本发明涉及一种微生物菌剂及其制备方法和应用，尤其涉及一种用于治理土壤污染的复合微生物菌剂及其制备方法和应用。
背景技术：
硝基苯类化合物广泛应用于农药、染料、炸药、橡胶以及其它化工产品的生产硝基苯类化合物用途广泛，可通过废水废气进入环境，也可因运输和生产过程中的意外事故和存贮器罐的不当处置，而大量进入环境，环境中的硝基苯类污染物主要包括硝基苯、硝基氯苯、硝基甲苯、硝基苯酚、硝基苯胺和硝基苯甲酸等，大部分硝基苯类化合物具有化学性质稳定、高毒性和易生物富集的特点，被列入美国国家环境保护局和我国的优先监测污染物名单中。
现有技术中，硝基苯类化合物污染的修复方法主要包括物理法、化学法和生物法；物理法主要是利用多孔树脂和活性炭等吸附污染物；化学法主要是利用氧化反应来消除污染物；生物法主要是利用人工驯化或构建的工程菌来降解污染物，最终使污染物矿化。与化学法和物理法相比，生物处理法的优点是费用低，不易造成二次污染，可最大程度地降低污染物的浓度，应用范围广。同时，含有硝基苯类化合物的土壤往往是多种污染物共存，利用微生物之间的协同作用和微生物对底物的共代谢效应，能够同时去除多种污染物，加快硝基化合物的降解。因此，随着生物强化技术和基因工程技术的广泛应用和发展，在防治硝基苯类化合物的环境污染方面，生物处理法具有广阔的应用前景。
但是现有技术中的复合微生物菌存在对硝基苯类化合物的处理效果较差，并且制备过程复杂，且菌体易流失，从而造成资源浪费。
技术实现要素：
发明目的：本发明的第一目的是提供一种复合微生物菌剂。
本发明的第二目的是提供该复合微生物菌剂的制备方法。
本发明的第三目的是提供该复合微生物菌剂的应用。
技术方案：为了实现上述发明目的，本发明提供了一种复合微生物菌剂，包括如下原料组分：日本假单胞菌培养物、睾丸酮丛毛单胞菌培养物、微杆菌培养物和德氏食酸菌培养物。
其中，日本假单胞菌培养物、睾丸酮丛毛单胞菌培养物、微杆菌培养物和德氏食酸菌培养物的比例为1:(2～3):(1.5～2.5):(3～4)。
优选地，所述日本假单胞菌培养物为日本假单胞菌atcc33616或atcc33660培养物；所述睾丸酮丛毛单胞菌培养物为atcc700441或atcc39523培养物；所述微杆菌培养物为atcc31001培养物；所述德氏食酸菌培养物为dsm50403或atcc49664培养物。
进一步地，复合微生物菌剂的原料组分还包括枯草芽孢杆菌培养物、固氮放线菌培养物、类球红细菌培养物和假丝酵母菌培养物。
其中，枯草芽孢杆菌培养物为枯草芽孢杆菌atcc21556培养物；固氮放线菌培养物为固氮放线菌atcc33255培养物；类球红细菌培养物为类球红细菌atcc49419、atcc17023、atcc33575培养物；假丝酵母菌培养物为假丝酵母菌cicc33050、nynu14772培养物。
优选地，日本假单胞菌培养物、睾丸酮丛毛单胞菌培养物、微杆菌培养物、德氏食酸菌培养物、枯草芽孢杆菌培养物、固氮放线菌培养物、类球红细菌培养物和假丝酵母菌培养物的比例为：1:(2～3):(1.5～2.5):(3～4):(2.5～3.5):(0.5～1):(1～1.5):(2～3)。
一种复合微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)采用混合培养基a对日本假单胞菌培养物、睾丸酮丛毛单胞菌培养物、微杆菌培养物和德氏食酸菌培养物按重量份进行混合培养得到混合培养物a；
(2)步骤(1)的混合培养物a中再加入硝基苯化合物，得到驯化后的混合培养物b；
(3)将步骤(2)得到的驯化后的混合培养物b和原料组分中枯草芽孢杆菌培养物、固氮放线菌培养物、类球红细菌培养物和假丝酵母菌培养物按照重量份分别接种到一级培养箱中，曝气培养获得一级菌液，再将一级菌液接种到二级培养箱中得到二级菌液；
