito等，通过沉积形成；

(c)上极板疏水材料一般与下极板疏水材料一致，一般为teflon，通过旋涂退火工艺形成。

上下极板之间使用具有一定厚度的间隙层分隔开来，与其中的液滴形成三明治结构，液滴通过对应下极板贮液池电极上方的上极板位置开孔，通过自动进样引入。进样完成后，将数字微流控芯片进行油封，起到隔绝污染和促进液滴移动的作用。

然后通过集成电路(2)的控制电路控制电极驱动电路，按一定次序进行电极的通断电控制，从而从贮液池电极单元产生一个液滴，通过与其连接的通道电极阵列将液滴移动至液滴混合(信号生成)电极阵列。按照操作分别生成含磁珠-待检测序列-测序引物复合物的液滴、包含atp硫酸化酶、荧光素酶和dna聚合酶的酶体系液滴和含a、c、g、t四种核苷酸中一种和aps底物的液滴。将步骤3中生成的三个液滴在液滴混合(信号生成)电极阵列位置混合，使液滴完全混合均匀；在混合一分钟后，使用电磁模块将磁珠聚拢；使用光电倍增管实时检测光信号，并从计算机中显示出来；利用电磁模块使磁珠从液滴中分离出来，并使用焦磷酸测序洗液进行洗涤，直至该液滴无光信号输出，废液排至洗涤废液贮液池中；返回步骤2，如此循环，直至检测到化学发光信号才进入下一轮测序。

经实验验证，该测序过程洗涤效率高，反应时间短，每轮测序仅需3分钟，测序长度可以达到40-60个碱基，准确率高达100％，能够作为一种即时快速的掌上测序仪使用。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明白，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换、具体方式的选择等，均属于本发明的保护范围和公开范围之内。