专利名称：快速检测非小细胞性肺癌表皮生长因子受体基因点突变方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域中的临床检测技术，具体涉及一种快速检测非小细胞性肺癌表皮生长因子受体基因点突变的方法。利用该基因检测方法不仅能够快速检测肺癌病人肿瘤组织DNA某些区域中的点突变，更重要的是可以预测治疗非小细胞性肺癌新药——吉非替林(Gefitinib)[商品名易瑞沙(Iressa)]对病人是否有疗效，指导临床用药，真正做到对症下药。
背景技术：
肺癌在中国是发病率最高的肿瘤，致病因素主要是吸烟。据医学统计有85％的男性肺癌和75％的女性肺癌是由吸烟造成的。而其它可造成肺癌发病的因素还包括一些与工业致癌物的接触，如石棉、砷、铀、镍、铬酸盐等以及室内空气被氡气及福尔马林(甲醛)污染等。
肺癌在组织学上分为4种类型鳞癌、腺癌、大细胞肺癌以及小细胞肺癌。这4种肺癌在临床上也可简单地归纳为非小细胞肺癌(前3种)和小细胞肺癌两种。从目前的医疗水平看，纯西医治疗效果总的来说，大约只有13％的肺癌病人(男性12％，女性16％)诊断后治疗存活5年及5年以上，而非小细胞肺癌病人的5年生存率大约为15％。据统计在肺癌病人中，大约有75％是非小细胞肺癌。
根据现代生物医学研究成果，表皮生长因子受体(EGFR)是一种受体酪氨酸激酶，表皮生长因子(EGF)与表皮生长因子受体(EGFR)结合导致受体自身磷酸化并激活其激酶活性，通过一系列由磷酸化传导的信号传递，形成激活细胞生存和分化的机制。在多种癌症包括非小细胞肺癌中，表皮生长因子受体(EGFR)及其它一些蛋白激酶异常活化或过高表达是这种机制的典型特征。
药物化疗法是目前治疗非小细胞肺癌的有效方法，但也只能延长病人的寿命，并不能根治，而且伴随着严重的副反应。吉非替林(Gefitinib)[商品名易瑞沙(Iressa)]是美国食品和药品管理局(FDA)批准的治疗对其它化疗不敏感非小细胞肺癌病人的新药。它是一种小分子化合物，其作用是特异性地结合在表皮生长因子受体(EGFR)的ATP结合区，并阻断表皮生长因子受体(EFGR)的激酶活性。不过在临床治疗中，大多数非小细胞肺癌患者对吉非替林(Gefitinib)并不敏感。为此，哈佛医学院附属医院的两个研究小组通过研究，最近同时发现在几乎所有对吉非替林治疗有反应的病人的肿瘤组织中，表皮生长因子受体(EGFR)基因含有特定的基因突变。这些突变都发生在表皮生长因子受体(EGFR)的第18，19，21外显子里(第18外显子点突变；第19外显子一段碱基缺失性删除突变；第21外显子点突变L858R；第21外显子点突变L861Q)，对应于蛋白的激酶活性区，特别是ATP结合部位，病人一般含有一个或多个突变。而在其他没有反应的病人肿瘤组织中该基因里则没有这些突变。研究表明这些突变在腺癌组织中的发生率有21％，其它形式的非小细胞肺癌只有2％。而在日本，26％的非小细胞性肺癌病人中有此类突变，比美国病人突变率高。更为显著的是，日本女性腺癌病人中有50％具以上表皮生长因子受体(EGFR)突变。可以推测中国非小细胞肺癌病人中的突变率将与日本人相似。
上述新发现可以改变吉非替林(Gefitinib)的使用方法，使该药品的使用更加科学有效，即检测该基因突变情况可以预测病人是否对肺癌新药吉非替林(Gefitinib)有反应。具体是利用基因检测的方法检测病人肿瘤组织DNA中这些区域中的突变可以预测吉非替林(Gefitinib)是否对病人有疗效，真正做到对症下药。
聚合酶链式反应(PCR)是一种广泛使用于基因检测的方法。利用PCR扩增上述表皮生长因子受体(EGFR)基因突变所在区片断，然后用测序可检查病人该基因是否有突变。但测序要分别测定表皮生长因子受体(EGFR)的第18，19，21三个外显子片段，这种测定需要进行三次，不仅费时，而且成本较高；另外，测序需要测序仪，这种仪器非常昂贵，一般单位无力配备。因此，这种方法在临床上难以推广应用。
发明内容