(4)将步骤(3)得到的各菌种的二级菌液均匀混合，制成细菌悬浮液，控制有效活菌数≥1.5×1010个/g，得到所述复合微生物菌剂。
其中，步骤(1)中，各菌种培养物的获得方式为：将所述原料组分中的各菌种接种于斜面培养基中，分别扩大培养，得到各菌种的培养物；
优选地，各斜面培养基以及培养条件分别为：日本假单胞菌atcc33616或atcc33660培养物：营养肉汁琼脂培养基，ph6.8±0.2，培养温度：28℃；睾丸酮丛毛单胞菌atcc700441或atcc39523培养物：营养琼脂(na)，ph6.8±0.2，培养温度:30.0℃；微杆菌atcc31001培养物：营养肉汁琼脂，ph6.8±0.2，培养温度：37℃；德氏食酸菌dsm50403或atcc49664培养物：营养琼脂(na)，ph6.8±0.2，培养温度:30.0℃；枯草芽孢杆菌atcc21556培养物：营养琼脂(na)加1％马铃薯淀粉，ph6.8±0.2培养温度：37℃；固氮放线菌atcc33255培养物：麦芽膏粉130g/l、琼脂15g/l、氯霉素0.1g/l，ph6.0±0.2，培养温度:28.0℃；类球红细菌atcc49419、atcc17023、atcc33575培养物：范尼尔酵母琼脂培养基，ph7.0±0.2，培养温度:24.0℃；假丝酵母菌cicc33050、nynu14772培养物：ycm培养基，培养温度：25℃。
步骤(1)中，所述混合培养基a包含如下组分浓度的组分：胰蛋白胨8～12g/l、大豆胨10～20g/l、牛肉浸取物2～5g/l、h3bo32～5g/l、nah2po4·h2o2～4g/l、nacl5～8g/l、琼脂10～20g/l和mncl2·4h2o0.2～0.3g/l，ph值为6.5～6.8。
优选地，步骤(2)中，所述驯化的步骤为将处在对数生长期的混合培养物a的培养基中添加硝基苯化合物，分别在2～3天、4～6天和7～9天时传代培养，使菌密度达到4×106～5×106个/ml，菌存活率≥85％。
进一步地，步骤(3)中，接种到一级培养箱中，曝气培养获得一级菌液，再将一级菌液接种到二级培养箱中的具体步骤为：按培养基的2～4％的接种量接种到5～8l的培养箱中，温度为20～25℃，溶液ph中性，曝气培养40h，再将5～8l一级菌液转接到二级培养箱中，得到二级菌液20～30l；其中，培养基组分为：玉米粉10g/l、葡萄糖5g/l、豆饼粉10g/l、鱼粉7g/l、caco37g/l、(nh4)2so410g/l、k2hpo40.4g/l、mgso4.7h2o0.3g/l和mnso4·h2o0.2g/l。
优选地，步骤(4)中，细菌悬浮液的制备方法：用5.0ml吸管吸取3.0ml～5.0ml稀释液加入各菌种培养物的培养基内，反复吹吸，洗下菌苔；随后，用5.0ml吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混合若干秒或在手掌上振敲若干次，以使各菌种培养物悬浮均匀制得混合菌培养物悬浮液。
本发明内容还包括一种复合微生物菌剂在治理土壤污染中的应用。
进一步地，复合微生物菌剂在治理土壤污染中的应用为该复合微生物菌剂在治理受硝基苯化合物污染的土壤中的应用。
有益效果：与现有技术相比，本发明通过对多种细菌培养物混合发酵制成复合微生物菌剂，对土壤中的因杀虫剂或农药而形成的有机物残留如硝基苯化合物具有有效的降解作用，同时特殊菌种的混合培养及多菌种混合发酵提供了一种简单易行的制备方法。
具体实施方式
下面对本发明的技术方案作详细的说明，如无特殊说明，下列原料均可从市售获得。
实施例1
原料组分：日本假单胞菌atcc33616培养物、睾丸酮丛毛单胞菌atcc700441培养物、微杆菌atcc31001培养物和德氏食酸菌dsm50403培养物的比例为1:2:1.5:3。
