一种稳定表达牛源TLR8受体基因的NF‑κB双荧光素酶报告细胞系及其构建方法与流程

本发明属于生物技术领域。具体涉及稳定表达牛源tlr8(btlr8)受体基因的nf-κb双荧光素酶报告细胞系及其构建方法。更具体地说，本发明提供能够用于研究btlr8活化激活下游nf-κb启动子报告基因检测的稳定细胞系。本发明也为rna-seq技术高通量筛选btlr8静默和活化状态下稳定细胞内差异表达基因提供了生物材料，并为进一步研究tlr8的种属特异性奠定了基础和平台。

背景技术：

toll样受体(toll-likereceptors,tlr)是最早发现的天然模式识别受体(patternrecognitionreceptors,prr)，人和鼠分别有10种和12种tlr^[1]。tlrs分子是i型跨膜糖蛋白受体，均由胞外区(ectodomainorextracellulardomain,ecd)，跨膜区(transmembrane,tm)和胞浆区(cytoplasmicdomain,cp)组成，其中，ecd包含20-26个lrr(leucinerichrepeats，亮氨酸重复序列)基序。通过tir结构域聚合，招募具有同源结构域的接头分子myd88，可以诱导两条途径的信号转导：一是通过nf-κb途径诱导促炎细胞因子的产生，如tnf-α，il-1β等；二是通过irf3/irf7途径诱导i型干扰素(ifn)的产生^[2,3]。

tlr8的ecd包含26个lrr基序，以及一个位于lrr14和lrr15之间的功能未知区域(z-loop)，有研究表明，特定tlr的z-loop序列在物种间高度保守，而在同一物种的不同tlr之间不保守^[4]。而由于tlr8主要在髓系细胞中分布，因此，tlr8主要诱导炎症细胞因子tnf-α，il-1β，il-6等的产生^[5,6]。tlr8与tlr7、tlr9具有高度的序列同源性，因此在配体识别上有一定的重叠^[7]。tlr7的配体imiquimod(r837)能够结合牛tlr8(btlr8)，刺激btlr8活化并激活一系列细胞信号通路及其末端的转录因子nf-κb(molimmunol.2009feb；46(5):978-90；molimmunol.2009feb；46(5):884-92)^[5,8]。而nf-κb在激活后发生核转位、可以结合到虫荧光素酶报告基因的启动子区域，激发虫荧光素酶报告基因的表达。虫荧光素酶报告基因的表达量也就是imiquimod(r837)的刺激指数能够较好反映btlr8和小分子r837的识别和结合。

家畜tlr8的研究内容匮乏，tlr8信号通路除申请人以前发表的研究外没有其它报道，有必要建立研究牛tlr8信号通路的细胞体系。

参考文献

1.kawait,akiras.theroleofpattern-recognitionreceptorsininnateimmunity:updateontoll-likereceptors.natureimmunology.2010；11(5):373-84.epub2010/04/21.doi:10.1038/ni.1863.pubmedpmid:20404851.

2.qianc,caox.regulationoftoll-likereceptorsignalingpathwaysininnateimmuneresponses.annalsofthenewyorkacademyofsciences.2013；1283:67-74.epub2012/11/21.doi:10.1111/j.1749-6632.2012.06786.x.pubmedpmid:23163321.

3.caox.self-regulationandcross-regulationofpattern-recognitionreceptorsignallinginhealthanddisease.natrevimmunol.2015；16(1):35-50.epub2015/12/30.doi:10.1038/nri.2015.8.pubmedpmid:26711677.

4.werlingd,jannoc,offordv,glassej,coffeytj.variationmatters:tlrstructureandspecies-specificpathogenrecognition.trendsinimmunology.2009；30(3):124-30.epub2009/02/13.doi:10.1016/j.it.2008.12.001.pubmedpmid:19211304.

5.zhuj,brownlier,liuq,babiukla,pottera,mutwirigk.characterizationofbovinetoll-likereceptor8:ligandspecificity,signalingessentialsitesanddimerization.molecularimmunology.2009；46(5):978-90.epub2008/11/11.doi:10.1016/j.molimm.2008.09.024.pubmedpmid:18995910.

6.makelasm,strengellm,pietilate,osterlundp,julkuneni.multiplesignalingpathwayscontributetosynergistictlrligand-dependentcytokinegeneexpressioninhumanmonocyte-derivedmacrophagesanddendriticcells.journalofleukocytebiology.2009；85(4):664-72.epub2009/01/24.doi:10.1189/jlb.0808503.pubmedpmid:19164128.

7.wangj,shaoy,bennettta,shankarra,wightmanpd,reddylg.thefunctionaleffectsofphysicalinteractionsamongtoll-likereceptors7,8,and9.jbiolchem.2006；281(49):37427-34.epub2006/10/17.doi:10.1074/jbc.m605311200.pubmedpmid:17040905.