本发明目的是针对第18，21两个外显子片段，提供一种简便、快速的检测非小细胞性肺癌表皮生长因子受体基因点突变的方法，以指导医生对非小细胞性肺癌病人的临床用药。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是一种快速检测非小细胞性肺癌表皮生长因子受体基因点突变方法，包括下列步骤(1)、准备DNA①、从人体肺部采集病变组织；②、从病变组织中获取DNA；(2)、对DNA进行扩增利用PCR扩增方法，采用下列三组对应外显子DNA片段的至少一组四引物进行扩增第18外显子点突变DNA片段的四引物为内源有义 AACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCCGG；内源反义 GTGCCGAACGCACCGGAACA；外源有义 GTACATTTGTCCTTCCAAATGAGCTGGCAAGTGC；外源反义 CACTGGAGTTTCCCAAACACTCAGTGAAACAAAG；第21外显子L858R点突变DNA片段的四引物为内源有义 CAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGACT；内源反义 CGCACCCAGCAGTTTGGTCC；外源有义 CAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCC；外源反义 CAGGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGCC；第21外显子L861Q点突变DNA片段的四引物为内源有义 GATTTTGGGCTGGCCAAGCT；内源反义 TATTCTTTCTCTTCCGCACCCAACT；外源有义 CAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCC；外源反义 CAGGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGCC；具体步骤为①、将上述每组四引物分别与获取的DNA、4种碱基、含镁离子的缓冲液、耐热性DNA聚合酶、双重蒸馏水混合构成单独的反应体系；②、分别对各反应体系重复进行PCR循环，将DNA量扩增至凝胶电泳可观察即可；(3)、凝胶电泳采用凝胶电泳系统对上述DNA扩增后的体系做凝胶电泳；(4)、观测结果根据凝胶电泳对应泳带中所显示的条带数量和大小来判断对应外显子位置是否发生点突变以及突变类型，具体判断方法如下①、如果观察到某外显子泳带中出现三条DNA条带时，则判定有杂合子突变；②、如果观察到某外显子泳带中仅出现两条DNA条带时，则用较小条带的大小与下列对应组中特异性产物的理论值对比，根据接近程度来判断是纯合子突变或是正常特异性，三组特异性产物的理论值如下A、第18外显子点突变DNA片段的特异性产物理论值为
正常特异性产物大小198个碱基；突变特异性产物大小270个碱基；非特异性产物大小420个碱基；B、第21外显子L858R点突变DNA片段的特异性产物理论值为正常特异性产物大小118个碱基；突变特异性产物大小178个碱基；非特异性产物大小248个碱基；C、第21外显子L861Q点突变DNA片段的特异性产物理论值为正常特异性产物大小100个碱基；突变特异性产物大小192个碱基；非特异性产物大小248个碱基。
上述技术方案中的有关内容解释如下1、关于特异性DNA片段的PCR扩增PCR(polymerase chain reaction)扩增是一种体外扩增DNA片段的方法，即聚合酶链式反应方法。采用这种方法，在反应系统中只要有一个拷贝待扩增的DNA片段，在短时间内就能扩增出大量拷贝数的特异性DNA片段。该方法广泛应用于基因检测。
