本发明涉及生物工程技术领域。更具体地，涉及一种胶红酵母突变菌株及其应用。
背景技术：
海洋红酵母是指存在于海洋环境及海洋生物中的单细胞真核微生物，在南极、太平洋、印度西南海岸、深海火山、一些受污染海域等不同的海洋环境中，红酵母均为优势菌群；而胶红酵母是雷州半岛(南海)近岸海域的优势种群。海洋红酵母富含蛋白质、不饱和脂肪酸、类胡萝卜素、消化酶、维生素等，具有较高的营养价值和活性作用，可作为食品添加剂、功能生物饲料、抗氧化剂、着色剂等应用，亦是生产类胡萝卜素的主要菌种。
类胡萝卜素是一种橘黄色脂溶性化合物，已被fao和who等国际组织认定为a类营养色素，已在50多个国家和地区获准作为营养、着色双重功用的食品添加剂应用。类胡萝卜素也是一种抗氧化剂，进而防止老化和衰老引起的多种退化性疾病。由于机体内不能合成类胡萝卜素，必须由食物、饲料或添加剂提供。类胡萝卜素的工业化生产方法有化学合成法、动植物提取法或微生物发酵法。利用红酵母发酵法生产类胡萝卜素，由于生产周期短、成本低、工艺简单、发酵过程易控制、不受季节影响等优势而具有潜在应用价值和广阔开发前景。
但是，目前从自然界中直接筛选出的红酵母菌株的类胡萝卜素含量偏低，菌体生物量偏少，直接影响了其类胡萝卜素的产量，不适合直接开发应用和商业生产。故选育出高产类胡萝卜素的突变菌株并作为发酵生产类胡萝卜素的理想菌种是亟待解决的问题。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷和不足，提供一种胶红酵母突变菌株及其应用。所述突变菌株是用亚硝基胍和紫外线进行连续复合诱变的方法获得的，能高产类胡萝卜素，且具有容易培养、繁殖速度快、菌体生物量多、含有虾青素、消化酶和维生素等多种活性物质的优良性能，适宜于作为益生菌株及类胡萝卜素生产菌种开发应用，市场前景广阔。
本发明的目的是提供一株胶红酵母突变菌株。
本发明的第二个目的是提供上述胶红酵母突变菌株在生产类胡萝卜素中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种生产类胡萝卜素的方法，所述方法是用上述的胶红酵母突变菌株发酵来制备的。
本发明的第四个目的是提供上述胶红酵母突变菌株在制备动物生长促进剂、动物饲料添加剂或益生菌微生态制剂中的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明提供了一株可高产类胡萝卜素的胶红酵母(rhodotorulamuciladinosa)突变菌株，该突变菌株为胶红酵母zthy2，于2015年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号为cctccno：m2015296，保藏地址为：中国武汉，武汉大学。
该胶红酵母突变菌株的26srdnad1/d2区域的基因序列如seqidno.1所示。
进一步地，本发明提供了所述的胶红酵母突变菌株在制备类胡萝卜素中的应用。
更进一步地，本发明提供了一种生产类胡萝卜素的方法，该方法是将保藏号为cctccno：m2015296的胶红酵母zthy2(rhodotorulamuciladinosazthy2)接种到培养基中来发酵生产类胡萝卜素。
优选地，所述培养基为优化培养基，具体为液态发酵培养基，配方为：大豆蛋白胨1％～3％，酵母膏1％～3％，牛肉膏0.5％～1.5％，葡萄糖1％～3％，氯化钠1％～3％，硫酸锰0.05％～0.1％，以上均为质量比，ph值自然；
所述培养的条件为：培养温度为27～31℃，搅拌速度为130～150r/min，培养时间为60～72h。
更优选地，所述的液态发酵培养基，配方为：大豆蛋白胨2％，酵母膏2％，牛肉膏1％，葡萄糖2％，氯化钠2％，硫酸锰0.075％，以上均为质量比，ph值自然；
所述培养的条件为：培养温度为31℃，搅拌速度为150r/min，培养时间为72h。
更进一步地，本发明提供了上述的胶红酵母突变菌株在制备动物生长促进剂、动物饲料添加剂或益生菌微生态制剂中的应用。
本发明提供了上述的胶红酵母突变菌株在制备益生菌微生态制剂中的应用。
本文中的益生菌指的是对人和动植物有益的菌，由该益生菌生产的产品称为益生菌制品或微生态制剂，包括活菌体、死菌体、菌体成分及其代谢产物。所述益生菌微生态制剂具有调节肠道菌群平衡、拮抗病原菌、促进动物生长、提高饲料转化率和增强机体免疫功能等作用，具有提高动物生产性能、降低动物腹泻率等效果。