制备及应用：(1)采用混合培养基a对日本假单胞菌培养物、睾丸酮丛毛单胞菌培养物、微杆菌培养物和德氏食酸菌培养物按重量份进行混合培养得到混合培养物a，混合培养基a包含如下组分浓度的组分：胰蛋白胨8g/l、大豆胨10g/l、牛肉浸取物2g/l、h3bo32g/l、nah2po4·h2o2g/l、nacl5g/l、琼脂10g/l和mncl2.4h2o0.2g/l，ph值为6.5；
(2)步骤(1)的混合培养物a中再加入硝基苯化合物，得到驯化后的混合培养物b，驯化的步骤为将处在混合培养物a的培养基中添加硝基苯化合物，分别在2天、4天和7天时传代培养，使菌密度达到4×106个/ml，菌存活率85％。
(3)将步骤(2)得到的驯化后的混合培养物b接种到一级培养箱中，曝气培养获得一级菌液，再将一级菌液接种到二级培养箱中。
(4)将步骤(3)得到的发酵液均匀混合，制成细菌悬浮液，控制有效活菌数1.5×1010个/g，得到所述复合微生物菌剂。
实施例2
原料组分：日本假单胞菌atcc33660培养物、睾丸酮丛毛单胞菌atcc39523培养物、微杆菌atcc31001培养物和德氏食酸菌atcc49664培养物的比例为1:2.5:2:3.5。
制备及应用：(1)采用混合培养基a对日本假单胞菌培养物、睾丸酮丛毛单胞菌培养物、微杆菌培养物和德氏食酸菌培养物按重量份进行混合培养得到混合培养物a，混合培养基a包含如下组分浓度的组分：胰蛋白胨10g/l、大豆胨15g/l、牛肉浸取物3g/l、h3bo34g/l、nah2po4·h2o3g/l、nacl7g/l、琼脂15g/l和mncl2.4h2o0.25g/l，ph值为6.7；
(2)步骤(1)的混合培养物a中再加入硝基苯化合物，得到驯化后的混合培养物b，驯化的步骤为将处在混合培养物a的培养基中添加硝基苯化合物，分别在3天、5天和8天时传代培养，使菌密度达到4.5×106个/ml，菌存活率90％；
(3)将步骤(2)得到的驯化后的混合培养物b接种到一级培养箱中，曝气培养获得一级菌液，再将一级菌液接种到二级培养箱中；
(4)将步骤(3)得到的发酵液均匀混合，制成细菌悬浮液，控制有效活菌数为2×1010个/g，得到所述复合微生物菌剂。
实施例3
原料组分：日本假单胞菌atcc33660培养物、睾丸酮丛毛单胞菌atcc39523培养物、微杆菌atcc31001培养物和德氏食酸菌atcc49664培养物的比例为1:3:2.5:4。
制备及应用：(1)采用混合培养基a对日本假单胞菌培养物、睾丸酮丛毛单胞菌培养物、微杆菌培养物和德氏食酸菌培养物按重量份进行混合培养得到混合培养物a，混合培养基a包含如下组分浓度的组分：胰蛋白胨12g/l、大豆胨20g/l、牛肉浸取物5g/l、h3bo35g/l、nah2po4·h2o4g/l、nacl8g/l、琼脂20g/l和mncl2.4h2o0.3g/l，ph值为6.8；
(2)步骤(1)的混合培养物a中再加入硝基苯化合物，得到驯化后的混合培养物b，驯化的步骤为将处在混合培养物a的培养基中添加硝基苯化合物，分别在3天、6天和9天时传代培养，使菌密度达到5×106个/ml，菌存活率90％；
(3)将步骤(2)得到的驯化后的混合培养物b接种到一级培养箱中，曝气培养获得一级菌液，再将一级菌液接种到二级培养箱中；
(4)将步骤(3)得到的发酵液均匀混合，制成细菌悬浮液，控制有效活菌数2.0×1010个/g，得到所述复合微生物菌剂。
实施例4
原料组分：日本假单胞菌atcc33660培养物、睾丸酮丛毛单胞菌atcc39523培养物、微杆菌atcc31001培养物、德氏食酸菌atcc49664培养物、枯草芽孢杆菌atcc21556培养物、固氮放线菌atcc33255培养物、类球红细菌atcc49419培养物和假丝酵母菌cicc33050培养物的比例为：1:2:1.5:3:2.5:0.5:1:2。
