烟酸核糖苷(nicotinicacidriboside,nar)为维生素b3的吡啶-核苷形式,其用作烟酰胺腺嘌呤二核苷酸或nad+的前体。人们认为高剂量的烟酸(na)能够帮助提高高密度脂蛋白胆固醇,并降低低密度脂蛋白胆固醇和游离脂肪酸,但却尚未完全理解其机制。然而,高剂量na会导致不良的潮红反应。与na和nr一样,nar能够在哺乳动物细胞中被转化为nad+。然而,已阻止了关于nar对人类和动物营养的潜在益处的研究,这是因为尚未描述产生其的有效且经济的方法。因此,期望识别用于产生烟酸核糖苷(nar)的新方法。
在20世纪90年代首次阐明了细菌中nad+的生物合成,且显示出该生物合成依赖于未在真核细胞中发现的两种关键的酶活性:fad依赖型l-天冬氨酸氧化酶(e.colinadb,ec1.4.3.16);以及喹啉合酶(e.colinada,ec2.5.1.72)。l-天冬氨酸氧化酶催化l-天冬氨酸至亚氨基琥珀酸的氧化,其利用分子氧作为电子受体并产生过氧化氢,其中涉及松散结合的黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)辅因子。已知escherichiacoli中的酶受到下游产物nad+的抑制,但却已产生反馈抗性突变体。含有铁-硫簇的喹啉合酶随后进行亚氨基琥珀酸与磷酸二羟丙酮的缩合和环化,产生喹啉(quinolate)。这两种酶的组合活性将从1摩尔的天冬氨酸和1摩尔的磷酸二羟丙酮产生1摩尔的喹啉。
三种另外的酶活性为nad+合成的两种经典的从头途径所共有的:喹啉磷酸核糖基转移酶(e.colinadc,ec2.4.2.19);烟酸单核苷酸腺苷转移酶(e.colinadd,ec2.7.7.18);以及烟酸单核苷酸腺苷转移酶,即nad+合成酶(e.colinade,ec6.3.1.5)。喹啉磷酸核糖基转移酶将磷酸核糖基部分从磷酸核糖焦磷酸转移至喹啉氮并催化中间物的后续脱羧以产生烟酸单核苷酸(namn)、焦磷酸盐和二氧化碳。烟酸单核苷酸腺苷转移酶(nmnat)使用三磷酸腺嘌呤(atp)来腺苷酸化namn,产生烟酸二核苷酸(naad)和焦磷酸盐。nad+生物合成中的最后一步是由nad+合成酶催化的,其利用氨或谷氨酰胺作为氮供体来将naad酰胺化成nad+,将1摩尔的atp水解成amp和焦磷酸盐。
除了从头途径之外,还存在多种用于补救nar、nr、nmn、烟酰胺(nam)或烟酸(na)的特征化途径。已经在saccharomycescerevisiae中操纵这些补救途径以使得能够产生nr(美国专利号8,114,626)。同时缺失s.cerevisiae基因nrk1、urh1和pnp1使细胞外nr增加~10倍,且额外的nrt1缺失导致进一步增加~4倍至4um。这些基因分别编码nr激酶(e.colinadr)、嘌呤核苷磷酸化酶(urh1和pnp1,e.colideod)和nr转运(e.colipnuc)的活性。
nad基因的表达通常是通过转录抑制物在细菌中进行共调节的。在e.coli中,nada、nadb和pncb的转录受到nadr蛋白的抑制,该nadr蛋白也具有有助于补救途径的催化活性。nadr通过在nad+存在下结合至保守基序来阻断转录。在bacillussubtilis中,一种名为yrxa的不同蛋白质通过在na存在下阻断两个背驰转录的操纵子nadb-nada-nadc和nifs-yrxa来执行类似的作用(rossolillo,2005,j.bacteriol.,187(20),7155-7160)。
因此,一直期望找到用于增加烟酸的产生的更有效的方式。
本发明人现已惊奇地发现了一种用于显著增加烟酸核糖苷的产生的新方法以及所创建的用于这种方法中的宿主细胞和表达载体。
本发明涉及一种能够产生烟酸核糖苷(nar)的经遗传修饰的细菌,其中细菌包括选自以下所组成的组的至少一种修饰:a)通过抑制nada、nadb、nadc基因或其组合的转录来阻断或降低具有抑制nad+生物合成作用的蛋白质的活性;b)添加或增加编码l-天冬氨酸氧化酶、喹啉合酶、喹啉磷酸核糖基转移酶的基因或其组合的转录;以及c)阻断或降低用作烟酸单核苷酸腺苷转移酶的蛋白质的活性;其中,与没有任何该修饰的细菌相比,具有至少一种该修饰的细菌产生了增加量的nar。
可选地,细菌还可以包括选自以下所组成的组的至少一种修饰:d)阻断或降低用作核苷磷酸化酶的蛋白质的活性;e)阻断或降低用作烟酸核糖苷激酶的蛋白质的活性;f)阻断或降低用作烟酸核糖苷转运蛋白的蛋白质的活性;g)阻断或降低用作烟酸磷酸核糖基转移酶的蛋白质的活性;h)添加或增加用作烟酰胺单核苷酸酰胺水解酶的蛋白质的活性;以及i)添加或增加用作烟酸单核苷酸水解酶的蛋白质的活性。
在一些实施方式中,nad+生物合成的负调节物为包含seqidno:1、2或3中的任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体,其中该多肽具有抑制nad+生物合成的活性。
在一些实施方式中,喹啉合酶是包含seqidno:23、24或25中的任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体,其中该多肽具有将亚氨基琥珀酸和磷酸二羟丙酮转化成喹啉和磷酸盐的活性。
在一些实施方式中,l-天冬氨酸氧化酶是包含seqidno:26或27中的任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体,其中该多肽具有在fad依赖型反应中将天冬氨酸转化成亚氨基琥珀酸的活性。
在一些实施方式中,喹啉磷酸核糖基转移酶是包含seqidno:28、29或30中的任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体,其中该多肽具有将喹啉和磷酸核糖焦磷酸转化成烟酰胺单核苷酸和二氧化碳的活性。
在一些实施方式中,烟酸单核苷酸腺苷转移酶蛋白是包含seqidno:4、5或6中的任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体,其中该多肽具有将烟酸单核苷酸转化成烟酸腺嘌呤二核苷酸的烟酸单核苷酸腺苷转移酶活性。
在一些实施方式中,烟酸核糖苷磷酸化酶是包含seqidno:7、8、18或19中的任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体,其中该多肽具有将烟酸核糖苷转化成烟酸和磷酸核糖的核苷裂解活性。
在一些实施方式中,烟酸核糖苷转运蛋白是包含seqidno:9、10或11中的任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体,其中该多肽具有输入烟酸核糖苷的烟酸核糖苷转运活性。
在一些实施方式中,烟酸单核苷酸水解酶是包含seqidno:12、13或14中的任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体,其中该多肽具有将烟酸单核苷酸转化成烟酸核糖苷的烟酸单核苷酸水解酶活性。