8.zhuj,laik,browniler,babiukla,mutwirigk.porcinetlr8andtlr7arebothactivatedbyaselectivetlr7ligand,imiquimod.molecularimmunology.2008；45(11):3238-43.epub2008/04/29.doi:10.1016/j.molimm.2008.02.028.pubmedpmid:18439678.

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种稳定表达牛源tlr8受体(btlr8)基因的nf-κb双荧光素酶报告细胞系。

本发明建立在自主获得的btlr8基因、克隆的pcdna3.1(-)-btlr8真核表达质粒(molimmunol.2009feb；46(5):978-90；molimmunol.2009feb；46(5):884-92)和hek293-nf-κb双荧光素酶稳定报告细胞系的基础上，构建能够稳定表达牛源tlr8(btlr8)受体基因的nf-κb双荧光素酶报告稳定细胞系。该细胞系既可以用于筛选验证btlr8与小分子配体imiquimod(r837)的识别和结合，也可以用于后续rna-seq技术研究tlr8静默和活化状态下稳定细胞内差异表达基因。

本发明所采用的技术方案是：

一种稳定表达牛源tlr8受体(btlr8)基因的nf-κb双荧光素酶报告细胞系，是指转入了btlr8基因的hek293-nf-κb细胞，所述hek293-nf-κb细胞是引入了nf-κb虫荧光素酶和内参海肾荧光素酶的hek293细胞。

本发明所述的稳定表达牛源tlr8受体基因的nf-κb双荧光素酶报告细胞系的构建方法如下：

(1)hek293-nf-κb双荧光素酶稳定报告细胞的构建：

培养人胚肾细胞(hek293)至融合度70％-80％，利用表达nf-κb虫荧光素(fluc)的慢病毒感染hek293细胞，感染细胞用10μg/ml杀稻瘟菌素(blasticidin)筛选获得稳定表达nf-κb报告基因的hek293细胞系。两次有限稀释法亚克隆，细胞克隆用tnf-α刺激细胞6-8小时，筛选对tnf-α刺激诱导产生高水平nf-κb活化，高表达fluc的单细胞克隆。上述细胞克隆用质粒tk海肾荧光素酶(rluc)和pbabehygro共转染，细胞经100μg/ml的潮霉素b(hygromycinb)筛选后获得稳定表达细胞。细胞再经过有限稀释法亚克隆，单个细胞克隆用不同浓度tnf-α刺激，选取对tnf-α刺激具有高水平fluc应答同时稳定高表达rluc的细胞克隆。

(2)btlr8-hek293-nf-κb稳定表达细胞系的构建：

培养hek293-nf-κb双荧光素酶报告细胞至融合度70％-80％，利用脂质体转染试剂lipofectin2000将含有btlr8基因的表达质粒pcdna3.1(-)-btlr8转染入hek293-nf-κb细胞，经800μg/ml的g418筛选后获得表达btlr8基因的hek293-nf-κb细胞，经亚克隆、细胞刺激鉴定筛选及扩大培养、获得稳定表达btlr8基因的hek293-nf-κb双荧光素酶报告细胞系。

本发明公开了稳定表达牛源tlr8(btlr8)受体基因的nf-κb荧光素酶稳定报告细胞系的制备方法。在获得hek293-nf-κb稳定表达双荧光素酶报告细胞系基础上，转染btlr8基因的真核表达质粒，经过g418筛选获得稳定表达btlr8受体基因的nf-κb双荧光素酶报告稳定细胞系。该报告细胞系能对小分子配体r837和r848刺激做出特异性应答(图1-2)。btlr8稳定报告细胞系的构建为进一步研究btlr8的功能奠定了生物材料基础，有利于进一步丰富有关btlr8的研究。双荧光素酶报告稳定细胞系含有内参荧光素报告基因，可以校正和避免实验中由于细胞毒性等差异造成的误差，使结果更为可信。

附图说明

图1：双荧光素酶报告实验验证btlr8-293-nf-κb稳定细胞系对多种刺激剂的应答。

图2：双荧光素酶报告实验验证细胞亚克隆后的btlr8-293-nf-κb稳定细胞对刺激剂的应答。

具体实施方式

实施例1

(1)含btlr8基因的pcdna3.1(-)真核表达载体的构建(参见文献molimmunol.2009feb；46(5):978-90)：

以牛肠系膜淋巴结中提取总rna反转录获得的cdna为模板，利用特异性引物(上游引物：5′-ttcgcgctagccaccatgacccttcactttttgcttctgac-3′(seqidno.1),下游引物：5′-cgcgatatcgtattgcttaatggaattgacatacaag-3′(seqidno.2)；上游和下游引物分别带有nhei和ecorv酶切位点)扩增btlr8全长基因编码区，pcr产物纯化后利用限制性内切酶nhei和ecorv酶切，与同样酶切的带c-端ha标签的pcdna3.1(-)连接后，转化感受态dh5α细胞。转化细菌克隆提取质粒，质粒经酶切和测序鉴定正确后，获得含btlr8基因的pcdna3.1(-)真核表达载体。pcdna3.1(-)-btlr8带有c-端ha表达标签，转染hek293或cos-7细胞后，western-blotting实验用ha抗体可检测到130kd左右的特异蛋白条带。免疫荧光检查表达btlr8蛋白主要分布于转染细胞的内质网细胞器。