PCR扩增的基本原理是模仿细胞内发生的DNA复制过程，以DNA互补链聚合反应为基础，通过靶DNA变性、引物与模板DNA(待扩增DNA)一侧的互补序列复性杂交、耐热性DNA聚合酶催化引物延伸等过程的多次循环，产生待扩增的特异性DNA片段。一般反应过程是1、将反应体系加热至90～95℃，模板双链DNA变性成为两条单链DNA，作为互补链聚合反应的模板；2、降温至37～60℃，使两种引物分别与模板DNA链的3’一侧的互补序列杂交(复性)；3、升温至70～75℃，耐热性DNA聚合酶催化引物5’→3’方向延伸，合成模板DNA链的互补链。重复以上过程，就可以出现待扩增的特异性DNA片段。由于上一次循环合成的两条互补链均可作为下一次循环的模板DNA链，所以每循环一次，底物DNA的拷贝数增加一倍，因此PCR经过n次循环后，待扩增的特异性DNA片段基本上达到2n个拷贝数。
2、上述方案中，为了获得更好的PCR扩增效果，其PCR循环按以下条件进行
以上PCR循环次数较好的范围为25～45次。
3、上述方案中，凝胶电泳采用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳或2％琼脂糖凝胶电泳。
4、上述方案中，“L858R”表示第21外显子中所发生的一个突变，其中，L为突变前的亮氨酸；858为氨基酸在蛋白链中的位置，即突变所发生的位置；R为突变后的精氨酸。“L861Q”表示第21外显子中所发生的另一个突变，其中，L为突变前的亮氨酸；861为氨基酸在蛋白链中的位置，即突变所发生的位置；Q为突变后的谷氨酸胺。
本发明原理是三组四引物是设计用来检测第18外显子、第21外显子(L858R)和第21外显子(L861Q)中的已知位点的DNA点突变的一种简便方法。其中，内源有义引物是正常基因特异性的；内源反义引物是突变体特异性的。而外源有义引物和外源反义引物，则位于突变位点的上下游距离不等的地方。当基因含有突变时，内源反义引物与外源有义引物之间的片段被扩增出来。对正常基因来说，则内源有义引物与外源反义引物之间的片段被扩增出来。这两种不同的片断的大小不一样。而外源有义和外源反义引物之间的DNA总是要被扩增的，但不影响检测判断。此方法不需测序，只需要琼脂糖水平电泳仪就足够。不过，为了提高分辨率，建议使用聚丙烯酰胺凝胶电泳。因为人有22对常染色体，表皮生长因子受体(EGFR)基因位有常染色体上，因此表皮生长因子受体(EGFR)基因有两个拷贝(一个是父—染色体；一个是母—染色体)。以下结合
其工作原理和各种结果。
图1表示的是纯合子突变情况，即父—染色体和母—染色体这两个拷贝的EGFR基因都有突变。产物1是以上两个拷贝的外源有义与外源反义引物之间被扩增出来的DNA片段(是以上两个拷贝同时被扩增的重合)，该片段是非特异性产物，它们总是要被扩增出来的，但不影响检测判断。产物2是以上两个拷贝的外源有义与内源反义引物之间被扩增出来的DNA片段(是以上两个拷贝同时被扩增的重合)，是突变特异性产物，说明父—染色体和母—染色体这两个拷贝的EGFR基因都有突变，而以上两个拷贝的内源有义与外源反义引物之间没有被扩增出来，即没有正常特异性产物，因此属于纯合子突变。
图2表示的是杂合子突变情况，即父—染色体和母—染色体的两个拷贝中有一个拷贝的EGFR基因有突变，而另一个正常。产物1与图1中表示的完全相同，不重复描述。产物2是母—染色体拷贝中，外源有义与内源反义引物之间被扩增出来的DNA片段，是突变特异性产物，说明母—染色体拷贝的EGFR基因有突变。产物3是父—染色体拷贝中，内源有义与外源反义引物之间被扩增出来的DNA片段，是正常特异性产物，因此属于杂合子突变。这里值得注意的是产物2与产物3的大小是不一样的，这对将来判断纯合子突变和正常特异性具有意义(见发明内容中的纯合子突变或正常特异性判断原则)。
图3表示的是正常特异性，即父—染色体和母—染色体的两个拷贝中的EGFR基因都没有突变发生。产物1与图1中表示的完全相同，不重复描述。产物2没有，表示以上两个拷贝的EGFR基因都没有发生突变。产物3是以上两个拷贝的内源有义与外源反义引物之间被扩增出来的DNA片段(是以上两个拷贝同时被扩增的重合)，是正常特异性产物，因此属于正常特异性。