在一些实施方式中,烟酸磷酸核糖基转移酶是包含seqidno:15、16或17中的任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体,其中该多肽具有将烟酸、5-磷酸-核糖1-二磷酸和三磷酸腺苷转化为烟酸单核苷酸、二磷酸腺苷、二磷酸盐和磷酸盐的烟酸磷酸核糖基转移酶活性。
在一些实施方式中,烟酸核糖苷激酶是包含seqidno:1的氨基酸序列的多肽,其中该多肽具有将烟酸核糖苷转化成烟酸单核苷酸的烟酸核糖苷激酶活性。
在一些实施方式中,烟酰胺单核苷酸酰胺水解酶是包含seqidno:20、21或22中的任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体,其中该多肽具有将烟酰胺单核苷酸转化成烟酸单核苷酸的烟酰胺单核苷酸酰胺水解酶活性。
在一些实施方式中,经遗传修饰的细菌可以是e.coli、b.subtilis、c.glutamicum、a.baylyi或r.eutropha。
本发明还涉及一种产生nar的方法,其包括:在有效产生nar的条件下培养细菌细胞并从培养基回收nar,从而产生nar,其中宿主微生物包括选自以下所组成的组的至少一种修饰:a)通过抑制nada、nadb、nadc基因或其组合的转录来阻断或降低具有抑制nad+生物合成作用的蛋白质的活性;b)添加或增加编码l-天冬氨酸氧化酶、喹啉合酶、喹啉磷酸核糖基转移酶的基因或其组合的转录;以及c)阻断或降低用作烟酸单核苷酸腺苷转移酶的蛋白质的活性。可选地,细菌还可以包括选自以下所组成的组的至少一种修饰:d)阻断或降低用作烟酸核糖苷磷酸化酶的蛋白质的活性;e)阻断或降低用作烟酸核糖苷激酶的蛋白质的活性;f)阻断或降低用作烟酸核糖苷转运蛋白的蛋白质的活性;g)阻断或降低用作烟酸磷酸核糖基转移酶的蛋白质的活性;h)添加或增加用作烟酰胺单核苷酸酰胺水解酶的蛋白质的活性;以及i)添加或增加用作烟酸单核苷酸水解酶的蛋白质的活性。
本发明还涉及从上述经遗传修饰的细菌中的任一个获得的烟酸核糖苷化合物。
本发明还涉及一种组合物,其包含从上述经遗传修饰的细菌获得的烟酸核糖苷化合物。
本发明还涉及一种食品或饲料,其包含从上述经遗传修饰的细菌获得的烟酸核糖苷化合物。
除非本文另有定义外,否则本文使用的科学和技术术语将具有本领域普通技术人员通常所理解的含义。
术语“喹啉合酶”表示能够将亚氨基琥珀酸和磷酸二羟丙酮转化成喹啉和磷酸盐的酶,参见图1。本发明中使用的喹啉合酶能够来自多种生物,诸如e.coli、b.subtilis、c.glutamicum等。喹啉合酶蛋白的实例包括具有氨基酸序列seqidno:23、24或25的多肽。编码喹啉合成活性的基因是在例如,登记号acx40525(e.coli)、np_390663(b.subtilis)和caf19774(c.glutamicum)下提供的。如所定义的喹啉合酶包括上述喹啉合酶的功能变体。
术语“l-天冬氨酸氧化酶”表示能够在fad依赖型反应中将天冬氨酸转化成亚氨基琥珀酸的酶。本发明中使用的l-天冬氨酸氧化酶能够来自多种生物,诸如e.coli、b.subtilis、c.glutamicum等。核苷水解酶蛋白的实例包括具有氨基酸序列seqidno:26或27的多肽。编码l-天冬氨酸氧化酶活性的基因是在例如,登记号acx38768(e.coli)和np_390665(b.subtilis)下提供的。如所定义的l-天冬氨酸氧化酶包括上述l-天冬氨酸氧化酶的功能变体。
术语“喹啉磷酸核糖基转移酶”表示能够将喹啉和磷酸核糖焦磷酸转化成烟酰胺单核苷酸和二氧化碳的酶。本发明中使用的喹啉磷酸核糖基转移酶能够来自多种生物,诸如e.coli、b.subtilis、c.glutamicum等。核苷水解酶蛋白的实例包括具有氨基酸序列seqidno:28、29或30的多肽。编码喹啉磷酸核糖基转移酶活性的基因是在例如,登记号acx41108(e.coli)、np_390664(b.subtilis)和caf19773(c.glutamicum)下提供的。如所定义的喹啉磷酸核糖基转移酶包括上述喹啉磷酸核糖基转移酶的功能变体。
术语“nad+生物合成的负调节物”表示能够通过抑制喹啉合酶(nada)、fad依赖型l-天冬氨酸氧化酶(nadb)、喹啉磷酸核糖基转移酶(nadc)或其组合的转录来抑制nad+生物合成活性的酶。本发明中描述的nad+生物合成蛋白的负调节物能够来自多种生物,诸如e.coli、b.subtilis、c.glutamicum等。nad+生物合成蛋白的负调节物的实例包括具有氨基酸序列seqidno:1、2或3的多肽。编码nad+生物合成活性的负调节物的基因是在例如,登记号np_418807(e.coli)、p39667(b.subtilis)和baf54131(c.glutamicum)下提供的。如所定义的nad+生物合成的负调节物包括上述nad+生物合成的负调节物的功能变体。
术语“烟酸单核苷酸腺苷转移酶”表示能够催化烟酸单核苷酸至烟酸腺嘌呤二核苷酸的转化的酶。该酶在e.coli中被称为nadd。本发明中描述的烟酸单核苷酸腺苷转移酶蛋白能够来自多种生物,诸如e.coli、b.subtilis、c.glutamicum等。烟酸单核苷酸腺苷转移酶蛋白的实例包括具有氨基酸序列seqidno:4、5或6的多肽。编码烟酸单核苷酸腺苷转移酶活性的基因是在例如,登记号np_415172(e.coli)、np_390442(b.subtilis)和caf21017(c.glutamicum)下提供的。如所定义的烟酸单核苷酸腺苷转移酶包括上述烟酸单核苷酸腺苷转移酶的功能变体。
术语“烟酸核糖苷磷酸化酶”表示能够催化烟酸核糖苷至烟酸和磷酸核糖的转化的酶。该酶在e.coli中被称为pncb。本发明中描述的烟酸核糖苷磷酸化酶蛋白能够来自多种生物,诸如e.coli、b.subtilis、c.glutamicum等。烟酸核糖苷磷酸化酶蛋白的实例包括具有氨基酸序列seqidno:7、8、18或19的多肽。编码烟酸核糖苷磷酸化酶活性的基因是在例如,登记号np_418801(e.coli)、np_389844(b.subtilis)、np_390230(b.subtilis)和np_391819(b.subtilis)下提供的。如所定义的烟酸核糖苷磷酸化酶包括上述烟酸核糖苷磷酸化酶的功能变体。
术语“烟酸核糖苷转运蛋白”表示能够催化烟酸核糖苷的转运以将烟酸核糖苷从周质输入至细胞质中的蛋白质。该酶在e.coli中被称为pnuc。本发明中描述的烟酸核糖苷转运蛋白能够来自多种生物,诸如e.coli、b.subtilis、c.glutamicum等。烟酸核糖苷转运蛋白的实例包括具有氨基酸序列seqidno:9、10或11的多肽。编码nar转运活性的基因是在例如,登记号cag67923(a.baylyi)、np_599316(c.glutamicum)和np_415272(e.coli)下提供的。如所定义的烟酸核糖苷转运蛋白包括上述烟酸核糖苷转运蛋白的功能变体。
