本发明涉及一种热稳定性提高的纳豆激酶，属于蛋白质工程领域。
背景技术：
纳豆激酶(nk,ec3.4.21.62)，是日本传统食品纳豆在发酵过程中由纳豆枯草杆菌(bacillusnatto)产生的一种丝氨酸蛋白酶，相较于市售溶栓药物，具有高效溶血栓作用，是最具潜力的纤溶蛋白酶。而对纳豆激酶热稳定性的研究鲜有报道。纳豆激酶热稳定性较差，纯酶液于55℃处理，半衰期仅为12min左右，严重限制其在工业生产中的应用。
为了促进纳豆激酶作为溶栓剂的开发与应用，急需一种能保证其在工艺生产高温环节中酶活不丧失，并延长其在机体内的作用时间的纳豆激酶。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种稳定性提高的纳豆激酶突变体，所述突变体是将氨基酸序列如seqidno.1所示的纳豆激酶的一个或两个氨基酸位点进行突变。
在本发明的一种实施方式中，其特征在于，所述突变体是将氨基酸序列为seqidno.1所示的纳豆激酶的第59位、第218位的一个或两个氨基酸位点进行突变。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列为seqidno.1所示的纳豆激酶的第218位的天冬酰胺进行突变为天冬氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列为seqidno.1所示的纳豆激酶的第59位的谷氨酰胺进行突变为谷氨酸，同时将第第218位的天冬酰胺进行突变为天冬氨酸。
本发明的第二个目的是提供一种表达纳豆激酶突变体的重组菌。
在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的构建方法为：将纳豆激酶突变体的基因连接在载体pet24a上，以大肠杆菌bl21位宿主，构建重组菌。
本发明的第三个目的是提供一种表达纳豆激酶突变体的方法，具体步骤如下：
(1)将重组菌接种于含卡那霉素的lb培养基，35-38℃、150-250r/min振荡过夜培养得到种子液。
(2)将种子液按质量分数为1-2％的接种量分别接种于含卡那霉素浓度的表达培养基中，35-38℃、150-250r/min振荡培养至od600至0.6-0.8时，加入诱导剂iptg，于15-18℃诱导18-24h纳豆激酶突变体的表达。
在本发明的一种实施方式中，所述卡那霉素的浓度为80-120μg/ml。
在本发明的一种实施方式中，所述诱导剂iptg至0.05-0.2mm。
在本发明的一种实施方式中，所述诱导剂iptg至0.1mm。
在本发明的一种实施方式中，所述表达培养基为tb培养基，所述tb培养基组分为：胰蛋白胨10-14g/l,酵母提取物20-26g/l，甘油3-8g/l，kh2po42.0-2.6g/l，k2hpo4·3h2o15.8-16.8g/l，cacl20.15-0.25g/l，余量为水。
在本发明的一种实施方式中，所述纳豆激酶的纯化过程：将重组菌体破碎后，收集上清，上清膜过滤后，在2-6℃下，用镍柱离心柱分离得到纳豆激酶突变体纯酶液。
本发明的有益效果：本发明提供的纳豆激酶突变体q59e-n218d和n218d的热稳定性大幅度提高，q59e-n218d在55℃下的半衰期由野生酶的11.9min延长至32.38min，n218d55℃下的半衰期由野生酶的11.9min延长至28min。因此，本发明提供的突变体能更好的应对工艺中高温加热环节，并可以延长在机体内的作用时间，提高了纳豆激酶的应用价值。
附图说明
图1野生酶(wt)和单突变体(q59e，n218d)，双突变体(q59e-n218d)的热稳定性曲线。于55℃下孵育，适时取样，分别测定其残留酶活。。
具体实施方式
lb培养基组分为：蛋白胨8-12g/l、酵母提取物4-6g/l、nacl8-12g/l
tb培养基组分为：胰蛋白胨10-14g/l,酵母提取物20-26g/l，甘油3-8g/l，kh2po42.0-2.6g/l，k2hpo4·3h2o15.8-16.8g/l，cacl20.15-0.25g/l
酶活的定义：在25℃，ph8.0,底物浓度为0.4mm，1min内，将1μmolaapf转化成1μmolpna所需的酶量定义为一个酶活力单位。
酶活测定方法：在100mmph8.0tris-hcl缓冲液(含0.1mmcacl2)，以人工合成的suc-aapf-pna为底物，在25℃下反应3min,根据405nm的吸收值测定生成对硝基苯胺(pna)浓度测定酶活。
热稳定性确定：将野生酶和q59e-n218d保存于55℃金属浴中，适时取样，测定其的残留酶活。
实施例1纳豆激酶单突变体的构建
(1)突变体q59e的构建
以pet24a-pro-nk为模版，以表1所示引物在表4所示条件下，pcr得到携带编码q59e突变体基因的重组载体，质粒命名为pet24a-pro-nk/q59e。