本发明还提供了上述的胶红酵母突变菌株或包含所述胶红酵母突变菌株的益生菌微生态制剂在制备动物饲料添加剂中的应用。
优选地，是应用于促进动物生长、提高动物生产性能方面。
更优选地，可以应用于提高猪或鸡的生产性能以及改善鸡蛋品质方面。
具体地，本发明中提高动物的生产性能指的是提高动物的平均日增重、降低料重比以及降低腹泻率等；改善鸡蛋品质指的是加深蛋壳和蛋黄色泽，并同时降低蛋黄中胆固醇的含量等。
优选地，所述的动物饲料添加剂的使用添加量为0.1％～10％，进一步优选为0.1％～1％，更进一步优选为0.1％～0.4％。
本发明公开的胶红酵母突变菌株或包含所述胶红酵母突变菌株的益生菌微生态制剂作为动物饲料添加剂，制备方法简单，没有特殊设备要求，添加量较少，可以直接加入动物的食品、药品、饲料或饮水中，添加过程方便快捷，具有很好的推广应用前景。
本发明经过动物饲养试验发现：
用胶红酵母突变菌株制备的动物生长促进剂可以使三黄鸡的平均日增重提高9.45％，料重比降低5.72％，腹泻率降低75.02％；可以改善鸡蛋品质，显著加深蛋壳和蛋黄色泽；并可以使蛋黄中胆固醇的含量降低。
用胶红酵母突变菌株制备的动物饲料添加剂可使断奶仔猪的平均日增重提高4.23％，料重比降低2.87％。
用胶红酵母突变菌株与乳酸乳球菌和解淀粉芽孢杆菌制成的益生菌微生态制剂，可使断奶仔猪的平均日增重提高8.57％，料重比降低5.75％，腹泻率降低87.63％；可使妊娠母猪分娩的死产、畸形、木乃伊和体弱仔猪的总数量减少45.45％，且出生仔猪的平均重增加8.13％；可使三黄鸡的平均重提高16.03％。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明利用复合诱变技术获得一株高产类胡萝卜素的胶红酵母突变菌株。该菌株经优化培养基27～31℃、130～150r/min搅拌培养60～72h，类胡萝卜素产量可达到39mg/l，是出发菌株的3.6倍；96h内可达到52mg/l。
2、本发明的胶红酵母突变菌株产生的虾青素、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、维生素b1、维生素b2和维生素b6的含量也比出发(野生)菌株明显提高。此外，该突变菌株还具有遗传性能稳定、无致病性、无毒副作用、容易培养、繁殖速度快、菌体生物量多等优点，明显优于从自然界中直接筛选到的胶红酵母野生菌株。
3、本发明的胶红酵母突变菌株能够提高畜禽的生产性能，改善鸡蛋品质，降低鸡蛋中胆固醇的含量；可以作为或制备动物生长促进剂、动物饲料添加剂或益生菌微生态制剂，广泛应用于畜禽养殖业和饲料业。
附图说明
图1为胶红酵母突变菌株的26srdnad1/d2区域的基因序列。
具体实施方式
以下结合附图及具体实施例来进一步说明本发明。以下实施例为本发明较佳的实施方式，但并不对本发明的保护范围做任何形式的限定。本发明主要阐述所述菌株以及基于所述菌株的应用思想，实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，都应包含在本发明范围内。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1高产类胡萝卜素胶红酵母突变菌株的诱变筛选
1、出发菌株复合诱变的致死率测定及诱变条件
(1)菌悬液制备：将出发菌株胶红酵母zt(该菌株是本申请的发明人徐春厚于2014年从雷州半岛近岸海域的红树叶中分离选育而得)接种于固体培养基(蛋白胨2％，酵母膏2％，牛肉膏1％，葡萄糖2％，氯化钠2％，琼脂2％，ph值自然)平板，28℃培养48h，用灭菌生理盐水刮下菌苔，4层纱布过滤，滤液即为出发菌株的菌悬液，调整其活菌数为1.3×107cfu/ml，然后进行后续的诱变处理。
(2)复合诱变方法：取9ml出发菌株的菌悬液，装入灭菌的三角瓶中，加入2.0mg/ml亚硝基胍溶液1ml，避光，35℃轻微振荡60min；向三角瓶中加入灭菌生理盐水90ml，混匀；取该混合菌悬液6ml，置于灭菌的平皿盖中，将平皿盖置于18w紫外线灯管的正下方，距离灯管20cm，用预热20min的紫外线灯管分别照射60s、90s、120s、150s、180s；将照射后的混合菌悬液置于4℃冰箱中，避光静置30min。
