一种油茶粕多肽、制备方法及在牛精液冷冻保存方面的应用与流程

本发明属于畜牧领域，涉及一种油茶粕多肽、制备方法及在牛精液冷冻保存方面的应用。

背景技术：

小果油茶(camelliameiocarpahu.)是我国山茶属中栽培面积和年产量仅次于普通油茶(camelliaoleiferaabel.)的主栽物种，主要分布于我国淮河、长江以南的福建、江西、广西、湖南、贵州等地。小果油茶又名江西子、小茶、鸡心子、小叶油茶、羊屎子等。果小、叶小、芽小，芽、苞片没有毛是其显著特征。

小果油茶粕是小果油茶提取油脂后得到的副产品。虽然，目前已有茶场将这些油茶粕脱毒后用作动物饲料，但是，由于工艺不成熟，绝大部分油茶粕仍然是当废料扔掉，或者堆腐后用作茶场的肥料，利用度低，附加值低。为了提高小谷油茶粕的利用度，提高其经济附加值，申请人对茶粕进行了深度研究与开发。

目前，尚未见小果油茶粕的水解多肽深度开发的报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种油茶粕多肽、制备方法及在牛精液冷冻保存方面的应用，既充分利用油茶粕，又提供了一种牛精液冷冻保存添加剂。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

胰蛋白酶水解制备牛精液冷冻保存添加剂：

一种油茶粕多肽，以小果油茶粕为原料，经胰蛋白酶水解后，收集分子量在(5000u,3000u]范围内的肽段，冷冻干燥即得。

优选地，所述小果油茶粕指小果油茶的果实经过压榨处理或浸出法处理去除油脂后得到的固体残渣。

上述油茶粕多肽的制备方法，包括如下步骤：

步骤s1，将小果油茶粕粉碎至80-100目，加水浸泡，最后制成粕粉悬浮液；

步骤s2，加入胰蛋白酶酶解，酶解条件为：ph值，7.8-8.2；酶解温度，43-47℃；酶解时间，10-12小时；酶解结束后，加热使胰蛋白酶灭活，冷却至常温，静置取上清；

步骤s3，将上清液用脱脂棉过滤，收集滤液，冻干得粗品冻干粉；

步骤s4，粗品冻干粉用超纯水溶解，用不同截留分子量的超滤膜进行分离，收集分子量在(5000u,3000u]范围内的肽段，冷冻干燥即得。

优选地，所述不同截留分子量的超滤膜包括截留分子量分别为5000u、3000u的超滤膜。

优选地，还包括截留分子量10000u的超滤膜。

优选地，加热使胰蛋白酶灭活的方法为：90℃高温处理10分钟。

优选地，粕粉悬浮液优选130-170g/l。

优选地，所述胰蛋白酶的添加重量以粕粉重量计为2.5-3.5g/100g。

优选地，所述胰蛋白酶的酶解条件优选ph值8.0、温度45℃、时间11小时。

上述油茶粕多肽在牛精液冷冻保存方面的应用。

碱性蛋白酶水解制备促进乏情母牛发情和受胎的多肽：

一种油茶粕多肽，以小果油茶粕为原料，经碱性蛋白酶水解后，收集分子量在(5000u,3000u]范围内的肽段，冷冻干燥即得。

优选地，所述小果油茶粕指小果油茶的果实经过压榨处理或浸出法处理去除油脂后得到的固体残渣。

上述油茶粕多肽的制备方法，包括如下步骤：

步骤s1，将小果油茶粕粉碎至80-100目，加水浸泡，最后制成粕粉悬浮液；

步骤s2，加入碱性蛋白酶酶解，酶解条件为：ph值，8.3-8.7；酶解温度，53-57℃；酶解时间，9-11小时；酶解结束后，加热使碱性蛋白酶灭活，冷却至常温，静置取上清；

步骤s3，将上清液用脱脂棉过滤，收集滤液，冻干得粗品冻干粉；

步骤s4，粗品冻干粉用超纯水溶解，用不同截留分子量的超滤膜进行分离，收集分子量在(5000u,3000u]范围内的肽段，冷冻干燥即得。

优选地，所述不同截留分子量的超滤膜包括截留分子量分别为5000u、3000u的超滤膜。

优选地，还包括截留分子量10000u的超滤膜。

优选地，加热使碱性蛋白酶灭活的方法为：90℃高温处理10分钟。

优选地，粕粉悬浮液优选130-170g/l。

优选地，所述碱性蛋白酶的添加重量以粕粉重量计为2.5-3.5g/100g。

优选地，所述碱性蛋白酶的酶解条件优选ph值8.5、温度55℃、时间10小时。

上述油茶粕多肽在制备促进乏情母牛发情和受胎的饲料或药物方面的应用。

本发明的优点：

1、本发明发现，油茶粕的水解多肽具有多种活性，并且水解多肽的活性受油茶粕中蛋白水解位点影响：经胰蛋白酶水解产生的分子量为(5000u,3000u]的多肽具有提高牛冻存精液抗氧化能力的作用，可以作为牛精液冻存保护剂降低氧化损伤，而经碱性蛋白酶产生的多肽则不明显；经碱性蛋白酶水解产生的分子量为(5000u,3000u]的多肽可以促进乏情母牛发情和受胎，而经胰蛋白酶产生的多肽则不明显；

