本发明属于植物化学
技术领域：
，具体涉及一种从泽泻中提取分离的具有药理活性的三萜类化合物及其方法和用途。
背景技术：
：泽泻为泽泻科植物泽泻alismaorientalis（sam.）juzep.的干燥块茎。泽泻在我国药用已有3000多年的历史。早在三千多年前的诗集《诗经》，其中“汾沮伽”第三段写道：“彼纷一曲，言釆其荬，彼其之子，美如玉。”据陆巩《诗疏》注解：“言釆其荬，荬，今泽泻也。其叶如车前草大，其味亦相似。徐州、广陵人食之。”现代学者祝敏彻、赵浚等著的《诗经译注》将“言釆其荬”译成现代汉语“我把泽泻釆进筐。”陈子展著的《诗经直译》，将它译成“就釆那里叫泽泻的荬。”以上古今学者的注解、译文，都认为荬就是泽泻。说明三千多年前妇女就采集泽泻叶食用。在食用过程中，发现它具有医疗作用，才被人们作为药物。我国最早的本草著作是《神农本草经》，它首先收载泽泻为药物，并列为上品。以后历代本草著作也都收载有泽泻，如魏晋南北朝时代的《名医别录》、《本草经集注》，唐代的《唐本草》，宋代的《本草图经》、《经史证类备用本草》、《本草衍义》、元代的《汤液本草》，明代的《本草品汇精要》、《本草纲目》、《本草乘雅半偈》、《本草蒙签》，清代的《本草真途》、《本经疏证》、《得配本草》、《本草从新》等。它们都是在《神农本草经》的基础上的充实、修正、完善，并使泽泻成为了常用的中药。泽泻具有利水渗湿的功效，现代医学研究表明，泽泻可降低血清总胆固醇及三酰甘油含量，减缓动脉粥样硬化形成；泽泻及其制剂，现代还用于治疗内耳眩晕症、血脂异常、遗精、脂肪肝及糖尿病等。现代药学研究证实，泽泻块茎含泽泻醇a、b、c、泽泻醇a单乙酸酯，泽泻醇b单乙酸酯，泽泻醇c单乙酸酯，表泽泻醇a，泽泻薁醇，泽泻薁醇氧化物，16β-甲氧基泽泻醇b单乙酸酯，16β-羟基泽泻醇b单乙酸酯，谷甾醇-3-o-硬脂酰基-β-d-吡喃葡萄糖甙等多种活性成分，同时还含胆碱、多糖，以及钾、钙、镁等元素。但目前对于泽泻药物的进一步研究，大部分都集中在对各种已知活性成分的提取、分离、纯化等方面，相关专利文献如：cn101724009a提供了一种泽泻三萜类化合物的提取纯化工艺，本发明通过对5种大孔吸附树脂的吸附和解吸特性的比较，筛选出吸附泽泻中三萜化合物的最佳树脂，即hpd-100型大孔吸附树脂。本发明分离工艺上样前采用50%乙醇溶解，使树脂的吸附量不降低，本发明披露了80%乙醇溶液基本能把泽泻三萜类化合物和23-乙酰泽泻醇b洗脱完全的结果，本发明工艺中的洗脱溶液浓度选择80%乙醇，因而本发明工艺基本能把泽泻三萜类化合物和23-乙酰泽泻醇b洗脱完全。本发明工艺综合考虑了泽泻三萜类化合物含量和23-乙酰泽泻醇b的含量两个指标，使提取纯化工艺更加合理，更加科学。cn102372759a提供了一种污染小、成本低的泽泻醇a的提纯方法，工艺方法是：泽泻药材粉碎，70-90%乙醇回流提取，提取液加入活性炭脱色回收乙醇后，浓缩液在60-80℃状态加入大孔树脂吸附，水醇梯度洗脱，浓缩得沉淀物，洗涤结晶，结晶物再经高速逆流色谱仪分离，选用庚烷一二氯甲烷-乙腈的溶剂系统，制得产品。采用本发明生产泽泻醇a，所得产品纯度高、收率高。cn102464694a公开了一种高效分离制备23-乙酰泽泻醇b的方法。以超临界co2流体萃取泽泻中的总甾醇提取物，然后采用高速逆流色谱对提取物进行进一步分离和纯化；最后采用重结晶的方法进行精制，得到高纯度的23-乙酰泽泻醇b。该方法步骤简单，效率高，易于重复，适用于工业化生产，分离制备的23-乙酰泽泻醇b纯度可达99%以上，可用于中药泽泻质控对照品及原料药。cn104497092a提供了一种从泽泻中提取23-乙酰泽泻醇c的方法，主要解决了现有技术中操作复杂，产品含量低，回收率低。该从泽泻中提取23-乙酰泽泻醇c的方法包括以下步骤：1]提取；2]膜分离；3]除杂；4]结晶。