术语“烟酸单核苷酸水解酶”表示能够催化烟酸单核苷酸至烟酸核糖苷的水解的酶。该酶在e.coli中被称为usha。本发明中使用的核苷水解酶能够来自多种生物,诸如e.coli、b.subtilis、c.glutamicum等。核苷水解酶蛋白的实例包括具有氨基酸序列seqidno:12、13或14的多肽。编码核苷水解酶活性的基因是在例如,登记号np_415013(e.coli),np_388665(b.subtilis)和caf18899(c.glutamicum)下提供的。如所定义的烟酸单核苷酸水解酶包括上述烟酸单核苷酸水解酶的功能变体。
术语“烟酸磷酸核糖基转移酶”表示能够催化烟酸、5-磷酸-核糖1-二磷酸和三磷酸腺苷至烟酸单核苷酸、二磷酸腺苷、二磷酸盐和磷酸盐的转化的酶。该酶还催化了逆反应。本发明中描述的烟酸磷酸核糖基转移酶蛋白能够来自多种生物,诸如e.coli、b.subtilis、c.glutamicum等。烟酸磷酸核糖基转移酶蛋白的实例包括具有氨基酸序列seqidno:15、16或17的多肽。编码烟酸磷酸核糖基转移酶活性的基因是在例如,登记号np_415451(e.coli)、np_391053(b.subtilis)和caf21180(c.glutamicum).下提供的。如所定义的烟酸磷酸核糖基转移酶包括上述烟酸磷酸核糖基转移酶的功能变体。
术语“烟酰胺单核苷酸酰胺水解酶”表示能够催化烟酰胺单核苷酸至烟酸单核苷酸的转化的酶。该酶在e.coli中被称为pncc。本发明中描述的烟酰胺单核苷酸酰胺水解酶能够来自多种生物,诸如e.coli、b.subtilis、c.glutamicum等。烟酰胺单核苷酸酰胺水解酶蛋白的实例包括具有氨基酸序列seqidno:20、21或22的多肽。编码烟酰胺单核苷酸酰胺水解酶活性的基因是在例如,登记号np_417180(e.coli)、aab00568(b.subtilis)和caf20304(c.glutamicum)下提供的。如所定义的烟酰胺单核苷酸酰胺水解酶包括上述烟酰胺单核苷酸酰胺水解酶的功能变体。
术语“烟酸核糖苷激酶”表示能够催化烟酸核糖苷至烟酸单核苷酸的转化的酶。本发明中描述的烟酸核糖苷激酶蛋白能够来自多种生物,诸如e.coli、b.subtilis、c.glutamicum等。烟酸核糖苷激酶蛋白的实例包括具有氨基酸序列seqidno:1的多肽。编码烟酸核糖苷激酶活性的基因是在例如,登记号np_418807(e.coli)下提供的。如所定义的烟酸核糖苷激酶包括上述烟酸核糖苷激酶的功能变体。
序列同源性:两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性是由参数“序列同源性”描述的。
出于本公开的目的,在两个氨基酸序列之间的序列同源性程度是使用如在emboss软件包的needle程序(emboss:欧洲分子生物学开放软件套件,rice等,2000,trendsgenet.16:276-277),优选为版本3.0.0或更高版本中实施的needleman-wunsch算法(needlemanandwunsch,1970,j.mol.biol.48:443-453)确定的。所使用的可选参数为缺口开放罚分10,缺口延伸罚分0.5和eblosum62(blosum62的emboss版本)替代矩阵。标记为“最长同源性”的needle输出(使用-nobrief选项获得的)被用作同源性百分比且计算如下:
(相同的残基×100)/(对齐长度-对齐中的缺口总数)
出于本公开的目的,在两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列同源性程度是使用如在emboss软件包的needle程序(emboss:欧洲分子生物学开放软件套件,rice等,2000,同上),优选为版本3.0.0或更高版本中实施的needleman-wunsch算法(needlemanandwunsch,1970,同上)确定的。所使用的可选参数为缺口开放罚分10,缺口延伸罚分0.5和ednafull(ncbinuc4.4的emboss版本)替代矩阵。标记为“最长同源性”的needle输出(使用-nobrief选项获得的)被用作同源性百分比且计算如下:
(相同的脱氧核糖核苷酸×100)/(对齐长度-对齐中的缺口总数)
核酸构建体:术语“核酸构建体”是指单链或双链的核酸分子,其是从天然存在的基因分离的或进行修饰以含有不存在于自然界中或是合成的核酸片段。当核酸构建体含有表达本公开的编码序列所需的控制序列时,术语核酸构建体与术语“表达盒”同义。
控制序列:术语“控制序列”是指表达编码本公开的多肽的多核苷酸所必需的所有组分。每个控制序列对于编码多肽的多核苷酸来说可以是天然的或外源的,或对彼此而言是天然的或外源的。这种控制序列包括,但不限于,前导、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。至少,控制序列包括启动子以及转录和翻译终止信号。控制序列可以具有用于引入特定限制性位点的接头序列,该特定限制性位点便于进行控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区的连接。
可操作性连接的:术语“可操作性连接的”是指一种构型,其中控制序列被置于相对于多核苷酸的编码序列的适当位置上,以使得控制序列指导编码序列的表达。
表达:术语“表达”包括在多肽的产生中所涉及的任何步骤,包括但不限于,转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体:术语“表达载体”是指线性或环状dna分子,其包括编码多肽的多核苷酸且可操作性连接至为其表达而提供的额外的核苷酸。
宿主细胞:术语“宿主细胞”是指具有包括编码本公开的多肽序列中的任一个的多核苷酸的核酸构建体或表达载体的易于发生转化、转染、转导等的任何细菌细胞类型。术语“宿主细胞”包含由于在复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。
本发明提供了用于产生烟酸核糖苷的具有经遗传修饰的特性的细菌菌株。
已通过补救途径的修饰来在酵母中描述了烟酰胺核糖苷的产生。令人惊讶的是,在细菌中修饰nad+生物合成和补救途径的结合导致了烟酸核糖苷的产生。
因此,在本发明的第一个实施方式中,期望引入一种或多种遗传修饰,其导致了在宿主细胞内的烟酸单核苷酸的产生率增加。修饰可以包括基因表达的缺失或减少,该基因抑制从头nad+生物合成途径的基因nada、nadb和/或nadc中的全部或一些的转录。参见图2。该修饰还可以或替代地包括增加由例如,nadb(e.coli、b.subtilis)、nada(e.coli、b.subtilis、c.glutamicum)或nadc(e.coli、b.subtilis、c.glutamicum)编码的l-天冬氨酸氧化酶基因、喹啉合酶基因、喹啉磷酸核糖焦磷酸基因或其组合的表达。该修饰还可以或替代地包括对nadb基因的修饰,其使得基因对下游代谢物nad+产生的抑制具有抗性。