由以上原理可知，针对每个点突变本发明运用一组特殊设计的四种引物，利用PCR扩增后，通过凝胶电泳可直接观察到产物的三种情况之一，这三种情况分别对应纯合子突变、杂合子突变和正常特异性，因此可以通过产物的数量和大小来判断EGRF基因是否有点突变发生和突变的类型。对于每种情况，除了外源有义与外源反义引物之间的DNA总是要被扩增而外，每个拷贝只可能出现两种可能，一种是外源有义与内源反义引物之间的片段被扩增出来，表示对应的拷贝中含有突变，另一种是内源有义与外源反义引物之间的片段被扩增出来，表示对应的拷贝属于正常基因。上述三种情况是由父—染色体和母—染色体两个拷贝在四引物作用下组合产生的，当通过凝胶电泳观察到三条DNA条带时，根据图2所示，可以判定有杂合子突变；当观察到两条DNA条带时，则要根据较小条带的大小来判断是纯合子突变或是正常特异性。
已知肺癌EGFR基因突变包括外显子18中的点突变，外显子19中的在同一狭小区域的7种删除突变(deletion)(从9bp到24bp)，外显子21中的两种点突变。应用以上PCR四引物突变检测方法可以检测出外显子18，21中是否有已知的点突变。由于有以上点突变和删除突变的非小细胞性肺癌病人对吉非替林(Gefitinib)药物均有反应，因此本发明的应用可以预测治疗非小细胞性肺癌新药——吉非替林(Gefitinib)[商品名易瑞沙(Iressa)]对病人是否有疗效，指导临床用药，所以具有积极意义。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果1、本发明应用特殊设计的引物，利用该基因检测方法，在完成PCR反应和凝胶电泳后，可直接观察产物的数量和大小来判断病人有无与吉非替林(Gefitinib)[商品名易瑞沙(Iressa)]疗效有关的EGRF基因点突变，及时指导临床用药，真正做到对症下药。
2、本发明简单，不需测序。
3、本发明便宜，一般分子生物学实验室或检验室就可操作。
4、本发明灵敏度高，可以检测到测序漏诊的病例。
附图1为纯合子突变示意图；附图2为杂合子突变示意图；附图3为正常特异性示意图；附图4为外显子21(L858R)突变检查测序图谱，其中，上半部为病人DNA测序图谱，下半部为正常DNA测序对照图谱；附图5本发明实施例凝胶电泳图片；附图6为外显子21(L861Q)突变检查测序图谱，其中，上半部为病人DNA测序图谱，下半部为正常DNA测序对照图谱。
具体实施例方式
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述实施例一种快速检测非小细胞性肺癌表皮生长因子受体基因点突变方法，包括下列步骤第一步、肿瘤组织基因组DNA样品准备第一种新鲜组织或福尔马林处理后组织试剂准备缓冲溶液50mM Tris-HCl，pH8.020mM NaCl1mM EDTA1％ SDS10mg/ml蛋白酶K(Proteinase K)10mg Proteinase K溶于1mlddH2O。分装，-20℃保存。使用时，在4℃融化。(最好是现配现用)。
(1)、取微量组织(≤米粒的1/4)，加入20uL上述溶液中(可冷冻保存)，在加入1uL 10mg/ml蛋白酶K。
(2)、在55℃温育15分钟，Vortex，再温育15分钟。(可用PCR管在PCR机器上完成)。加双蒸水至200uL。
(3)、加热至95℃，保持10分钟，使蛋白酶K失活，降温至4℃或室温。
(4)、取1uL作为DNA模板。用于以下PCR反应。
第二种组织切片组织切片中含有石蜡。与方法1相比，只多了除蜡这一步，具体如下取40um大小的切片加入100ul0.5％Tween-20，加热至90度并保持10分钟，冷却至55度。
