本发明涉及农业肥料技术领域，具体涉及一种玉米专用的混合菌株微生物肥料及其制备方法。
背景技术：
玉米(zeamaysl.)是世界上种植面积最大、种植历史最悠久的粮食作物之一，随着科技水平和人民生活水平的提高，玉米已不仅仅是一种口粮，更是重要的牲畜饲料和工业生产原料，因此，世界范围内对玉米的需求量逐年呈现增长趋势(陈龙，2016)。我国玉米产业的发展势头也非常良好。据统计，玉米的增产对粮食增产的贡献率达49.4％。然而不得不指出的是，玉米的持续增产是以化肥的大量使用为代价的，但大量施用化肥带来的负面效应正在突显，如土壤退化问题和食品安全问题。现代农业在追求粮食高产的同时工作重心已经向粮食安全问题转移，国家也已经明确提出了“化肥农药零增长”的目标。所有，寻找一种环保绿色的化肥替代品已成为非常迫切的任务，微生物肥料正是这样一种富有前途的产品(姚拓，2002；王兴仁等，2016)。
植物根际促生菌(pgpr)的发现和其调控技术的完善为解决上述问题提供了新的思路，目前我国农业所遇到的作物养分与肥料供应问题、作物病害问题、连作障碍问题、土壤污染与退化问题、间套作和水旱轮作问题都与根际系统相关，归纳来看，都是根-土界面的物质交换和理化变化问题，因此，都能从植物根际促生菌中找到突破口(张福锁等，2008)。根际系统是地球表面养分的转化场，是提高营养元素和水分资源利用率的关键，更是农业增产增收的关键之所在(李建宏，2017)。在根际系统中，最活跃、最重要的组分是植物根际促生菌(pgpr)，所谓植物根际促生菌，其含义是定殖于植物根系附近，具有促进植物的生长功能，或具有抑制植物病原菌的作用的一大类细菌(姚拓，2002)。pgpr除了能够促进植物生长，还具有改善植物根际的微生态、抑制病原物、消除土壤污染物的作用。在实际应用中，常常被制成生物肥料或土壤改良剂，用于替代或减少化肥和农药的使用，或用于改良土壤、防止土壤退化，均取得了不错的效果(马文文，2014；陈龙，2016)。近些年，国内外研究表明，促生菌(能够促进植物生长的一大类菌)对植物的生长具有巨大的作用，如溶磷菌能将土壤中难以被植物直接吸收利用的磷素转化为植物可吸收态；固氮菌(分为共生、联合和自生固氮)可将大气中的氮气固定为植物可吸收态；分泌植物激素菌可分泌植物激素(如生长素、赤霉素、细胞分裂素等)；病原拮抗菌(又称生防菌)可以抑制或杀死植物病原菌等(姚拓，2002；孙广正，2015)。同时，一些促生菌兼具溶磷、固氮和分泌植物激素等特性。用从植物根际分离获得的高效促生菌研制成的复合接种剂(或菌肥)，不但可以活化土壤难溶性磷源，固定空气中的氮素，提供氮、磷素营养，同时可以促进农作物对其它营养元素的吸收，改善植物营养结构，调节和促进植物生长，增强植物抗病能力。此外，促生菌还可改善土壤结构，提高土壤有机质含量，改良盐碱地、防止土壤退化等(荣良燕等，2015；李建宏等，2016)。因此，开展植物促生菌资源的研究及复合接种剂(菌肥)研发具有极其重要的现实意义。
现今国内外都在积极发展绿色农业，提倡生产安全、无公害的绿色食品。在生产绿色食品过程中则要求不用或尽量少用(或限量使用)化学肥料、化学农药和其它化学物质。它要求肥料首先保护和促进施用对象生长和提高品质；其次是不造成施用对象产生和积累有害物质；三是对生态环境无不良影响。
虽然现有技术中有较多的微生物肥料已经应用到了农业生产实践中，如专利“一种玉米专用复合微生物肥料”(公开号：cn104387200a)公开了一种以微生物菌剂、中药组合物以及载体制备的玉米专用微生物肥料，专利“一种玉米专用复合微生物肥料及其制备方法”(公开号：cn102976840a)公开了一种由侧芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌以及载体组成的玉米专用微生物复合肥。但是现有的多数微生物肥料由于菌种组成不合理，或者由于载体配方不合理造成活性菌株存活率低，保存期限短，使其效果远远不如化肥，因此导致微生物肥料市场认可度很低。鉴于此，特提出本发明。
技术实现要素：