2、本发明水解多肽的制备方法简单，仅使用简单的粉碎、酶解、超滤、冻干即可，这些步骤都是可以在工厂中实现大生产化，易于实施；

3、本发明实现了小果油茶粕的废物再利用，可以提高小果油茶粕的经济附加值。

附图说明

图1为油茶粕多肽1-6的dsc曲线；

图2为油茶粕多肽对精液冻存后氧化产物mda含量的影响；

图3为油茶粕多肽对乏情母牛发情率和受胎率的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。

下述实施例中，以1982-1983年春定植在福建省闽侯桐口国有林场油茶种质资源收集圃的小果油茶(camelliameiocarpahu.)为原材料，经压榨工艺去除油脂得小果油茶粕，备用。

实施例1：胰蛋白酶制备油茶粕多肽1

包括如下步骤：

步骤s1，将小果油茶粕粉碎至80-100目，加水浸泡过夜，最后制成粕粉悬浮液，粕粉悬浮液的质量浓度为150g/l；

步骤s2，加入胰蛋白酶酶解(添加重量以粕粉重量计为3.0g/100g)，酶解条件为：ph值，8.0；酶解温度，45℃；酶解时间，11小时；酶解结束后，90℃高温处理10分钟使胰蛋白酶灭活，冷却至常温，静置取上清；

步骤s3，将上清液用脱脂棉过滤3次，收集合并滤液，冻干得粗品冻干粉；

步骤s4，粗品冻干粉用超纯水溶解，依次用截留分子量分别为10000u、5000u、3000u(也可以仅使用5000u、3000u，但增加10000u会利于提高后续超滤速度)的超滤膜进行分离，收集分子量在(5000u,3000u]范围内的肽段，冷冻干燥。

实施例2：胰蛋白酶制备油茶粕多肽2

包括如下步骤：

步骤s1，将小果油茶粕粉碎至80-100目，加水浸泡过夜，最后制成粕粉悬浮液，粕粉悬浮液的质量浓度为130g/l；

步骤s2，加入胰蛋白酶酶解(添加重量以粕粉重量计为2.5g/100g)，酶解条件为：ph值，7.8；酶解温度，43℃；酶解时间，12小时；酶解结束后，90℃高温处理10分钟使胰蛋白酶灭活，冷却至常温，静置取上清；

步骤s3，将上清液用脱脂棉过滤3次，收集合并滤液，冻干得粗品冻干粉；

步骤s4，粗品冻干粉用超纯水溶解，依次用截留分子量分别为10000u、5000u、3000u(也可以仅使用5000u、3000u，但增加10000u会利于提高后续超滤速度)的超滤膜进行分离，收集分子量在(5000u,3000u]范围内的肽段，冷冻干燥。

实施例3：胰蛋白酶制备油茶粕多肽3

包括如下步骤：

步骤s1，将小果油茶粕粉碎至80-100目，加水浸泡过夜，最后制成粕粉悬浮液，粕粉悬浮液的质量浓度为170g/l；

步骤s2，加入胰蛋白酶酶解(添加重量以粕粉重量计为3.5g/100g)，酶解条件为：ph值，8.2；酶解温度，47℃；酶解时间，10小时；酶解结束后，90℃高温处理10分钟使胰蛋白酶灭活，冷却至常温，静置取上清；

步骤s3，将上清液用脱脂棉过滤3次，收集合并滤液，冻干得粗品冻干粉；

步骤s4，粗品冻干粉用超纯水溶解，依次用截留分子量分别为10000u、5000u、3000u(也可以仅使用5000u、3000u，但增加10000u会利于提高后续超滤速度)的超滤膜进行分离，收集分子量在(5000u,3000u]范围内的肽段，冷冻干燥。

实施例4：碱性蛋白酶制备油茶粕多肽4

包括如下步骤：

步骤s1，将小果油茶粕粉碎至80-100目，加水浸泡过夜，最后制成粕粉悬浮液，粕粉悬浮液的质量浓度为150g/l；

步骤s2，加入碱性蛋白酶酶解(添加重量以粕粉重量计为3.0g/100g)，酶解条件为：ph值，8.5；酶解温度，55℃；酶解时间，10小时；酶解结束后，90℃高温处理10分钟使碱性蛋白酶灭活，冷却至常温，静置取上清；