在e.coli、b.subtilis、c.glutamicum和其他种的细菌中,namn通过烟酸单核苷酸腺苷转移酶(nmnat,ec2.7.7.18)的作用被转化成烟酸腺嘌呤二核苷酸(naad)。nmnat活性的降低导致细胞内namn水平增加,这导致namn输出增加以及至nar的去磷酸化。因此,在第二个实施方式中,将一种或多种遗传修饰引入宿主细胞以降低nmnat活性。在某些优选实施方式中,通过改变具有nmnat活性的多肽的氨基酸序列来实现nmnat活性的降低。例如,在某些实施方式中,修饰可以包括将在b.subtilisnadd基因(seqidno:6)的位置10处编码的苏氨酸或在位置39处编码的天冬酰胺改变成另一种氨基酸。在其他实施方式中,修饰可以包括将在e.colinadd基因(seqidno:7)的位置11处编码的苏氨酸或在位置40处编码的天冬酰胺改变成另一种氨基酸。在其他实施方式中,修饰可以包括将在c.glutamicumnadd基因(seqidno:8)的位置25处编码的苏氨酸改变成另一种氨基酸。修饰还可以包括对编码nmnat的开放阅读框的区域5’或3’的修饰,以使得基因的转录和/或翻译以较低的效率发生。
在一些实施方式中,nad+生物合成的负调节物为包含seqidno:1、2或3中的任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体,其中该多肽具有抑制nad+生物合成的活性。
在一些实施方式中,喹啉合酶是包含seqidno:23、24或25中的任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体,其中该多肽具有由亚氨基琥珀酸和磷酸二羟丙酮形成喹啉的活性。
在一些实施方式中,l-天冬氨酸氧化酶是包含seqidno:26或27中的任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体,其中该多肽具有由天冬氨酸形成亚氨基琥珀酸的活性。
在一些实施方式中,喹啉磷酸核糖基转移酶是包含seqidno:28、29或30中的任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体,其中该多肽具有由喹啉和磷酸核糖焦磷酸形成烟酸单核苷酸的活性。
在一些实施方式中,烟酸单核苷酸腺苷转移酶蛋白是包含seqidno:4、5或6中的任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体,其中该多肽具有将烟酸单核苷酸转化成烟酸腺嘌呤二核苷酸的烟酸单核苷酸腺苷转移酶活性。
本发明还包括一种经遗传修饰的细菌菌株,其在烟酸核糖苷输入和补救途径中有缺陷。参见图4。预计细菌中nar补救途径的破坏会导致细胞外nar的累积,这是因为这种菌株无法在细胞内或在细胞外将nar输入细胞质中,且也无法将nar磷酸化成namn,或将nar降解为烟酸(na)和磷酸核糖。四种酶活性对于工程菌nar的产生来说是特别重要的。烟酸核糖苷激酶对细胞内nar的磷酸化使该化合物再循环回nad+生物合成途径中。通过缺失或降低编码nr激酶活性的基因,诸如e.coli中的nadr的表达来去除该活性将通过防止将其转化成namn来增加细胞内的nar池。通过核苷磷酸化酶活性将nar降解为na和磷酸核糖去除了产物,且缺失或降低编码该活性的基因,例如,在e.coli中的deod或b.subtilis中的pdp的表达将增加产生形成率。通过烟酸磷酸核糖基转移酶活性将烟酸和5-磷酸-α-d-核糖1-二磷酸连接到烟酸单核苷酸。该反应在生理条件下是可逆的,且可以用于将源于水解的namn重新路由至副产物烟酸中。编码该活性的基因,例如,在e.coli中的pncb、在b.subtilis中的yuek或在c.glutamicum中的cg2774的表达减少或缺失将通过阻止该降解反应来增加nar的形成。转运蛋白负责细胞外nar的输入,且编码该活性的基因,例如,在e.coli中的pnuc或在b.subtilis中的nupc的表达缺失或减少将导致细胞外nar的产生率的增加。
因此,在本发明的第三个实施方式中,期望减少或阻断烟酰胺核糖苷输入和补救途径且从而使宿主细胞保留已产生的烟酰胺核糖苷。在某些实施方式中,本发明的细菌菌株具有下列特性中的一个或多个:i)阻断或减少的用作烟酸核糖苷磷酸化酶的蛋白质;ii)阻断或减少的用作烟酸核糖苷激酶的蛋白质;iii)阻断或减少的用作烟酸核糖转运蛋白的蛋白质;iv)阻断或减少的用作烟酸磷酸核糖基转移酶的蛋白质。
根据本文的实施方式的烟酸核糖苷磷酸化酶可以包括,例如,但不限于,包含seqidno:7、seqidno:8、seqidno:18或seqidno:19中任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体,其中上述多肽具有用于将烟酸核糖苷转化成烟酸和磷酸核糖的的烟酸核糖苷磷酸化酶的活性。
根据本文的实施方式的烟酸核糖苷激酶可以包括,例如,但不限于,包含seqidno:1的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体,其中上述多肽具有用于将烟酸核糖苷转化成烟酸单核苷酸的烟酸激酶的活性。
根据本文的实施方式的烟酸核糖苷摄取性转运体可以包括,例如,但不限于,包含seqidno:9、10或11中任一个的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体,其中上述多肽具有烟酸核糖苷输入活性。
根据本文的实施方式的烟酸单核苷酸磷酸核糖基转移酶可以包括,例如,但不限于,包含seqidno:15、seqidno:16或seqidno:17的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体,其中上述多肽具有用于在可逆反应中将烟酸、5-磷酸-核糖1-二磷酸和三磷酸腺苷转化为烟酸单核苷酸、二磷酸腺苷、二磷酸盐和磷酸盐的烟酸单核苷酸磷酸核糖基转移酶的活性。
在本发明的第四个实施方式中,期望增加例如,由e.coli中的usha或b.subtilis中的yfkn进行编码的细胞外烟酸单核苷酸水解酶基因的表达水平,且因此使得宿主细胞从namn产生过量的细胞外nar。参见图3。在一个实施方式中,本发明涉及一种细菌菌株,其具有增加的烟酸单核苷酸水解酶活性。根据本文的实施方式的烟酰胺单核苷酸水解酶可以包括,例如但不限于,包含seqidno:12、13或14的氨基酸序列的多肽或该多肽的变体,其中上述多肽具有用于将烟酸单核苷酸转化成烟酸核糖苷的烟酸单核苷酸水解酶的活性。
除了用作辅因子之外,nad+还在多种细胞进程中进行消耗,例如作为细菌dna连接酶的底物,其伴随有nmn的释放。在本发明的第五个实施方式中,nmn向namn的快速再循环使系统偏向于在nr上产生nar,且是通过由例如,e.coli中的pncc(seqidno:20)、b.subtilis中的cina(seqidno:21)或c.glutamicum中的cg2153(seqidno:22)编码的烟酰胺单核苷酸酰胺水解酶,或该烟酰胺单核苷酸酰胺水解酶的变体的过表达来实现的。
在另一些实施方式中,在上述第一个或第二个实施方式中描述的细菌菌株还包括上述第三个实施方式、第四个实施方式或这两者。