该从泽泻中提取23-乙酰泽泻醇c的方法采用碱水润湿，可将部分大极性的杂质分子除去；操作简单，产品含量高，回收率高，适合于工业化生产。由于植物来源的化合物对发现新药具有巨大的潜力，因此，本发明人在对泽泻活性成分进行研究时又发现并分离出了一种新的药用化合物，该化合物为三萜类化合物，具有一定的抗菌活性，尤其对金黄色葡萄球菌s.aureus有具有很好的抑制效果。可见，目前对于泽泻中所含的化学活性成分仍具有进一步研发和探讨的必要。技术实现要素：本发明的目的之一在于提供一种从泽泻中提取分离的三萜类化合物，通过从泽泻药材中提取分离得到具有药理活性的新的药用化合物，进一步发掘了泽泻新的药用作用，并为制备新型抗菌药物提供了很好的参考价值。本发明的目的之二在于提供一种从泽泻中提取分离三萜类化合物的方法，它是以泽泻干燥块茎为原料，经乙醇回流提取、乙酸乙酯萃取、硅胶柱色谱分离、c18反相色谱填料高压制备分离等步骤获得一种具有药理活性的新的药用化合物，该方法操作步骤简单易于控制，可确保三萜类化合物的提取率在60%以上，纯度达99%以上，且整个生产流程耗时短，适用于工业化生产。本发明的目的之三在于提供一种从泽泻中提取分离的三萜类化合物在制备抗菌药物中的应用，为制备新型抗菌药物提供可靠的依据。实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：一种从泽泻中提取分离的三萜类化合物，所述三萜类化合物具有（ⅰ）所示的结构式：所述三萜类化合物为从泽泻干燥的块茎中提取分离而得到，其化学名称为：(1s,3r)-1-((r)-3,3-dimethyloxiran-2-yl)-3-((5r,8s,9s,10s,11s,14r)-11-hydroxy-4,4,8,10,14-pentamethyl-3-oxo-2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,14-dodecahydro-1h-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl)butylacetate，自命名为：去氢23-乙酰泽泻醇b。所述三萜类化合物为白色粉末，10%硫酸乙醇显色剂显色呈紫红色。所述10%硫酸乙醇为通用显色剂，其配置方法是：浓硫酸与无水乙醇按体积比1:9，将浓硫酸倒入无水乙醇中混合均匀后，即为10%硫酸乙醇显色剂。所述三萜类化合物的分子量为512，分子式为c32h48o5。一种从泽泻中提取分离三萜类化合物的方法，包括以下工艺步骤：a．将泽泻干燥的块茎进行粉碎，用浓度为95wt%的乙醇加热回流提取，减压浓缩至无醇后，再将浓缩提取液加水进行分散处理得到水分散体；b．将水分散体用乙酸乙酯进行萃取，回收溶剂得乙酸乙酯萃取物及水相部分；c．将乙酸乙酯萃取物用甲醇完全溶解，然后以硅胶为载体，干燥后，湿法上样，用硅胶柱色谱分离，收集目标物层析液，减压浓缩干后，用乙酸乙酯溶解，过滤，加入石油醚后，放置结晶，得到结晶固体；d．将结晶固体用甲醇溶解，过滤，滤液用c18反相色谱填料高压制备分离，收集相对应的色谱峰，浓缩收集液至干得到白色粉末产物，即（ⅰ）所示结构式的三萜类化合物。在步骤a中，所述乙醇的用量为粉碎后的泽泻干燥块茎的8～10倍重量。在步骤a中，所述回流提取为3～5次，每次2小时。在步骤a中，所述浓缩提取液按体积比1:5～1:10倍加水进行分散处理。在步骤b中，所述水分散体用等体积乙酸乙酯萃取3～5次。在步骤c中，所述硅胶柱色谱分离：a：石油醚b：乙酸乙酯，a:b=5:1～2:1（v/v）为流动相。在步骤d中，所述c18反相色谱填料高压制备液相分离：a：甲醇b：水，a:b=85:15v/v为流动相；检测波长210nm。