表1突变体q59e引物
pcr产物经过1.0％琼脂糖凝胶电泳分析鉴定；再将pcr产物用dna纯化试剂盒纯化，最后用quichcuttmdpni于37℃消化5h去除甲基化的模板质粒，转入bl21大肠杆菌宿主，重组菌命名为bl21/pet24a-pro-nk/q59e。
(2)突变体n218d的构建
以pet24a-pro-nk为模版，以表2所示引物在表4所示条件下，pcr得到携带编码n218d突变体基因的重组载体，质粒为pet24a-pro-nk/n218d。
表2突变体n218d引物
pcr产物经过1.0％琼脂糖凝胶电泳分析鉴定；再将pcr产物用dna纯化试剂盒纯化，最后用quichcuttmdpni于37℃消化5h去除甲基化的模板质粒，转入bl21大肠杆菌宿主，重组菌命名为bl21/pet24a-pro-nk/n218d。
实施例2纳豆激酶双突变体的构建
使用质粒小量提取试剂盒按照说明书上步骤提取pet24a-pro-nk/q59e质粒，再以pet24a-pro-nk/q59e为模板，以表3所示引物在表4所示条件下，pcr得到携带编码q59e-n218d双突变体基因的重组载体。
表3突变体q59e-n218d引物
表4全质粒pcr扩增反应体系
pcr扩增反应条件为：
pcr产物经过1.0％琼脂糖凝胶电泳分析鉴定；再将pcr产物用dna纯化试剂盒纯化，最后用quichcuttmdpni于37℃消化5h去除甲基化的模板质粒，转入bl21大肠杆菌宿主，重组菌命名为bl21/pet24a-pro-nk/q59e-n218d。
实施例3纳豆激酶单突变体和双突变体的表达
(1)将重组大肠杆菌bl21/pet24a-pro-nk/q59e-n218d、bl21/pet24a-pro-nk/q59e、bl21/pet24a-pro-nk/n218d，分别接种于5ml卡那霉素浓度为100μg/ml的lb培养基，37℃、200r/min振荡过夜培养得到种子液。
(2)将种子液按质量分数1％的接种量分别接种于含卡那霉素浓度为100μg/ml的100mltb表达培养基中，37℃、200r/min振荡培养至od600至0.6-0.8时，加入诱导剂iptg至0.1mm，18℃诱导20h收集菌体，5000g的转速离心收菌。
(3)将重组菌体溶于20ml结合缓冲溶液(50mmol/lna2hpo4、50mmol/lnah2po4、500mmol/lnacl、20mmol/limidazole)，超声破碎，13000g离心25min，上清用0.22μm滤膜过滤。用10倍柱体积的结合缓冲溶液平衡柱，用5倍柱体积的结合缓冲溶液洗去非特异性吸附的蛋白，分别用50和100mmol/l咪唑的洗脱缓冲液洗脱蛋白(重复洗脱)，收集样品并用sds-page分析鉴定。
实施例4纳豆激酶单突变体和双突变体的热稳定性分析
热稳定性确定：将野生酶、q59e、n218d、q59e-n218d保存于55℃金属浴中，适时取样，测定其残留酶活。如图1所示，发现野生酶半衰期为11.9min，在50min时完全失活，单突变q59e半衰期为4.8min，在30min时完全失活，而单突变n218d半衰期为28min，在50min时保留35％左右酶活，q59e-n218d在55℃下的半衰期为32.38min，在50min时完全失活还保留有40％左右的酶活，由此可见，双突变体q59e-n218d和单突变体n218d相对于野生酶的热稳定性有明显的提高。
实施例5纳豆激酶单突变体和双突变体的动力学分析
动力学常数的确定：以人工合成的四肽suc-aapf-pna为底物，底物浓度范围为5×10-5到10-3m,根据对硝基苯胺标准曲线，根据405nm的吸收值，从而计算出各底物浓度下的酶促反应速率，再通过软件graphpadprism5拟合得到km与vmax。
表5酶的动力学分析
由表5可知，单突变体n218d其热稳定性相较于野生型酶虽然大幅度提高，但其比酶活以及催化效率(kcat/km)相较于野生酶分别下降34％与40％左右；单突变体q59e其比酶活相较于野生酶提高了约53％，然而其热稳定性较差；双突变体q59e-n218d结合两者的综合性质，其比酶活与催化效率接近于野生型酶，且其热稳定性大幅度提高。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110>江南大学
<120>一种热稳定性提高的纳豆激酶
<160>2
<170>patentinversion3.3
<210>1
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<213>人工合成
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