例如,在一个实施方式中,本发明涉及一种能够产生烟酸核糖苷的经遗传修饰的细菌,其中该细菌包括下列修饰:i)在带有具有阻断或降低的活性的改变的nad+生物合成负调节物的宿主中的改变或增加的l-天冬氨酸氧化酶活性,改变或增加的喹啉合酶活性,改变或增加的喹啉磷酸核糖焦磷酸活性或其组合,以及ii)选自以下所组成的组的一种或多种额外的修饰:d)具有阻断或降低的活性的改变的烟酸核糖苷激酶;e)具有阻断或降低的活性的改变的烟酸核糖苷磷酸化酶;f)具有阻断或降低的活性的改变的烟酰胺核糖苷摄取性转运体;g)具有阻断或降低的活性的改变的烟酸磷酸核糖基转移酶;h)具有添加或增加的活性的改变的烟酰胺单核苷酸酰胺水解酶;以及i)具有添加或增加的活性的改变的烟酸单核苷酸水解酶;其中,与没有任何该修饰的细菌相比,具有至少一种该修饰的细菌产生了增加量的nar。
例如,在一个实施方式中,本发明涉及一种能够产生烟酸核糖苷的经遗传修饰的细菌,其中该细菌包括下列修饰:i)在具有编码这些活性的基因或其组合的增加的转录的宿主中的改变或增加的l-天冬氨酸氧化酶活性,改变或增加的喹啉合酶活性,改变或增加的喹啉磷酸核糖焦磷酸活性或其组合,以及ii)选自以下所组成的组的一种或多种额外的修饰:a)具有阻断或降低的活性的改变的烟酸核糖苷激酶;b)具有阻断或降低的活性的改变的烟酸核糖苷磷酸化酶;c)具有阻断或降低的活性的改变的烟酸核糖苷转运蛋白;d)具有阻断或降低的活性的改变的烟酸磷酸核糖基转移酶;e)具有添加或增加的活性的改变的烟酰胺单核苷酸酰胺水解酶;以及f)具有添加或增加的活性的改变的烟酸单核苷酸水解酶;其中,与没有任何该修饰的细菌相比,具有至少一种该修饰的细菌产生了增加量的nar。
在另一个实施方式中,本发明涉及一种能够产生烟酸核糖苷的经遗传修饰的细菌,其中该细菌包括下列修饰:i)具有阻断或降低的活性的改变的烟酸单核苷酸腺苷转移酶;以及ii)选自以下所组成的组的一种或多种额外的修饰:a)具有阻断或降低的活性的改变的烟酸核糖苷激酶;b)具有阻断或降低的活性的改变的烟酸核糖苷磷酸化酶;c)具有阻断或降低的活性的改变的烟酸核糖苷转运蛋白;d)具有阻断或降低的活性的改变的烟酸磷酸核糖基转移酶;e)具有添加或增加的活性的改变的烟酰胺单核苷酸酰胺水解酶;以及f)具有添加或增加的活性的改变的烟酸单核苷酸水解酶;其中,与没有任何该修饰的细菌相比,具有至少一种该修饰的细菌产生了增加量的nar。
在一个实施方式中,具有降低的活性的烟酸单核苷酸腺苷转移酶对于宿主细菌来说是外源的,即,在修饰之前不存在于细胞中,其已使用如本文所述的重组方法引入。
在另一个实施方式中,上述的其他蛋白质对于宿主细菌来说是内源的,即,在修饰之前存在于细胞中,然而可进行交替以增加或降低蛋白质的表达水平。在本发明中表达水平发生改变的内源蛋白质的实例包括,但不限于,烟酸单核苷酸腺苷转移酶、nad+生物合成的负调节物、烟酸核糖苷激酶、烟酸核糖苷磷酸化酶、烟酸核糖苷转运蛋白、烟酸磷酸核糖基转移酶、烟酰胺单核苷酸酰胺水解酶和烟酸单核苷酸水解酶。
宿主细菌细胞可以通过本领域的技术人员已知适合于该目的的任何方式进行遗传修饰。这包括将感兴趣的基因,诸如编码具有降低的活性的烟酸单核苷酸腺苷化蛋白的基因引入质粒或粘粒或能够在宿主细胞内繁殖的其他表达载体中。替代地,质粒或粘粒dna或部分质粒或粘粒dna或线性dna序列可以整合至宿主基因组中,例如,通过同源重组或随机整合来进行。为了进行遗传修饰,能够通过天然摄取或通过公知的进程,诸如电穿孔来将dna引入或转化至细胞中。遗传修饰可能涉及在引入的启动子的控制下的基因表达。引入的dna可以编码一种蛋白质,其可以充当酶或可以调节其他基因的表达。
能够使用经典的菌株开发和/或分子遗传技术来实现微生物的遗传修饰。这种技术在本领域中是已知的且通常被公开用于微生物,例如,在sambrook等,1989,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlabspress中所述的。参考文献sambrook等ibid的全部内容通过引用并入本文。
合适的多核苷酸可以通过随机整合、同源重组被引入细胞中和/或可以形成包括基因组合的表达载体的一部分。这种表达载体形成了本发明的另一个方面。
用于构建这种表达载体的合适载体在本领域中是公知的,且可以被布置成包括可操作性连接至一个或多个表达控制序列的多核苷酸,以用于在宿主细胞中表达所需的酶,例如,如上所述的细菌。例如,包括但不限于,t7启动子、plac启动子、nudc启动子、usha启动子的启动子能够与内源基因和/或异源基因结合使用以用于修饰靶向基因的表达模式。类似地,示例性终止子序列包括但不限于使用xpr1、xpr2、cpc1终止子序列。
在一些实施方式中,如本说明书中通篇所述,重组或经遗传修饰的细菌细胞可以是任何革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌,包括但不限于,bacillus、corynebacterium、escherichia、acinetobacter、lactobacillus、mycobacterium、pseudomonas和ralstonia属。在某些实施方式中,示例性细菌种类包括但不限于bacillussubtilis、corynebacteriumglutamicum、escherichiacoli、acinetobacterbaylyi和ralstoniaeutropha。
本公开的经遗传修饰的细菌还包含包括如本文定义的多肽的变体的细菌。如本文所使用的,“变体”是指由于在一个或多个(几个)位置上进行了一个或多个(几个)氨基酸残基的替代、插入和/或缺失而使氨基酸序列不同于碱基序列的多肽,该氨基酸序列是从碱基序列衍生出来的。替代是指用不同的氨基酸取代占据一个位置的氨基酸;缺失是指去除占据一个位置的氨基酸;且插入是指在邻近占据一个位置的氨基酸处添加1-3个氨基酸。
变体是功能变体,这是因为变体序列具有与具有本文指定的天然氨基酸序列的酶相似或相同的功能酶活性特征。
例如,seqidno:4的功能变体具有与seqidno:4相似或相同的烟酸单核苷酸腺苷转移酶活性特征。一个实例可以是通过seqidno:4的功能变体进行的烟酸单核苷酸至烟酸腺嘌呤二核苷酸的转化率可以是相同或相似的,然而该功能变体还可以提供其他益处。例如,当使用为seqidno:4的功能变体的酶时,将实现该速率的至少约80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。
因此,上述seqidno氨基酸序列中的任一个的功能变体或片段是保持在相同酶类别(即具有相同ec编号)内的任何氨基酸序列。确定酶是否落在特定类别内的方法是技术人员所公知的,该技术人员能够在不使用本发明的技术的情况下确定酶的类别。合适的方法可以例如,从国际生物化学与分子生物学联盟获得。
氨基酸替代可以被认为是“保守性的”,其中氨基酸被具有广义上类似的特性的不同氨基酸替代。非保守性替代是氨基酸被不同类型的氨基酸取代的地方。
“保守性替代”是指用同一类别的另一种氨基酸替代氨基酸,其中类别的定义如下:
氨基酸类别实例:
非极性的:a、v、l、i、p、m、f、w