本发明得到的白色粉末产物，10%硫酸乙醇显色剂显色呈紫红色，即该化合物为三萜类化合物。在此基础上，进一步分析结果如下：（ⅰ）所示结构式的三萜类化合物的电喷雾电离质谱esi-ms显示：正离子535.12[m+na]+，1047.31[2m+na]+；负离子511.20[m-h]-，即该化合物分子量为512，分子式为c32h48o5。1h-nmr和13c-nmr数据见下表1。表1式（ⅰ）所示结构式的三萜类化合物核磁数据通过1h、13c-nmr以及dept135º和核磁二维hsqc，hmbc，h-hcosy，noesy等分析技术手段，确定了该化合物为：去氢23-乙酰泽泻醇b（三萜类化合物），结构式如（ⅰ）所示。经更深入的研究表明，所述三萜类化合物具有一定的抗菌活性，对金黄色葡萄球菌s.aureus有很好的抑制作用，可作为在制备抗菌药物中的应用。本发明的优点及有益效果在于：1、本发明提供的（ⅰ）所示结构式的三萜类化合物为从泽泻干燥的块茎中提取分离而得到，该化合物结构确定，药理活性明确，具有一定的抗菌活性，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌等具有一定的抑制作用。2、现代药理作用研究表明：三萜类化合物具有广泛的生理活性，具有溶血、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降低胆固醇、杀软体动物等活性。而本发明通过从泽泻药材中提取分离得到的三萜类化合物，为一种新的药用化合物，抗菌药理试验表明，它对耐药性金黄色葡萄球菌的抑制效果与广谱抗生素硫酸卡那霉素相当。由此进一步发掘了泽泻新的药用作用，对于制备新型抗菌药物具有很好的参考价值。3、本发明以泽泻干燥块茎为原料，采用乙醇回流提取、乙酸乙酯萃取、硅胶柱色谱分离、c18反相色谱填料高压制备分离等方式获得三萜类化合物，该化合物提取分离容易、易得，方法简单可控，且整个生产流程耗时短，适用于工业化生产。4、本发明不但首次报道了去氢23-乙酰泽泻醇b的结构，而且根据核磁二维等相关数据确定了其相对构型的新化合物，药理研究表明其对金黄色葡萄球菌具有很好的抑制效果，在研制新型抗菌药物方面，能够作为一种潜在化合物进行开发利用。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。但有必要在此指出的是以下实施例不能理解为对本发明保护范围的限制，如果该领域的技术人员根据上述本
发明内容作出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。实施例1一种从泽泻中提取分离的三萜类化合物，该化合物为白色粉末，10%硫酸乙醇显色剂显色呈紫红色，分子量为512，分子式为c32h48o5，具有（ⅰ）所示的结构式：所述三萜类化合物为从泽泻干燥的块茎中提取分离而得到，具体工艺步骤如下：a．将泽泻干燥的块茎进行粉碎，用浓度为95wt%的乙醇加热回流提取，减压浓缩至无醇后，再将浓缩提取液加水进行分散处理得到水分散体；b．将水分散体用乙酸乙酯进行萃取，回收溶剂得乙酸乙酯萃取物及水相部分；c．将乙酸乙酯萃取物用甲醇完全溶解，然后以硅胶为载体，干燥后，湿法上样，用硅胶柱色谱分离，收集目标物层析液，减压浓缩干后，用乙酸乙酯溶解，过滤，加入石油醚后，放置结晶，得到结晶固体；d．将结晶固体用甲醇溶解，过滤，滤液用c18反相色谱填料高压制备分离，收集相对应的色谱峰，浓缩收集液至干得到白色粉末产物，即（ⅰ）所示结构式的三萜类化合物。实施例2一种从泽泻中提取分离三萜类化合物的方法，具体工艺步骤如下：a．将泽泻干燥的块茎进行粉碎，用其重量8倍浓度为95wt%的乙醇加热回流提取3次，每次2小时，减压浓缩至无醇后，再将浓缩提取液按体积比1:5加水进行分散处理得到水分散体；b．