针对国内外现有技术的不足，玉米种植中过度依赖化学肥料造成化肥使用效率降低，养分吸收不全面均衡，土传病害难以有效防控以及引起生态环境污染，微生物肥料使用效果不稳定，针对性不强等问题，本发明利用新的微生物资源，筛选优良促生菌株，以一定的配比研制玉米专用混合菌株微生物肥料，为玉米生产提供新型“环境友好型”的混合菌株微生物肥料，以部分替代工业化肥，同时防止玉米土传病害入侵，减少化肥、农药的使用及农民的购买性投入。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：
一种玉米专用的混合菌株微生物肥料，包括载体和液体菌剂，其特征在于，所述的载体包括食用菌渣、花土、草炭、秸秆粉、马铃薯渣、黄腐酸钾、稀土凹凸棒、腐殖酸；所述的液体菌剂由假单胞杆菌pseudomonassp.cho19菌株发酵液和枯草芽孢杆菌bacillussubtilispbrs2菌株发酵液组成。
进一步的，按照重量份数计，所述的载体包括食用菌渣25份，花土25份，草炭10份，秸秆粉7份，马铃薯渣5份，黄腐酸钾3份，稀土凹凸棒3份，腐殖酸2份；所述的液体菌剂20份。
进一步的，所述的液体菌剂由假单胞杆菌pseudomonassp.cho19菌株发酵液和枯草芽孢杆菌bacillussubtilispbrs2菌株发酵液按重量比为1:1组成。
进一步的，所述的液体菌剂活菌浓度大于109cfu/ml。
一种玉米专用的混合菌株微生物肥料制备方法为：
(1)将食用菌渣加水堆沤，保温发酵，使其腐熟后晒干备用；
(2将食用菌渣，花土，草炭，秸秆粉，马铃薯渣，黄腐酸钾，稀土凹凸棒，腐殖酸等原料分别除杂粉碎后，过2mm筛；
(3)将各原料充分混匀制成载体；
(4)将上述混匀的载体灭菌后备用；
(5)配制na液体培养基，接种假单胞杆菌pseudomonassp.cho19菌株和枯草芽孢杆菌bacillussubtilispbrs2菌株等2种菌株，28～30℃培养24～48小时，用血球计数板在显微镜下计算培养液中菌体数量，当数量超过109cfu/ml时终止培养，将2种菌液充分混匀；；
(6)将培养好的菌液接种于已灭菌的载体，并在无菌条件下置于28～30℃培养5天即可使用，或在无菌密封容器中常温保存待用。
进一步的，所述的步骤(4)混匀的载体在121℃，0.1mpa高温高压下灭菌1h冷却后备用。
进一步的，所述的液体菌剂活菌浓度大于109cfu/ml。
进一步的，将所述的步骤(5)中的假单胞杆菌pseudomonassp.cho19菌株发酵液和枯草芽孢杆菌bacillussubtilispbrs2菌株发酵液以重量比为1:1的比例充分混匀。
进一步的，所述的步骤(6)中将培养好的菌液按照载体:菌液为8:2的比例接种于已灭菌的载体。
本发明的益处在于：
(1)本发明所述的玉米专用混合菌株微生物肥料具有高效拮抗多种植物病原菌的作用，能够预防玉米土传病害的发生，且该微生物肥料绿色环保，不会对土壤微生态造成破坏，也不会造成农药残留；
(2)本发明所述的微生物肥料同时具备溶磷、固氮、分泌植物激素等多种功效，给玉米提供全面、均衡、易吸收的养分，可以替代部分化肥；
(3)本发明所述的微生物肥料具有改良土壤的作用，能够调节土壤ph，增加土壤肥力以及防止土壤退化和土壤板结；
(4)本发明所述的菌剂成本低廉，载体原料食用菌渣、秸秆、马铃薯渣等为农牧业废弃物，对其高效利用，不仅可以节省经济成本，提高经济效益，而且能变废为宝，实现资源的循环利用。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
主要实验材料
假单胞杆菌pseudomonassp.cho19菌株已于2010年9月21日保藏于中国典型菌种保藏中心，编号为cctccm2010229；保藏名称：假单胞杆菌pseudomonassp.cho19；保藏地点：武汉大学。
枯草芽孢杆菌bacillussubtilispbrs2菌株已于2017年4月20日保藏于中国典型菌种保藏中心，编号为cctccm2017179；保藏名称：枯草芽孢杆菌bacillussubtilispbrs2；保藏地点：武汉大学。
实施例1复合菌剂与单菌株菌剂使用效果对比