非荷电极性的:g、s、t、c、y、n、q
酸性的:d、e
碱性的:k、r、h。
本发明还涉及从上述经遗传修饰的细菌中的任一个获得的烟酸核糖苷化合物。
本发明还涉及一种组合物,其包含从上述经遗传修饰的细菌获得的烟酸核糖苷化合物。
将理解的是,从本发明的经遗传修饰的细菌分离的烟酸核糖化合物能够被重新配制成最终产物。在本公开的一些其他实施方式中,在宿主细胞的背景下,通过如本文所述操纵的宿主细胞产生的烟酸核糖化合物被掺入最终产物(例如,食物或饲料补充剂、药物等)中。例如,宿主细胞可以进行冻干、冷冻干燥、冷冻或其他方式的灭活,且随后全细胞可以被掺入最终产物中或用作最终产物。宿主细胞也可以在掺入产物中之前进行处理,以增加生物利用度(例如,经由裂解进行)。
在本公开的一些实施方式中,将产生的烟酸核糖化合物掺入食物或饲料(例如,食物补充剂)的组分中。根据本发明能够将烟酸核糖化合物掺入至的食品类型没有特别的限制,且包括饮料,诸如牛奶、水、软饮料、能量饮料、茶和果汁;甜点,诸如果冻和饼干;含脂肪的食物和饮料,诸如乳制品;加工食品,诸如大米、面包、早餐麦片等。在一些实施方式中,所产生的烟酸核糖化合物被掺入膳食补充剂,诸如,例如,复合维生素中。
附图说明
图1:使用e.coli命名的用于在nada和nadb酶的存在下从天冬氨酸和磷酸二羟丙酮合成喹啉的生化途径。
图2:使用e.coli命名的用于合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的生化途径和酶。
图3:使用e.coli命名的用于从nad+生物合成的中间物产生烟酸核糖苷的生化途径。
图4:使用e.coli命名的用于产生烟酸核糖苷的具有不良活性的生化途径。atp:三磷酸腺苷;prpp:5-磷酸-α-d-核糖1-二磷酸;ppi:二磷酸盐;pi:磷酸盐。
图5:在菌株me517的补料分批发酵期间的烟酸核糖苷水平。
序列表的概述
使用核苷酸碱基的标准字母缩写来显示在所附序列表中列出的核酸序列。仅显示了每个核酸序列的一条链,但要理解的是对所显示的链的任何参考均包括互补链。在所附序列表中:
seqidno:1为编码是抑制蛋白的三功能性的escherichiacolinadr酶(nmn合成酶、nar激酶、nad+生物合成的负调节物)的氨基酸序列。
seqidno:2为编码是抑制蛋白的bacillussubtilisyxra酶的氨基酸序列。
seqidno:3为编码是抑制蛋白的corynebacteriumglutamicumcgr_1153酶的氨基酸序列。
seqidno:4为编码是烟酸单核苷酸腺苷转移酶的escherichiacolinadd酶的氨基酸序列。
seqidno:5为编码是烟酸单核苷酸腺苷转移酶的bacillussubtilisnadd酶的氨基酸序列。
seqidno:6为编码是烟酸单核苷酸腺苷转移酶的corynebacteriumglutamicumnaddcg2584酶的氨基酸序列。
seqidno:7为编码是烟酸核糖苷磷酸化酶的escherichiacolideod酶的氨基酸序列。
seqidno:8为编码是烟酸核糖苷磷酸化酶的bacillussubtilisdeod酶的氨基酸序列。
seqidno:9为编码是nar转运蛋白的acinetobacterbaylyipnuc酶的氨基酸序列。
seqidno:10为编码是nar转运蛋白的corynebacteriumglutamicumpnuc酶的氨基酸序列。
seqidno:11为编码是nar转运蛋白的escherichiacolipnuc酶的氨基酸序列。
seqidno:12为编码是烟酸单核苷酸水解酶的escherichiacoliusha酶的氨基酸序列。
seqidno:13为编码是烟酸单核苷酸水解酶的bacillussubtilisyfkn酶的氨基酸序列。
seqidno:14为编码是烟酸单核苷酸水解酶的corynebacteriumglutamicumcg0397酶的氨基酸序列。
seqidno:15为编码是烟酸磷酸核糖基转移酶的escherichiacolipncb酶的氨基酸序列。
seqidno:16为编码是烟酸磷酸核糖基转移酶的bacillussubtilisyuek酶的氨基酸序列。
seqidno:17为编码是烟酸磷酸核糖基转移酶的corynebacteriumglutamicumcg2774酶的氨基酸序列。
seqidno:18为编码是烟酸核糖苷磷酸化酶的bacillussubtilispupg酶的氨基酸序列。
seqidno:19为编码是烟酸核糖苷磷酸化酶的bacillussubtilispdp酶的氨基酸序列。
seqidno:20为编码是烟酰胺单核苷酸酰胺水解酶的escherichiacolipncc酶的氨基酸序列。
seqidno:21为编码是烟酰胺单核苷酸酰胺水解酶的bacillussubtiliscina酶的氨基酸序列。
seqidno:22为编码是烟酰胺单核苷酸酰胺水解酶的corynebacteriumglutamicumcg2153酶的氨基酸序列。
seqidno:23为编码是喹啉合酶的escherichiacolinada酶的氨基酸序列。
seqidno:24为编码是喹啉合酶的bacillussubtilisnada酶的氨基酸序列。
seqidno:25为编码是喹啉合酶的corynebacteriumglutamicumnada酶的氨基酸序列。
seqidno:26为编码是l-天冬氨酸氧化酶的escherichiacolinadb酶的氨基酸序列。
seqidno:27为编码是l-天冬氨酸氧化酶的bacillussubtilisnadb酶的氨基酸序列。
seqidno:28为编码是喹啉磷酸核糖基转移酶的escherichiacolinadc酶的氨基酸序列。
seqidno:29为编码是喹啉磷酸核糖基转移酶的bacillussubtilisnadc酶的氨基酸序列。
seqidno:30为编码是喹啉磷酸核糖基转移酶的corynebacteriumglutamicumnadc酶的氨基酸序列。
以下实例旨在说明本发明而不以任何方式限制其范围。
实施例
实施例1:破坏nad+生物合成的负调节物
本文所述的所有基础分子生物学和dna操纵程序通常是根据sambrook等或ausubel等(j.sambrook、e.f.fritsch、t.maniatis(编辑).1989.molecularcloning:alaboratorymanual.coldspringharborlaboratorypress:newyork;以及f.m.ausubel、r.brent、r.e.kingston、d.d.moore、j.g.seidman、j.a.smith、k.struhl(编辑).1998.currentprotocolsinmolecularbiology.wiley:newyork)来执行的。