将水分散体用等体积乙酸乙酯萃取3次，回收溶剂得乙酸乙酯萃取物及水相部分；c．将乙酸乙酯萃取物用甲醇完全溶解，然后以硅胶为载体，干燥后，湿法上样，用硅胶柱色谱分离（a：石油醚b：乙酸乙酯，a:b=5:1v/v为流动相），收集目标物层析液，减压浓缩干后，用乙酸乙酯溶解，过滤，加入石油醚后，放置结晶，得到结晶固体；d．将结晶固体用甲醇溶解，过滤，滤液用c18反相色谱填料高压制备分离（a：甲醇b：水，a:b=85:15v/v为流动相；检测波长210nm），收集相对应的色谱峰，浓缩收集液至干得到白色粉末产物，即（ⅰ）所示结构式的三萜类化合物。实施例3一种从泽泻中提取分离三萜类化合物的方法，具体工艺步骤如下：a．将泽泻干燥的块茎进行粉碎，用其重量10倍浓度为95wt%的乙醇加热回流提取5次，每次2小时，减压浓缩至无醇后，再将浓缩提取液按体积比1:8加水进行分散处理得到水分散体；b．将水分散体用等体积乙酸乙酯萃取5次，回收溶剂得乙酸乙酯萃取物及水相部分；c．将乙酸乙酯萃取物用甲醇完全溶解，然后以硅胶为载体，干燥后，湿法上样，用硅胶柱色谱分离（a：石油醚b：乙酸乙酯，a:b=2:1v/v为流动相），收集目标物层析液，减压浓缩干后，用乙酸乙酯溶解，过滤，加入石油醚后，放置结晶，得到结晶固体；d．将结晶固体用甲醇溶解，过滤，滤液用c18反相色谱填料高压制备分离（a：甲醇b：水，a:b=85:15v/v为流动相；检测波长210nm），收集相对应的色谱峰，浓缩收集液至干得到白色粉末产物，即（ⅰ）所示结构式的三萜类化合物。实施例4一种从泽泻中提取分离三萜类化合物的方法，具体工艺步骤如下：a．将泽泻干燥的块茎进行粉碎，用其重量9倍浓度为95wt%的乙醇加热回流提取4次，每次2小时，减压浓缩至无醇后，再将浓缩提取液按体积比1:10加水进行分散处理得到水分散体；b．将水分散体用等体积乙酸乙酯萃取4次，回收溶剂得乙酸乙酯萃取物及水相部分；c．将乙酸乙酯萃取物用甲醇完全溶解，然后以硅胶为载体，干燥后，湿法上样，用硅胶柱色谱分离（a：石油醚b：乙酸乙酯，a:b=3:1v/v为流动相），收集目标物层析液，减压浓缩干后，用乙酸乙酯溶解，过滤，加入石油醚后，放置结晶，得到结晶固体；d．将结晶固体用甲醇溶解，过滤，滤液用c18反相色谱填料高压制备分离（a：甲醇b：水，a:b=85:15v/v为流动相；检测波长210nm），收集相对应的色谱峰，浓缩收集液至干得到白色粉末产物，即（ⅰ）所示结构式的三萜类化合物。实施例5化合物的提取分离a.取泽泻干燥的块茎10kg，粉碎后用8倍重量浓度为95%的乙醇加热回流提取3次，每次2小时，减压浓缩至无醇后，得浓缩提取液3.5kg，将得到的浓缩提取液按体积比1:8倍加水进行分散处理；b.将水分散体依次用等体积乙酸乙酯萃取4次，回收溶剂得乙酸乙酯萃取物1000g及水相部分；c.将乙酸乙酯萃取物用800ml甲醇完全溶解，然后以硅胶为载体，干燥后，湿法上样，用硅胶柱色谱分离，a：石油醚b：乙酸乙酯，a:b=2:1v/v为流动相，收集目标物层析液，减压浓缩干后，用乙酸乙酯60ml溶解，过滤，加入300ml石油醚后，放置结晶，得到结晶固体3g；d.将结晶固体用甲醇溶解，过滤，滤液用c18反相色谱填料高压制备分离，a：甲醇b：水，a:b=85:15v/v为流动相；检测波长210nm，收集相对应的色谱峰，浓缩收集液至干得到（ⅰ）所示结构式的三萜类白色粉末化合物2.3g。整个生产流程用时约5天；通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱（rp-hplc）复检产品纯度，测得结果为99.15%。实施例6化合物的提取分离a.取干燥的泽泻块茎10kg，粉碎后用10倍重量浓度为95%的乙醇加热回流提取5次，每次2小时，减压浓缩至无醇后，得浓缩提取液4kg，将得到的浓缩提取液按体积比1:10倍加水进行分散处理；b.