第二步、对DNA进行扩增利用PCR扩增方法，采用下列三组对应外显子DNA片段的后两组四引物进行扩增第18外显子点突变DNA片段的四引物为内源有义 AACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCCGG；内源反义 GTGCCGAACGCACCGGAACA；外源有义 GTACATTTGTCCTTCCAAATGAGCTGGCAAGTGC；外源反义 CACTGGAGTTTCCCAAACACTCAGTGAAACAAAG；第21外显子L858R点突变DNA片段的四引物为内源有义 CAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGACT；内源反义 CGCACCCAGCAGTTTGGTCC；外源有义 CAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCC；外源反义 CAGGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGCC；第21外显子L861Q点突变DNA片段的四引物为内源有义 GATTTTGGGCTGGCCAAGCT；内源反义 TATTCTTTCTCTTCCGCACCCAACT；外源有义 CAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCC；外源反义 CAGGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGCC；具体步骤为1、将上述每组四引物分别与获取的DNA、4种碱基、含镁离子的缓冲液、耐热性DNA聚合酶、双重蒸馏水混合构成单独的反应体系，具体见下表
2、分别对各反应体系重复进行PCR循环，将DNA量扩增至凝胶电泳可观察即可。PCR循环条件见下表
第三步、凝胶电泳采用凝胶电泳系统对上述DNA扩增后的体系做凝胶电泳，可采用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳或2％琼脂糖凝胶电泳。
第四步、观测结果图5为2％琼脂糖电泳图片，如采用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳，分辨率会更高。图5中，M泳带为标准DNA大小值对照，第5泳带为外显子21(L858R)的结果，第6泳带为外显子21(L861Q)结果，注意所有泳带中，条带的大小，自上而下，由大变小。
而理论上，外显子21(L858R)的大小分别为正常特异性产物大小为118个碱基；突变特异性产物大小为178个碱基；非特异性产物大小为248个碱基。
外显子21(L861Q)的大小分别为正常特异性产物大小100个碱基；突变特异性产物大小192个碱基；非特异性产物大小248个碱基。
从图片中可以看出，在第5泳带中，自上而下可以很清楚地看到非特异性产物、突变特异性产物和正常特异性产物三条DNA条带，则判定外显子21(L858R)泳带所对应EGFR基因的DNA片段有杂合子突变。而在第6泳带中，自上而下可以很清楚地看到两条DNA条带，其中，除了上方的非特异性产物条带外，下方的较小条带大小值与正常特异性产物的理论大小接近，由此可以判定外显子21(L861Q)泳带所对应EGFR基因的DNA片段属于正常特异性产物，没有发生突变。
比较例参见图4和图6，通过测序检查，此病人含有外显子21(L858R)突变，但没有L861Q突变。以上结果与测序结果完全一致，结果表明此病人是杂合子突变。
值得说明的是，在图4中的突变图谱并不明显，通常情况下，突变峰(黑)与正常峰(红)应该相同高度。这种情况是由于肿瘤标本中混入了正常组织。经克隆方法证实此病人确有该突变。在这种情况下，四引物法可以很清楚地检测出突变。这也说明采用本发明方法进行检测的正确性。
应用检测EGFR基因中的已知点突变方法，与检测删除突变的PCR方法相结合，可以同时检测已知删除突变和点突变。因为这些突变的有无，可以预测抗非小细胞肺癌新药，吉非替林或易瑞沙，对病人的疗效，所以此方法可以发展为试剂盒应用于临床检测，造福病人。
权利要求