(3)诱变后致死率测定：将照射后的混合菌悬液用灭菌生理盐水作10倍梯度稀释，选取连续的三个稀释度，每个稀释度吸取0.1ml，涂布于固体培养基(同上)平板上，每个稀释度做3个平行，28℃培养48h，计数每个平板中的菌落数；根据3个平板中的平均菌落数及稀释倍数，计算出照射后的混合菌悬液活菌数。致死率(％)＝[1-照射后的混合菌悬液活菌数/出发菌株的菌悬液活菌数]×100％。
(4)复合诱变条件：出发菌株复合诱变的理想条件是：出发菌株的菌悬液活菌数为1.3×107cfu/ml，先用终浓度为200μg/ml的亚硝基胍溶液处理60min，再用18w紫外线灯管距离菌悬液表面20cm照射120s。
2、高产类胡萝卜素突变菌株的诱变与筛选
(1)以实施例1的复合诱变的理想条件对出发菌株的菌悬液进行复合诱变与选育，获得第一代突变菌株29株，其中正向突变菌株13株，占44.83％；类胡萝卜素产量最高的突变菌株比出发菌株提高了93.13％。
(2)以实施例1的复合诱变的理想条件对第一代诱变培养物进行复合诱变，获得第二代突变菌株37株，其中正向突变菌株23株，占62.16％；类胡萝卜素产量最高的突变菌株比第一代突变菌株提高了48.8％，比出发菌株提高了187.34％。
(3)以实施例1的复合诱变的理想条件对第二代诱变培养物进行复合诱变，获得第三代突变菌株33株，其中正向突变菌株25株，占75.76％；类胡萝卜素产量最高的突变菌株比第二代突变菌株提高了25.28％，比第一代突变菌株提高了86.42％，比出发菌株提高了260.01％。
综上，本发明出发菌株经亚硝基胍和紫外线连续复合诱变三次，选育出了高产类胡萝卜素的胶红酵母突变菌株，增加了出发菌株的遗传性变异和诱变效果，也使筛选的高产类胡萝卜素突变株能有良好的遗传稳定性。该突变菌株经优化培养基31℃、150r/min搅拌培养72h后，其菌体细胞内的类胡萝卜素含量为1.8mg/g，生物量为21.67g/l，类胡萝卜素产量可达到39mg/l，是出发菌株的3.6倍；发酵96h可达到52mg/l，具有良好的应用前景。
实施例2突变菌株的表型鉴定、基因序列测定
1、菌株表型鉴定
(1)菌落形态特征：突变菌株zthy2的菌落为深红色、圆形、隆起、边缘整齐、不透明、湿润、粘稠。
(2)菌体形态特征：突变菌株zthy2的菌体细胞形态为椭圆形。
(3)生理生化特性：突变菌株zthy2的脲酶试验和重氮基蓝b试验为阳性，对葡萄糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖、密二糖、棉籽糖、松三糖、菊糖不发酵，在25℃、30℃、35℃条件下生长。
2、基因序列测定
(1)突变菌株zthy2的26srdnad1/d2区域的基因序列如seqidno.1所示。
综上所述，经过对上述突变菌株zthy2的形态学特征、生理生化特性及26srdnad1/d2区域基因序列的鉴定及分析，鉴定该菌株属于胶红酵母(rhodotorulamucilaginosa)，命名为胶红酵母zthy2(rhodotorulamucilaginosazthy2)，并于2015年5月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号为cctccno：m2015296，保藏地址是中国武汉，武汉大学。
实施例3动物生长促进剂的制备
一种动物生长促进剂，是用胶红酵母突变菌株制备，其制备方法如下：
(1)取胶红酵母zthy2，活化后经31℃、150r/min发酵培养96h，即得动物生长促进剂；
其中，活化培养的培养基组分是：蛋白胨2％，酵母膏2％，牛肉膏1％，葡萄糖2％，氯化钠2％，以上均为质量比，ph值自然；
发酵培养的培养基组分是：大豆蛋白胨2％，酵母膏2％，牛肉膏1％，葡萄糖2％，氯化钠2％，硫酸锰0.075％，以上均为质量比，ph值自然；
(2)经测定，动物生长促进剂中胶红酵母的活菌数为3.6×1010cfu/ml，类胡萝卜素产量为52mg/l。
实施例4动物饲料添加剂的制备
一种用于畜禽的饲料添加剂，是用胶红酵母突变菌株制备，其制备方法如下：
(1)按实施例3制备动物生长促进剂；
(2)将上述动物生长促进剂与麸皮混合，二者重量比为1：10，40℃～50℃风干，粉碎，即得饲料添加剂，其中的胶红酵母活菌数为6.7×108cfu/g。
实施例5益生菌微生态制剂的制备
一种益生菌微生态制剂，是用胶红酵母突变菌株与乳酸乳球菌和解淀粉芽孢杆菌制备，其制备方法如下：
(1)按实施例4制备饲料添加剂；