(2)hek293-nf-κb双荧光素酶稳定报告细胞的构建

培养人胚肾细胞(hek293)至融合度70％-80％，利用表达nf-κb虫荧光素(fluc)的慢病毒(g&pbiosciences，产品编号ltv-nfkb-luc)感染hek293细胞，感染细胞用10μg/ml杀稻瘟菌素(blasticidin,invivogen,货号ant-bl-05)筛选1-2周获得稳定表达nf-κb报告基因的hek293细胞系。两次有限稀释法亚克隆，细胞克隆用tnf-α(peprotech，产品编号300-01a)刺激细胞6-8小时，筛选对tnf-α刺激诱导产生高水平nf-κb活化、高表达fluc的单细胞克隆。上述细胞克隆用质粒ptkrluc(promega，产品编号e2241)和pbabehygro(addgene，产品编号#1765)按20：1的比例共转染，转染48小时后细胞经100μg/ml的潮霉素b(hygromycinb)筛选1-2周获得稳定表达细胞。细胞再经过有限稀释法亚克隆，单个细胞克隆用不同浓度tnf-α刺激(10-100ng/ml)，选取对tnf-α刺激具有高水平fluc应答同时稳定高表达rluc的细胞克隆；得hek293-nf-κb双荧光素酶报告细胞。

(3)btlr8-hek293-nf-κb稳定表达细胞系的构建及细胞刺激试验：

6孔细胞培养板中培养hek293-nf-κb双荧光素酶报告细胞至融合度70％-80％，利用脂质体转染试剂lipofectin2000将含有btlr8基因的表达质粒pcdna3.1(-)-btlr8转染入hek293-nf-κb细胞。转染48小时后，细胞用800μg/ml的g418筛选1-2周，不转染对照细胞全部死亡，而转染细胞有部分抗g418细胞生长，获得表达btlr8基因的hek293-nf-κb报告细胞。所获得的稳定报告细胞用下面各种刺激剂刺激验证btlr8特异性功能：pma(invivogen,货号：tlrl-pma)，imiquimod(r837)(invivogen,货号：tlrl-imqs)，r848(resiquimod)(invivogen,货号：tlrl-r848)，poly(i:c)(hmw)(invivogen,货号：tlrl-pic)，poly(i:c)(lmw)(invivogen,货号：tlrl-picw)，cpgdna(invivogen,货号：tlrl-2007)，mdp(invivogen,货号：tlrl-mdp)，ie-dap(invivogen,货号：tlrl-dap)，pam2csk4(invivogen,货号：tlrl-pm2s-1)，flagellinfromb.subtilis,fla-bs(invivogen,货号：tlrl-bsfla)，lps-b5(standard)(invivogen,货号：tlrl-b5lps)(图1)。上述经过验证的细胞进行有限稀释法亚克隆：细胞严格计数以1个细胞/孔分到96-孔细胞培养板，培养直到细胞孔中出现单细胞克隆。挑出单克隆细胞重新计数分孔，用tlr7/8刺激剂r837(invivogen,货号：tlrl-imqs)和r848(invivogen,货号：tlrl-r848)，以及tlr3刺激剂poly(i:c)(hmw)(invivogen,货号：tlrl-pic)，poly(i:c)(lmw)(invivogen,货号：tlrl-picw)过夜刺激并检测细胞活性。所有收集细胞用双荧光素酶报告基因检测试剂盒(transdetectdouble-luciferasereporterassaykit,transbiotech,货号，fr201-02)按照说明检测荧光素酶的表达量。鉴定筛选对r837和r848有良好应答细胞克隆进行扩大培养，最后获得稳定表达btlr8基因、对r837和r848有良好应答的hek293-nf-κb双荧光素酶报告细胞系(图2)。

sequencelisting

<110>扬州大学

<120>一种稳定表达牛源tlr8受体基因的nf-κb双荧光素酶报告细胞系及其构建方

法

<130>

<160>2

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>41

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ttcgcgctagccaccatgacccttcactttttgcttctgac41

<210>2

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

cgcgatatcgtattgcttaatggaattgacatacaag37