步骤s3，将上清液用脱脂棉过滤3次，收集合并滤液，冻干得粗品冻干粉；

步骤s4，粗品冻干粉用超纯水溶解，依次用截留分子量分别为10000u、5000u、3000u(也可以仅使用5000u、3000u，但增加10000u会利于提高后续超滤速度)的超滤膜进行分离，收集分子量在(5000u,3000u]范围内的肽段，冷冻干燥。

实施例5：碱性蛋白酶制备油茶粕多肽5

包括如下步骤：

步骤s1，将小果油茶粕粉碎至80-100目，加水浸泡过夜，最后制成粕粉悬浮液，粕粉悬浮液的质量浓度为130g/l；

步骤s2，加入碱性蛋白酶酶解(添加重量以粕粉重量计为2.5g/100g)，酶解条件为：ph值，8.3；酶解温度，53℃；酶解时间，11小时；酶解结束后，90℃高温处理10分钟使碱性蛋白酶灭活，冷却至常温，静置取上清；

步骤s3，将上清液用脱脂棉过滤3次，收集合并滤液，冻干得粗品冻干粉；

步骤s4，粗品冻干粉用超纯水溶解，依次用截留分子量分别为10000u、5000u、3000u(也可以仅使用5000u、3000u，但增加10000u会利于提高后续超滤速度)的超滤膜进行分离，收集分子量在(5000u,3000u]范围内的肽段，冷冻干燥。

实施例6：碱性蛋白酶制备油茶粕多肽6

包括如下步骤：

步骤s1，将小果油茶粕粉碎至80-100目，加水浸泡过夜，最后制成粕粉悬浮液，粕粉悬浮液的质量浓度为170g/l；

步骤s2，加入碱性蛋白酶酶解(添加重量以粕粉重量计为3.5g/100g)，酶解条件为：ph值，8.7；酶解温度，57℃；酶解时间，9小时；酶解结束后，90℃高温处理10分钟使碱性蛋白酶灭活，冷却至常温，静置取上清；

步骤s3，将上清液用脱脂棉过滤3次，收集合并滤液，冻干得粗品冻干粉；

步骤s4，粗品冻干粉用超纯水溶解，依次用截留分子量分别为10000u、5000u、3000u(也可以仅使用5000u、3000u，但增加10000u会利于提高后续超滤速度)的超滤膜进行分离，收集分子量在(5000u,3000u]范围内的肽段，冷冻干燥。

分别测定上述油茶粕多肽1-6的dsc曲线，可见油茶粕多肽1-3的性质和成分一样，油茶粕多肽4-6的性质和成分一样，而油茶粕多肽1-3与油茶粕多肽4-6的性质和成分区别较大。油茶粕多肽1-6的dsc曲线如图1所示(netzschsta449c型同步热分析仪，样品质量5mg，测定温度范围30～900℃，氩气流速30ml/min，升温速度10℃/min)。

效果实施例1：油茶粕多肽对牛精液冷冻保存的抗氧化作用

一、实验材料

公牛品种为荷斯坦牛；公牛精液稀释液采用tcm-199。

丙二醛(mda)测试盒购于南京建成生物工程研究所。

分别精确称取实施例1-6制备的多肽1-6用无菌超纯水溶解，制成浓度5mg/ml的储备液。

二、实验方法

1、精液的采集和检查(采集和检查方法参考文献：注射口蹄疫疫苗对种公牛精液品质的影响研究，中国牛业科学，2014)

所用的器械事先要进行冲洗，消毒；玻璃器皿洗净后送入干燥箱干燥，假阴道和其他器械等用75％酒精棉球擦拭消毒，假阴道安装好套上保护套，消毒后的假阴道只能使用一次。假阴道内注水温度在40℃左右，注水量约在300ml，恒温箱内温度控制在40℃-42℃，采精时的内胎温度保持在38℃-40℃之间，内胎温度可根据不同的牛做适当的调整，最高不可超过43℃。润滑剂均匀涂抹在假阴道内胎的前2/3，润滑剂用白凡士林与液态石蜡油按1：1比例调制。假阴道的内胎压力(采精前从假阴道活塞孔打气)以假阴道口呈三角形为宜。台牛要健壮、性情温顺、无疫病，外阴、臀部清洗干净。公牛采精时采取引诱、被爬跨、反复空爬等方法刺激公牛兴奋。还可更换采精地点，更换台牛等方法增加种公牛的兴奋度。采精场地应保持安静，地面清洁并铺设防滑垫，以免公牛采精时滑倒。当公牛性欲旺盛时采精，采精员右手持假阴道，站在公牛右后方，当公牛起跳，前肢爬上台牛后迅速向前托着公牛包皮，右手持假阴道与台牛成40度夹角，假阴道口斜向下方，左右手配合将公牛阴茎自然地引入假阴道内，公牛向前一冲即完成射精动作，待公牛前肢落地，缓慢地把假阴道脱出。打开活塞放气，小心取下集精管，迅速转移至精液检测室进行检测。选取新鲜精液(应呈乳白稍带黄色或奶油色不透明液体)，取一滴原精液加盖玻片后在400倍的恒温(37℃)可视显微镜下观察呈直线运动精子的百分数，活率不低于80％的精液的精液用于精液冷冻。