将水分散体依次用等体积乙酸乙酯萃取3次，回收溶剂得乙酸乙酯萃取物1200g及水相部分；c.将乙酸乙酯萃取物用1000ml甲醇完全溶解，然后以硅胶为载体，干燥后，湿法上样，用硅胶柱色谱分离，a：石油醚b：乙酸乙酯，a:b=5:1v/v为流动相，收集目标物层析液，减压浓缩干后，减压浓缩干后，用乙酸乙酯80ml溶解，过滤，加入400ml石油醚后，放置结晶，得到结晶固体4g；d.将结晶固体用甲醇溶解，过滤，滤液用c18反相色谱填料高压制备分离，a：甲醇b：水，a:b=85:15v/v为流动相；检测波长210nm，收集相对应的色谱峰，浓缩收集液至干得到（ⅰ）所示结构式的三萜类白色粉末化合物3g。整个生产流程用时约7天；通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱（rp-hplc）复检产品纯度，测得结果为99.45%。实施例7化合物的提取分离a.取干燥的泽泻块茎10kg，粉碎后用9倍重量浓度为95%的乙醇加热回流提取4次，每次2小时，减压浓缩至无醇后，得浓缩提取液3.2kg，将得到的浓缩提取液按体积比1:5倍加水进行分散处理；b.将水分散体依次用等体积乙酸乙酯萃取4次，回收溶剂得乙酸乙酯萃取物1100g及水相部分；c.将乙酸乙酯萃取物用900ml甲醇完全溶解，然后以硅胶为载体，干燥后，湿法上样，用硅胶柱色谱分离，a：石油醚b：乙酸乙酯，a:b=3:1v/v为流动相，收集目标物层析液，减压浓缩干后，减压浓缩干后，用乙酸乙酯70ml溶解，过滤，加入350ml石油醚后，放置结晶，得到结晶固体3.2g；d.将结晶固体用甲醇溶解，过滤，滤液用c18反相色谱填料高压制备分离，a：甲醇b：水，a:b=85:15v/v为流动相；检测波长210nm，收集相对应的色谱峰，得到（ⅰ）所示结构式的三萜类白色粉末化合物2.4g。整个生产流程用时约6天。通过更换流动相组分，利用反相分析型液相色谱（rp-hplc）复检产品纯度，测得结果为99.25%。实施例8化合物抗菌活性实验一、实验材料1.1药品上述实施例5～7提取分离得到（ⅰ）所示结构式的三萜类白色粉末化合物。1.2人体病原菌金黄色葡萄球菌（staphylococcusaureus）atcc51650由海南省药品检验所提供。1.3培养基牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（na）：牛肉膏5g，nacl7g，蛋白胨15g，定容至1000ml，ph为7.4～7.6。二、实验方法滤纸片琼脂扩散法测定化合物的抗菌活性；s.aureus采用na培养基。2.1将s.aureus制成一定浓度的菌悬液（105～107cfu/ml），取100μl用棉签均匀涂布于供试无菌平板，制成含菌平板。2.2将上述待测定的化合物配制成lmg/50μl溶液，取20μl分别滴加于灭菌滤纸片上（φ=6mm），待溶剂挥发干后将滤纸片贴于含菌平板上，每处理重复3次。2.3阳性对照液为硫酸卡那霉素0.08mg/ml（10/μl），37℃下培养，24h后观察结果，测量并记录抑菌圈直径。三、实验结果实施例5～7提取分离得到（ⅰ）所示结构式的三萜类白色粉末化合物、硫酸卡那霉素、甲醇（阴性对照），它们对于金黄色葡萄球菌s.aureus的抗菌活性结果详见表2。表2抗菌活性结果编号名称浓度（mg/μl）金黄色葡萄球菌抑菌圈直径（mm）1实施例51mg/50μl112实施例61mg/50μl133实施例71mg/50μl124硫酸卡那霉素1mg/50μl31～335甲醇1mg/50μl0实验结果表明，所述三萜类化合物对金黄色葡萄球菌s.aureus有一定的抑制作用，可作为在制备抗菌药物中的应用。当前第1页12