(1)菌剂的制备
单菌株菌剂的制备：配制na液体培养基，分别单独接种假单胞杆菌pseudomonassp.cho19菌株、枯草芽孢杆菌bacillussubtilispbrs2菌株等2个菌株，28～30℃培养24～48小时，用血球计数板在显微镜下计算培养液中菌体数量，当菌体浓度超过109cfu/ml时终止培养并获得各菌株的单菌株菌剂。
复合菌剂的制备：将各单菌株菌剂按照1:1的比例混匀即得混合菌株菌剂。
(2)各指标的测定
1)磷的测定
溶磷能力(即菌液中有效磷增量，包括有机磷和无机磷)的测定采用的是mbc法(即钼蓝比色法)分别配制蒙金娜培养液和pko培养液，将其置于三角瓶中，接种待测菌株，180rpm，28℃培养14d，之后在低温下(4℃)，10000rpm离心10min，准确吸取5ml上清液，将其加到45.0ml0.5mol·l-1nahco3中，再加入约1g无磷活性炭粉，充分震荡，过滤，取定量滤液，加显色液，测其吸光值并计算待测液磷含量(姚拓，2002)。公式如下：
在上式中：
ρ代表溶液中的磷含量，单位为μg·ml-1；
v代表待测液的体积，单位为ml；
ts代表分取的倍数；
v0代表所取的待测菌株培养液的体积，单位为ml。
2)菌株固氮酶活性的测定
采用ara法(即乙炔还原法)，以固氮酶活性表示，单位为nmol(c2h4)·h-1·ml-1，具体方法如下：按照1.1.2中配方配制nfm半固体培养基，置于penicillinbottle(西林瓶)内，在其内接种待测菌株，用透气塞或透气瓶膜封口，恒温(28℃)培养48h，之后在无菌条件下将透气塞换为密封塞，从penicillinbottle中抽出1ml空气，再向其内注入等体积乙炔(c2h2)，密封置于28℃继续培养48h，再用gc法(即气相色谱法)测定培养后瓶内混合气体中乙炔的浓度，根据如下公式计算菌株固氮酶的活性(姚拓，2002)：
在上式中：
n表示待测菌株固氮酶的活性，单位为：nmol(c2h4)·h-1·ml-1；
hx代表gc法测出的乙炔的峰面积；
c为培养后混合气体中乙炔的浓度，单位为：nmol·ml-1；
v代表所选用的penicillinbottle的容积，单位为：ml；
hs代表标样乙炔的gc峰面积；
t代表待测菌株培养的时间，单位为：h；
24.9表示标准c2h4气体在测试时的体积(ml)(姚拓，2002)。
3)菌株分泌植物激素能力(iaa和ga3)的测定
菌株分泌植物激素能力采用hplc法测定，具体方法如下：
预处理：将待测菌株接种于lb培养液中，28℃恒温条件下，180rpm黑暗培养72h，之后将培养液置于低温下10000rpm离心10min，将离心所得上清液收集于无菌离心管。再将该上清液加入活化好的spe柱内，10％甲醇淋洗，80％甲醇洗脱，用氮气吹干法浓缩洗脱液，低温保存备用。hplc法检测(刘婷，2016)。
4)对病原菌抑制能力的测定
制备菌剂和病原菌(fusariumoxysporum)的孢子悬浮液，用菌剂处理孢子悬液(未处理的作为对照)，在水琼脂培养基表面培养，显微镜检测孢子萌发率，计算抑菌率。
表1：复合菌剂与单菌株菌剂使用效果对比
从以上实验结果可知此混合菌株可在含5％以下nacl培养基上生长；对该混合菌株体系测定表明，两株菌间无拮抗反应，在溶磷、固氮、分泌植物激素(iaa、ga)等各项测定中：使用混合菌株后，有机磷含量增加95.21μg·l-1，无机磷含量增加439.75μg·l-1，固氮酶活性为3415.92nmolc2h4h-1ml-1，iaa含量为93.21μg·ml-1，ga3含量为45.83μg·ml-1，对病原菌(fusariumoxysporum)的抑制率为91.32％，使用复合菌株后与各菌株单独培养相比，各指标均有明显的增加。通过试验证明假单胞杆菌pseudomonassp.cho19菌株和枯草芽孢杆菌bacillussubtilispbrs2菌株混合培养时相互之间不仅没有拮抗作用，而且还有相互促进的效果。
实施例2玉米专用混合菌株微生物肥料的制备及肥效实验