1.一种快速检测非小细胞性肺癌表皮生长因子受体基因点突变方法，其特征在于包括下列步骤(1)、准备DNA①、从人体肺部采集病变组织；②、从病变组织中获取DNA；(2)、对DNA进行扩增利用PCR扩增方法，采用下列三组对应外显子DNA片段的至少一组四引物进行扩增第18外显子点突变DNA片段的四引物为内源有义AACTGAATTCAAAAAGATCAAAGTGCCGG；内源反义GTGCCGAACGCACCGGAACA；外源有义GTACATTTGTCCTTCCAAATGAGCTGGCAAGTGC；外源反义CACTGGAGTTTCCCAAACACTCAGTGAAACAAAG；第21外显子L858R点突变DNA片段的四引物为内源有义CAGCATGTCAAGATCACAGATTTTGGACT；内源反义CGCACCCAGCAGTTTGGTCC；外源有义CAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCC；外源反义CAGGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGCC；第21外显子L861Q点突变DNA片段的四引物为内源有义GATTTTGGGCTGGCCAAGCT；内源反义TATTCTTTCTCTTCCGCACCCAACT；外源有义CAGAGCTTCTTCCCATGATGATCTGTCC；外源反义CAGGAAAATGCTGGCTGACCTAAAGCC；具体步骤为①、将上述每组四引物分别与获取的DNA、4种碱基、含镁离子的缓冲液、耐热性DNA聚合酶、双重蒸馏水混合构成单独的反应体系；②、分别对各反应体系重复进行PCR循环，将DNA量扩增至凝胶电泳可观察即可；(3)、凝胶电泳采用凝胶电泳系统对上述DNA扩增后的体系做凝胶电泳；(4)、观测结果根据凝胶电泳对应泳带中所显示的条带数量和大小来判断对应外显子位置是否发生点突变以及突变类型，具体判断方法如下①、如果观察到某外显子泳带中出现三条DNA条带时，则判定有杂合子突变；②、如果观察到某外显子泳带中仅出现两条DNA条带时，则用较小条带的大小与下列对应组中特异性产物的理论值对比，根据接近程度来判断是纯合子突变或是正常特异性，三组特异性产物的理论值如下A、第18外显子点突变DNA片段的特异性产物理论值为正常特异性产物大小198个碱基；突变特异性产物大小270个碱基；B、第21外显子L858R点突变DNA片段的特异性产物理论值为正常特异性产物大小118个碱基；突变特异性产物大小178个碱基；C、第21外显子L861Q点突变DNA片段的特异性产物理论值为正常特异性产物大小100个碱基；突变特异性产物大小192个碱基。
2.根据权利要求1所述的快速检测非小细胞性肺癌表皮生长因子受体基因点突变方法，其特征在于上述PCR循环为
3.根据权利要求2所述的快速检测非小细胞性肺癌表皮生长因子受体基因点突变方法，其特征在于所述循环次数为35次。
4.根据权利要求1所述的快速检测非小细胞性肺癌表皮生长因子受体基因点突变方法，其特征在于上述凝胶电泳采用10％聚丙烯酰胺凝胶电泳或2％琼脂糖凝胶电泳。
全文摘要
一种快速检测非小细胞性肺癌表皮生长因子受体基因点突变方法，其特征在于包括下列步骤(1)准备DNA；(2)利用PCR方法采用三组特殊设计的四引物对DNA进行扩增；(3)凝胶电泳；(4)观测结果。本发明应用特殊设计的引物，利用该基因检测方法，在完成PCR反应和凝胶电泳后，可直接观察产物的数量和大小来判断病人有无与吉非替林(Gefitinib)[商品名易瑞沙(Iressa)]疗效有关的EGRF基因点突变，及时指导临床用药，真正做到对症下药。本发明的特点是1.简单，不需测序；便宜，一般分子生物学实验室或检验室就可操作；3.灵敏度高，可以检测到测序漏诊的病例。
文档编号C12Q1/68GK1661107SQ20041010322
公开日2005年8月31日 申请日期2004年12月30日 优先权日2004年12月30日
发明者王进, 朱辉, 秦正红 申请人:王进, 朱辉, 秦正红