制备及应用：(1)采用混合培养基a对日本假单胞菌培养物、睾丸酮丛毛单胞菌培养物、微杆菌培养物和德氏食酸菌培养物按重量份进行混合培养得到混合培养物a，混合培养基a包含如下组分浓度的组分：胰蛋白胨8g/l、大豆胨10g/l、牛肉浸取物2g/l、h3bo32g/l、nah2po4·h2o2g/l、nacl5g/l、琼脂10g/l和mncl2.4h2o0.2g/l，ph值为6.5；
(2)步骤(1)的混合培养物a中再加入硝基苯化合物，得到驯化后的混合培养物b，驯化的步骤为将处在混合培养物a的培养基中添加硝基苯化合物，分别在2天、4天和7天时传代培养，使菌密度达到4×106个/ml，菌存活率为85％；
(3)将步骤(2)得到的驯化后的混合培养物b和原料组分中枯草芽孢杆菌培养物、固氮放线菌培养物、类球红细菌培养物和假丝酵母菌培养物按照重量份分别接种到一级培养箱中，曝气培养获得一级菌液，再将一级菌液接种到二级培养箱中得到二级菌液；
(4)将步骤(3)得到的发酵液均匀混合，制成细菌悬浮液，控制有效活菌数为1.5×1010个/g，得到所述复合微生物菌剂。
实施例5
原料组分：日本假单胞菌atcc33616培养物、睾丸酮丛毛单胞菌atcc700441培养物、微杆菌atcc31001培养物、德氏食酸菌dsm50403培养物、枯草芽孢杆菌atcc21556培养物、固氮放线菌atcc33255培养物、类球红细菌atcc17023培养物和假丝酵母菌nynu14772培养物的比例为：1:2.5:2:3.5:3:0.75:1.25:2.5。
制备及应用：(1)采用混合培养基a对日本假单胞菌培养物、睾丸酮丛毛单胞菌培养物、微杆菌培养物和德氏食酸菌培养物按重量份进行混合培养得到混合培养物a，混合培养基a包含如下组分浓度的组分：胰蛋白胨10g/l、大豆胨15g/l、牛肉浸取物4g/l、h3bo33g/l、nah2po4·h2o3g/l、nacl7g/l、琼脂15g/l和mncl2.4h2o0.25g/l，ph值为6.7；
(2)步骤(1)的混合培养物a中再加入硝基苯化合物，得到驯化后的混合培养物b，驯化的步骤为将处在混合培养物a的培养基中添加硝基苯化合物，分别在2天、5天和8天时传代培养，使菌密度达到4.5×106个/ml，菌存活率为90％；
(3)将步骤(2)得到的驯化后的混合培养物b和原料组分中枯草芽孢杆菌培养物、固氮放线菌培养物、类球红细菌培养物和假丝酵母菌培养物按照重量份分别接种到一级培养箱中，曝气培养获得一级菌液，再将一级菌液接种到二级培养箱中得到二级菌液；
(4)将步骤(3)得到的发酵液均匀混合，制成细菌悬浮液，控制有效活菌数2.0×1010个/g，得到所述复合微生物菌剂。
实施例6
原料组分：日本假单胞菌atcc33616培养物、睾丸酮丛毛单胞菌atcc700441培养物、微杆菌atcc31001培养物、德氏食酸菌dsm50403培养物、枯草芽孢杆菌atcc21556培养物、固氮放线菌atcc33255培养物、类球红细菌atcc33575培养物和假丝酵母菌nynu14772培养物的比例为：1:3:2.5:4:3.5:1:1.5:3。
制备及应用：(1)采用混合培养基a对日本假单胞菌培养物、睾丸酮丛毛单胞菌培养物、微杆菌培养物和德氏食酸菌培养物按重量份进行混合培养得到混合培养物a，混合培养基a包含如下组分浓度的组分：胰蛋白胨12g/l、大豆胨20g/l、牛肉浸取物5g/l、h3bo35g/l、nah2po4·h2o4g/l、nacl8g/l、琼脂20g/l和mncl2.4h2o0.3g/l，ph值为6.8；
(2)步骤(1)的混合培养物a中再加入硝基苯化合物，得到驯化后的混合培养物b，驯化的步骤为将处在混合培养物a的培养基中添加硝基苯化合物，分别在3天、6天和9天时传代培养，使菌密度达到5×106个/ml，菌存活率93％；