按照上述方法，随机采集10头健康荷斯坦牛的精液。

2、精液稀释

将tcm-199稀释液放入37℃水浴锅中预热，加入多肽储备液混合制成浓度为10μg/ml的牛精液冷冻稀释液，然后将牛精液与该稀释液按照体积比1：4混合得到稀释精液。

对照组使用纯tcm-199稀释液对牛精液进行稀释。

3、精液冷冻与解冻

(1)精液冷冻。先将稀释精液装入0.25ml的细管中预冷，然后放入-5℃的冷柜中平衡2.5h。平衡结束后，将细管放入不严密的泡沫箱中，向泡沫箱中添加液氮，熏蒸细管30min，温度-120℃左右。最后将细管投入液氮中冷冻保存。

(2)解冻。将保存35d后的冻精细管取出，立即放入37℃水浴锅中解冻20s。

4、抗氧化能力测定

分别测定对照组和各多肽组解冻后精液中mda含量，该指标可以体现各组精液冷冻过程中的氧化程度以及各多肽的抗氧化效果。mda测定按照丙二醛测试盒说明书进行。

5、统计学方法

采用spss19.0软件统计分析，数据以均值±偏差表示，组间比较采用单因素方差分析。

三、实验结果

丙二醛(mda)是脂质氧化的终产物，mda的产生会加剧膜的损伤并具有细胞毒性。与对照组相比，油茶粕多肽1-3组mda含量显著降低，油茶粕多肽4-6组mda含量降低不明显，表明油茶粕多肽1-3可以显著抑制冻存对牛精液的氧化损伤。结果如表1和图2所示。

表1各组精液冻存后mda含量比较(n＝10)

效果实施例2：油茶粕多肽对乏情母牛发情、受胎作用影响

一、实验材料

母牛品种为西门塔尔牛。判断母牛乏情的标准：无生殖系统炎症及畸形，但产后3个月后仍然不出现发情、影响配种受胎的母牛为乏情母牛。

二、实验方法

1、实验分组和饲养

将月龄基本一致(3.5-4.0月之间)的乏情西门塔尔母牛随机分为对照组、油茶粕多肽1-6组，每组20头。对照组给予常规饲料喂养，油茶粕多肽1-6组在常规饲料中分别添加5g/kg的油茶粕多肽1-6。各组母牛连续喂养75天，观察75天内表现发情并接受配种及受胎情况。

2、统计学方法

采用spss19.0软件统计分析，数据以均值±偏差表示，组间比较采用单因素方差分析。

三、实验结果

1、油茶粕多肽对乏情母牛发情率的影响

与对照组相比，油茶粕多肽4-6组乏情母牛发情率显著提高，而油茶粕多肽1-3组不明显，表明油茶粕多肽4-6具有促进乏情母牛发情的作用。具体结果见表2和图3。

2、油茶粕多肽对乏情母牛受胎率的影响

与对照组相比，油茶粕多肽4-6组乏情母牛受胎率显著提高，而油茶粕多肽1-3组不明显，表明油茶粕多肽4-6具有促进乏情母牛受胎的作用。具体结果见表2和图3。

表2油茶粕多肽对乏情母牛发情率和受胎率的影响

综上可见，本发明油茶粕的水解多肽具有多种活性，并且水解多肽的活性受油茶粕中蛋白水解位点影响：经胰蛋白酶水解产生的分子量为(5000u,3000u]的多肽具有提高牛冻存精液抗氧化能力的作用，可以作为牛精液冻存保护剂降低氧化损伤，而经碱性蛋白酶产生的多肽则不明显；经碱性蛋白酶水解产生的分子量为(5000u,3000u]的多肽可以促进乏情母牛发情和受胎，而经胰蛋白酶产生的多肽则不明显。而且，本发明水解多肽的制备方法简单，仅使用简单的粉碎、酶解、超滤、冻干即可，这些步骤都是可以在工厂中实现大生产化，易于实施。本发明实现了小果油茶粕的废物再利用，可以提高小果油茶粕的经济附加值。

上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。