本实施例中所述的玉米专用混合菌株微生物肥料，按照重量份数计，其原料组分包括食用菌渣25份，花土25份，草炭10份，秸秆粉7份，马铃薯渣5份，黄腐酸钾3份，稀土凹凸棒3份，腐殖酸2份，优良菌株发酵液20份。所述液体菌剂优良菌株发酵液由假单胞杆菌pseudomonassp.cho19菌株和枯草芽孢杆菌bacillussubtilispbrs2菌株发酵液按1:1的比例组成，即假单胞杆菌pseudomonassp.cho19菌株和枯草芽孢杆菌bacillussubtilispbrs2菌株发酵液各10份。
上述混合菌株微生物肥料的制备方法如下：
(1)将食用菌渣加水堆沤，保温发酵，使其腐熟后晒干备用；
(2)将食用菌渣，花土，草炭，秸秆粉，马铃薯渣，黄腐酸钾，稀土凹凸棒，腐殖酸等原料分别除杂粉碎后，过2mm筛；
(3)将各原料充分混匀；
(4)将上述混匀的载体在121℃，0.1mpa高温高压灭菌2h冷却后备用；
(5)配制na液体培养基，接种假单胞杆菌pseudomonassp.cho19菌株和枯草芽孢杆菌bacillussubtilispbrs2菌株，28～30℃培养24～48小时，用血球计数板在显微镜下计算培养液中菌体数量，当数量超过1.0×109cfu/ml时终止培养，将2种菌液充分混匀；
(6)将培养好的菌液按照载体:菌液为8:2的比例接种于已灭菌的载体，并在无菌条件下置于28～30℃培养5天即可使用，或在无菌密封容器中常温保存待用。
玉米专用混合菌株微生物肥料的肥效实验：
实验例：实施例2制备的玉米专用混合菌株微生物肥料
对照组：以不施肥处理作为对照
实验方法：播种前将种子放在塑料布上，然后将喷洒适量的无菌水于种子上，使种子湿润，然后取生物菌肥撒在种子上，边撒边搅拌直至拌均匀为止，每亩地使用量为2.5kg。阴干后即可播种。待玉米成株期测定株高和茎粗，玉米籽粒成熟期收获，测定籽粒产量。
实验时间：实验开始于2014年3月，连续实验3年(2014年～2016年)，统计三年数据。
实验地点：实验地点位于甘肃省临夏回族自治州和政县
实验方式及结果：将实施例2的玉米专用混合菌株微生物肥料进行田间试验，分别测定使用实施例2微生物肥料处理组和对照组玉米的株高、茎粗、籽粒产量以及根部病害发病率等指标，以验证本发明实施例2的玉米专用混合菌株微生物肥料的田间使用效果，结果如下表：
表2：实施例2的玉米专用混合菌株微生物肥料使用效果
由上表可见，施用本发明实施例2的玉米专用混合菌株微生物肥料，可以有效促进玉米生长，提高玉米籽粒产量，此外，实践过程还观察到，使用该发明实施例2的玉米专用混合菌株微生物肥料，可以抵御土壤中病原真菌的侵染，防止土传病害的发生。
经本方法制备而成的玉米专用混合菌株微生物肥料储存于室温下，6个月后检测其活菌数，达6.21×108cfu/g。符合《中华人民共和国农业行业标准(ny/t1113-2006)》之规定。
参考文献
张福锁，王激清，张卫峰，等.中国主要粮食作物肥料利用率现状与提高途径.土壤学报.2008,45(5)：915-924.
王兴仁，江荣风，张福锁.我国科学施肥技术的发展历程及趋势.磷肥与复肥.2016,31(2):1-5.
李建宏，优良植物根际促生菌bacillusmycoidesgnyt1特性研究及全基因组测序分，甘肃农业大学，2017.
姚拓，促进植物生长菌的研究现状.草原与草坪.2002,99(4):3～5.
荣良燕，柴强，姚拓，等.复合微生物接种剂替代部分化肥对豌豆间作玉米的促生效应.草业学报，2015，24(2)：22-30.
李建宏，李雪萍，马文文，等.东祁连山高寒草地几种禾本科牧草根际促生菌研究.草业学报,2016,11:173-177.
马文文.禾草根际促生菌资源筛选及其数据库管理系统构建.兰州：甘肃农业大学，2014.
陈龙，菌肥对粮饲兼用型玉米生长和品质及土壤特性影响研究.甘肃农业大学,2016.
刘婷，高寒草甸优势植物根际促生菌资源评价及菌种鉴定.甘肃农业大学.2016.
孙广正.微生物接种剂对油菜和西葫芦病害防治及其促生作用研究.甘肃农业大学[d]，2015.
姚拓.饲用燕麦和小麦根际促生菌特性研究及其生物菌肥的初步研制[d].兰州:甘肃农业大学,2002。