编码nad+生物合成的负调节物(nadr)的基因的缺失是由λ红介导的重组工程实现的。抗生素基因,例如具有卡那霉素抗性或氯霉素抗性的,是使用寡核苷酸来进行pcr扩增的,该寡核苷酸具有与在天然nadr开放阅读框的上游和下游的区域同源的为20-50bps的侧翼。替代地,这些侧翼可以在开放阅读框内,导致非功能性蛋白质的翻译。宿主菌株,例如bl21(de3),是通过所述的(datsenko和wanner,2000)pkd46的转化和诱导来进行制备以用于λ红重组工程的。所制备的细胞通过电穿孔或化学转化进行转化,且通过pcr来筛选转化体以成功破坏靶向基因。
实施例2:增强从l-天冬氨酸、磷酸二羟丙酮和1-α-d-核糖焦磷酸至烟酸单核苷酸的转化
通过在e.coli中由nadb基因编码的l-天冬氨酸氧化酶将天冬氨酸氧化成亚氨基琥珀酸。该实施例描述了e.coli菌株的构建,其改变了天然nadb基因的表达。
将nadb基因置于强组成型启动子的控制下。编码e.colinadb基团的dna片断是通过pcr克隆或从头dna合成获得的。在dna是通过合成获得的情况下,优化密码子的使用以在e.coli中进行表达。dna的合成和优化是由genscript,inc.进行的。nadb基因在诱导型启动子的控制下在e.coli中进行表达。例如,将开放阅读框克隆至xhoi/ndei-消化pet24,产生质料pet24-nadb。转化至携带t7聚合酶的菌株,诸如bl21(de3)中允许对nadb基因进行iptg诱导,以便促进nar合成。
替代地,天然nadb基因的表达还能够通过将nadb基因置于诱导型启动子的控制下来进行改变。编码诱导型或组成型启动子,诸如阿拉伯糖诱导型pbad或组成型plac启动子的dna片断是通过pcr克隆或从头dna合成获得的。启动子通过融合pcr在抗生素基因,例如具有卡那霉素抗性或氯霉素抗性的基因的下游融合。该标记-启动子盒将含有为20-50bps的侧翼,其与在天然nadb启动子上游的区域且与nadr开放阅读框的第一核苷酸同源。宿主菌株,例如bl21(de3),是通过所述的(datsenko和wanner,2000)pkd46的转化和诱导来进行制备以用于λ红重组工程的。所制备的细胞通过电穿孔或化学转化进行转化,且通过pcr来筛选转化体以成功掺入改变的启动子序列。
含有铁-硫簇的喹啉合酶随后进行亚氨基琥珀酸与磷酸二羟丙酮的缩合和环化,产生喹啉,且通过nada基因在e.coli中进行编码。该实施例描述了e.coli菌株的构建,其改变了天然nada基因的表达。
将nada基因置于强组成型启动子的控制下。编码e.colinada基团的dna片断是通过pcr克隆或从头dna合成获得的。在dna是通过合成获得的情况下,优化密码子的使用以在e.coli中进行表达。dna的合成和优化是由genscript,inc.进行的。nada基因在诱导型启动子的控制下在e.coli中进行表达。例如,将开放阅读框克隆至xhoi/ndei-消化pet24,产生质料pet24-nada。转化至携带t7聚合酶的菌株,诸如bl21(de3)中允许对nada基因进行iptg诱导,以便促进nar合成。
替代地,天然nada基因的表达还能够通过将nadb基因置于诱导型启动子的控制下来进行改变。编码诱导型或组成型启动子,诸如阿拉伯糖诱导型pbad或组成型plac启动子的dna片断是通过pcr克隆或从头dna合成获得的。启动子通过融合pcr在抗生素基因,例如具有卡那霉素抗性或氯霉素抗性的基因的下游融合。该标记-启动子盒将含有为20-50bps的侧翼,其与在天然nadb启动子上游的区域且与nada开放阅读框的第一核苷酸同源。宿主菌株,例如bl21(de3),是通过所述的(datsenko和wanner,2000,proc.natl.acad.u.s.a.97(12):6640-5.)pkd46的转化和诱导来进行制备以用于λ红重组工程的。所制备的细胞通过电穿孔或化学转化进行转化,且通过pcr来筛选转化体以成功掺入改变的启动子序列。
喹啉磷酸核糖基转移酶将磷酸核糖基部分从磷酸核糖焦磷酸转移至喹啉氮并催化中间物的后续脱羧以产生烟酸单核苷酸且通过nadc基因在e.coli中进行编码。该实施例描述了e.coli菌株的构建,其改变了天然nadc基因的表达。
将nadc基因置于强组成型启动子的控制下。编码e.colinadc基团的dna片断是通过pcr克隆或从头dna合成获得的。在dna是通过合成获得的情况下,优化密码子的使用以在e.coli中进行表达。dna的合成和优化是由genscript,inc.进行的。nadc基因在诱导型启动子的控制下在e.coli中进行表达。例如,将开放阅读框克隆至xhoi/ndei-消化pet24,产生质料pet24-nadc。转化至携带t7聚合酶的菌株,诸如bl21(de3)中允许对nadc基因进行iptg诱导,以便促进nar合成。
替代地,天然nadc基因的表达还能够通过将nadc基因置于诱导型启动子的控制下来进行改变。编码诱导型或组成型启动子,诸如阿拉伯糖诱导型pbad或组成型plac启动子的dna片断是通过pcr克隆或从头dna合成获得的。启动子通过融合pcr在抗生素基因,例如具有卡那霉素抗性或氯霉素抗性的基因的下游融合。该标记-启动子盒将含有为20-50bps的侧翼,其与在天然nadc启动子上游的区域且与nadc开放阅读框的第一核苷酸同源。宿主菌株,例如bl21(de3),是通过所述的(datsenko和wanner,2000)pkd46的转化和诱导来进行制备以用于λ红重组工程的。所制备的细胞通过电穿孔或化学转化进行转化,且通过pcr来筛选转化体以成功掺入改变的启动子序列。
替代地,通过在操纵子中的表达来实现nada、nadb和nadc的表达。编码e.colinada、nadb和nadc基团的dna片断是通过pcr克隆或从头dna合成获得的。在dna是通过合成获得的情况下,优化密码子的使用以在e.coli中进行表达。dna合成和优化是由genscript,inc进行的。每个基因被连接至5’核糖体结合位点和3’终止子序列。操纵子在诱导型启动子的控制下在e.coli中进行表达。例如,将开放阅读框克隆至xhoi/ndei-消化pet24,产生质料pet24-nadabc。转化至携带t7聚合酶的菌株,诸如bl21(de3)中允许对nadabc基因进行iptg诱导,以便促进nar合成。
实施例3:阻断或减少从烟酸单核苷酸(namn)至烟酸腺嘌呤二核苷酸(naad)的转化
在e.coli和b.subtilis中,通过酶nadd使namn腺苷酸化。酶活性对于活力来说是必需的,这是因为对nad+的所有补救和从头途径均需要该腺苷酸化活性,然而,高水平namn的累积对于nar的产生来说是理想的。用诱导型启动子取代nadd基因可阻止这些竞争反应,促进namn的过度产生。替代地,已经表征了具有降低的酶活性的nadd基因的等位基因。用具有较低底物亲和力的等位基因取代天然nadd基因将降低nadd酶活性对namn水平的影响。
许多诱导型启动子已经在e.coli进行了描述且进行了良好的表征。在这个实施例中,源于e.coli的iptg诱导型laci启动子通过融合pcr在抗生素基因,例如具有卡那霉素抗性或氯霉素抗性的基因的下游进行融合。该标记-plac盒将含有为20-50bps的侧翼,其与天然nadd启动子周围区域同源。宿主菌株,例如bl21(de3),是通过所述的(datsenko和wanner,2000)pkd46的转化和诱导来进行制备以用于λ红重组工程的。所制备的细胞通过电穿孔或化学转化进行转化,且通过pcr和定序来筛选转化体以成功掺入代替天然nadd启动子的lac启动子序列。