(2)参考实施例4的方法按本领域常规技术制备乳酸乳球菌固体制剂和解淀粉芽孢杆菌固体制剂；
(3)将动物饲料添加剂30份、乳酸乳球菌固体制剂40份、解淀粉芽孢杆菌固体制剂30份混合均匀，即得益生菌微生态制剂，活菌总数约为1.86×109cfu/g。
实施例6动物生长促进剂对三黄鸡生产性能的影响
1、购买1日龄三黄鸡120只，随机分为4组，每组30只，自由采食和饮水，试验期56d。4个处理组分别为：
(1)对照组三黄鸡饲喂基础日粮，正常饮水；
(2)试验1组三黄鸡饲喂基础日粮，在饮水中添加0.1％动物生长促进剂；
(3)试验2组三黄鸡饲喂基础日粮，在饮水中添加0.2％动物生长促进剂；
(2)试验3组三黄鸡饲喂基础日粮，在饮水中添加0.4％动物生长促进剂。
2、试验结果如下：
(1)如表1所示，试验1组、试验2组和试验3组与对照组比较，每只鸡平均日增重分别提高5.44％、7.75％和9.45％；
(2)如表1所示，试验1组、试验2组和试验3组三黄鸡与对照组比较，料重比分别降低3.37％、4.04％和5.72％；
(3)如表1所示，试验1组、试验2组和试验3组三黄鸡与对照组比较，腹泻率分别降低49.96％、75.02％和75.02％；
本发明的动物生长促进剂具有促进三黄鸡生长、降低饲料用量和降低雏鸡腹泻的作用。
表1动物生长促进剂对三黄鸡生产性能的影响
实施例7动物生长促进剂对蛋鸡生产性能的影响
1、选用32只160日龄商品用蛋鸡，随机分为4组，每组8只，鸡笼内饲养，每个笼位装2只，试验期28d。这4个处理组，分别是：
(1)对照组蛋鸡饲喂基础日粮，正常饮水；
(2)试验1组蛋鸡饲喂基础日粮，在饮水中添加0.1％动物生长促进剂；
(3)试验2组蛋鸡饲喂基础日粮，在饮水中添加0.2％动物生长促进剂；
(2)试验3组蛋鸡饲喂基础日粮，在饮水中添加0.4％动物生长促进剂；
2、试验结果如下：
(1)如表2所示，试验2组、试验3组蛋鸡与对照组比较，平均蛋重分别增加了2.72％和3.12％；
(2)如表2所示，试验1组、试验2组和试验3组蛋鸡与对照组比较，蛋壳色泽和蛋黄色泽差异均显著，并随着动物生长促进剂添加量的增加而加深；
(3)如表2所示，试验1组、试验2组和试验3组蛋鸡与对照组比较，蛋壳硬度和蛋壳厚度相近；
(4)如表2所示，试验1组、试验2组和试验3组蛋鸡与对照组比较，蛋黄中胆固醇含量分别降低18.35％、18.37％和21.28％。
表2对蛋鸡生产性能的影响
实施例8动物饲料添加剂及益生菌微生态制剂对断奶仔猪生产性能的影响
1、选用90头28日龄的三元杂交断奶仔猪，随机分为3组，每组30头仔猪，公母各半，采用网上平养，试验期28d。这3个处理组，分别为：
(1)对照组仔猪饲喂基础日粮；
(2)试验1组仔猪饲喂添加有动物饲料添加剂的基础日粮，添加量为0.4％。
(3)试验2组仔猪饲喂添加有益生菌微生态制剂的基础日粮，添加量为0.4％。
2、试验结果如下：
(1)如表3所示，试验1组、试验2组的断奶仔猪与对照组比较，平均日增重分别提高了4.23％和8.57％，说明本发明的胶红酵母突变菌株有增重的效果，若与其它两株益生菌复配其增重效果更好。
(2)如表3所示，试验1组、试验2组的断奶仔猪与对照组比较，料重比分别降低了2.87％和5.75％，说明本发明具有降低料重比的作用，可提高饲料转化率。
表3对断奶仔猪生产性能的影响
实施例9益生菌微生态制剂对妊娠母猪生产性能的影响
1、选用36头妊娠时间基本相同的二元杂交母猪，分为3组，每组12头母猪；对照组母猪饲喂基础日粮；试验1组、试验2组母猪在分娩前一个月开始饲喂添加有益生菌微生态制剂的基础日粮，添加量分别为0.2％和0.4％。
2、试验结果表明，试验1组、试验1组与对照组比较，总产仔数基本相同，但死产、畸形、木乃伊仔猪和弱仔猪的总数量比对照组分别减少了31.82％和45.45％，同时出生仔猪平均重比对照组分别增加了6.52％和8.13％。
序列表
<110>广东海洋大学
<120>一种胶红酵母突变菌株及其应用
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>560
<212>dna
<213>胶红酵母突变菌株(rhodotorulamuciladinosazthy2)
<400>1
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