(3)将步骤(2)得到的驯化后的混合培养物b和原料组分中枯草芽孢杆菌培养物、固氮放线菌培养物、类球红细菌培养物和假丝酵母菌培养物按照重量份分别接种到一级培养箱中，曝气培养获得一级菌液，再将一级菌液接种到二级培养箱中得到二级菌液；
(4)将步骤(3)得到的发酵液均匀混合，制成细菌悬浮液，控制有效活菌数2.5×1010个/g，得到所述复合微生物菌剂。
对比例1
原料组分：枯草芽孢杆菌atcc21556培养物、固氮放线菌atcc33255培养物、类球红细菌atcc33575培养物和假丝酵母菌nynu14772培养物的比例为3.5:1:1.5:3。
制备及应用：其他具体步骤与实施条件与实施例6相同。
对比例2
原料组分：睾丸酮丛毛单胞菌atcc700441培养物、微杆菌atcc31001培养物、德氏食酸菌dsm50403培养物、枯草芽孢杆菌atcc21556培养物、固氮放线菌atcc33255培养物、类球红细菌atcc33575培养物和假丝酵母菌nynu14772培养物的比例为3:2.5:4:3.5:1:1.5:3。(缺少日本假单胞菌培养物)
制备及应用：其他具体步骤与实施条件与实施例6相同。
对比例3
原料组分：日本假单胞菌atcc33616培养物、微杆菌atcc31001培养物、德氏食酸菌dsm50403培养物、枯草芽孢杆菌atcc21556培养物、固氮放线菌atcc33255培养物、类球红细菌atcc33575培养物和假丝酵母菌nynu14772培养物的比例为：1：2.5:4:3.5:1:1.5:3。(缺少睾丸酮丛毛单胞菌培养物)
制备及应用：其他具体步骤与实施条件与实施例6相同。
对比例4
原料组分：日本假单胞菌atcc33616培养物、睾丸酮丛毛单胞菌atcc700441培养物、德氏食酸菌dsm50403培养物、枯草芽孢杆菌atcc21556培养物、固氮放线菌atcc33255培养物、类球红细菌atcc33575培养物和假丝酵母菌nynu14772培养物的比例为：1:3:4:3.5:1:1.5:3。(缺少微杆菌培养物)
制备及应用：其他具体步骤与实施条件与实施例6相同。
对比例5
原料组分：日本假单胞菌atcc33616培养物、睾丸酮丛毛单胞菌atcc700441培养物、微杆菌atcc31001培养物、枯草芽孢杆菌atcc21556培养物、固氮放线菌atcc33255培养物、类球红细菌atcc33575培养物和假丝酵母菌nynu14772培养物的比例为：1:3:2.5:3.5:1:1.5:3。(缺少德氏食酸菌培养物)
制备及应用：其他具体步骤与实施条件与实施例6相同。
使用上述实施例1～6以及对比例1～5中的复合微生物菌剂对受硝基苯化合物污染的土壤中的污染物进行处理，通过对土壤中的硝基苯化合物进行检测，结果如表1：
表1不同原料组分的复合微生物菌剂对受污染土壤中硝基苯化合物降解率的影响
由表1可知，对比例1说明仅有枯草芽孢杆菌培养物、固氮放线菌培养物、类球红细菌培养物和假丝酵母菌培养物对受污染土壤硝基苯化合物作用时，作用较小，约为9.54％；对比例2～5说明当作用于土壤的复合微生物菌剂分别缺少日本假单胞菌培养物、睾丸酮丛毛单胞菌培养物、微杆菌培养物或德氏食酸菌培养物时，污染物硝基苯化合物的降解率不超过40.57％；实施例1～3说明仅有枯草芽孢杆菌培养物、固氮放线菌培养物、类球红细菌培养物和假丝酵母菌培养物共同作用于受污染土壤时，对硝基苯化合物能够起到良好的降解作用，超过72.44％；尤其的，实施例4～6中当日本假单胞菌培养物、睾丸酮丛毛单胞菌培养物、微杆菌培养物、德氏食酸菌培养物、枯草芽孢杆菌培养物、固氮放线菌培养物、类球红细菌培养物和假丝酵母菌培养物共同作用于受污染土壤时，对硝基苯化合物的降解率优异，最低在80％以上；其中，实施例6降解硝基苯化合物的效果最好，对硝基苯化合物的降解率最高可达到88.51％。由此可见，本发明中的复合微生物菌剂中的原料组分缺一不可，均对治理土壤污染物之一硝基苯化合物起到不可忽视的作用。