已经描述了具有较低活性但仍然能够支持在基本培养基上生长的e.colinadd基因的等位基因,例如n40a或t11a。这些突变用于为namn增加nadd的km,从而增加细胞内的namn浓度。经由stragene
实施例4:增强从烟酸单核苷酸(namn)至烟酸核糖苷(nar)的转化
通过usha基因经由在e.coli中进行编码的周质酸性磷酸酶将分泌的namn去磷酸化成nar。该实施例描述了e.coli菌株的构建,其改变了天然usha基因的表达。
为了确保使nmn去磷酸化,将usha基因置于强组成型启动子的控制下。编码e.coliusha基团的dna片断是通过pcr克隆或从头dna合成获得的。在dna是通过合成获得的情况下,优化密码子的使用以在e.coli中进行表达。dna的合成和优化是由genscript,inc.进行的。usha基因在诱导型启动子的控制下在e.coli中进行表达。例如,将开放阅读框克隆至xhoi/ndei-消化pet24,产生质料pet24-usha。转化至携带t7聚合酶的菌株,诸如bl21(de3)中允许对usha基因进行iptg诱导,以便促进nar合成。
替代地,天然usha基因的表达还能够通过将usha基因置于诱导型启动子的控制下来进行改变。编码诱导型或组成型启动子,诸如阿拉伯糖诱导型pbad或组成型plac启动子的dna片断是通过pcr克隆或从头dna合成获得的。启动子通过融合pcr在抗生素基因,例如具有卡那霉素抗性或氯霉素抗性的基因的下游融合。该标记-启动子盒将含有为20-50bps的侧翼,其与在天然usha启动子上游的区域且与usha开放阅读框的第一核苷酸同源。宿主菌株,例如bl21(de3),是通过所述的(datsenko和wanner,2000)pkd46的转化和诱导来进行制备以用于λ红重组工程的。所制备的细胞通过电穿孔或化学转化进行转化,且通过pcr来筛选转化体以成功掺入改变的启动子序列。
实施例5:破坏烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)的补救途径
编码核苷磷酸化酶(deod)、烟酸/烟酰胺激酶(nadr)的基因和编码烟酰胺核糖苷摄取性转运体(pnuc)的基因的缺失是单独地或组合地由λ红介导的重组工程实现的。抗生素基因,例如具有卡那霉素抗性或氯霉素抗性的,是使用寡核苷酸来进行pcr扩增的,该寡核苷酸具有与在天然deod、nadr或pnuc开放阅读框的上游和下游的区域同源的为20-50bps的侧翼。替代地,这些侧翼可以在开放阅读框内,导致非功能性蛋白质的翻译。宿主菌株,例如bl21(de3),是通过所述的(datsenko和wanner,2000)pkd46的转化和诱导来进行制备以用于λ红重组工程的。所制备的细胞通过电穿孔或化学转化进行转化,且通过pcr来筛选转化体以成功破坏靶向基因。这些基因敲除可以通过如上所述用于启动子交换的抗生素基因与用于这些基因的表达盒的装配来与nadr的基因敲除(如在实施例1中公开的)或对nadd活性的修改(如在实施例2中公开的)相结合。
实施例6:细胞生长条件和方案
工程化用于生产nar的e.coli菌株被接种在含有合适的抗生素的lb培养基中并在37℃下生长过夜。洗涤细胞在具有5%葡萄糖的m9培养基中重悬并在37℃生长3天。在适当的情况下,将iptg添加至10-50um的浓度以进行诱导。
实施例7:构建具有升高水平的nar产生的b.subtilis菌株
通过长侧翼pcr(lf-pcr)构建用于nadr、deod和pupg精确缺失的盒。用于每个基因的侧翼区是通过扩增具有表5中的引物的bs168基因组dna(罗氏高纯度pcr模板制备试剂盒)获得的,其被设计成使得与适当的抗生素抗性基因(分别为壮观霉素、四环素和新霉素,seqidno:48至50)的5’或3’区域同源的序列被掺入pcr产物中(phusionhotstartflexdna聚合酶,每个引物200nm,@95℃下进行2分钟的预变性,进行30个循环:@95℃下进行30秒;@50℃下进行20秒;@72℃下进行60秒,最后在72℃保持7分钟)。类似地,用引物对抗生素抗性基因进行扩增以掺入与5’和3’侧翼区同源的序列。pcr产物进行凝胶纯化并用于以适当的引物(表5)进行lf-pcr(phusionhotstartflexdna聚合酶,每个引物200nm,每个pcr产物150ng,@98℃下进行30秒的预变性,进行35个循环:@98℃下进行30秒;@55℃下进行30秒;@72℃下进行360秒)。lf-pcr产物被纯化并被用于b.subtilis菌株的转化。
经自然转化用lf-pcr产物转化bs168(“用于bacillus的分子生物学方法”,1990,由c.rharwood和s.m.cutting.johnwileyandsons编辑),产生bs6209(nadr::spe)、me479(deod::tet)和me492(pupg::neo)。源于me492的基因组dna(如上述方式制备的)被用于转化bs6209,产生me496(nadr::spepupg::neo)。源于me479的基因组dna(如上述方式制备的)被用于转化me496,产生me517(nadr::spepupg::neodeod::tet)。
实施例8:产生烟酸核糖苷
使me517在含有50ml的种子(每升:30gyeal浸液肉汤、5g细菌培养用酵母提取物、10g山梨糖醇、1滴basildon86/013消泡剂)培养基的500ml带挡板烧瓶中在37℃下生长8小时。1ml的预培养物被用于在2l带挡板烧瓶中接种300ml的种子培养基并在37℃下生长16小时。80ml的该种子发酵物被用于接种至产生容器(nbs),其含有1.2l的分批培养基(1096gh2o、26.4g右旋糖、9.6gkh2po4、3.6gmgso4*7h2o、0.24gcacl2*h2o、2.5g左旋色氨酸、0.036gmncl2、18gmh4no3、0.12g柠檬酸钠、0.24mlclerol消泡剂、12mgna2edta*2h2o、57.5mgznso4*7h2o、3.2mgmnso4*h2o、3.2mgcuso4、4.8mgna2moo4*2h2o、cocl2*6h2o、28mgfeso4*7h2o)。搅拌最初被设定在400rpm,通过添加nh4oh来将ph保持在6.8,且将温度设定在37℃。在消耗分批碳期间,通过根据需要增加搅拌来将do保持在60%以上,且在消耗分批碳之后,通过葡萄糖进料将do保持在60%。烟酸核糖苷按下文所述的方式进行定量且在图5中示出其结果。
实施例9:检测在产生培养物中的烟酸核糖苷
产生培养物在含有20%乙腈和0.1%甲酸的水中稀释10倍且进行离心。
通过液相色谱/质谱(lcms)分析来分析nar和中间物。在离心(5000xg,10m)之前,用70%乙腈将20μl的肉汤在ph为9.8的水性5mm乙酸铵中按1:50进行稀释。去除上清液并将其按5μl的部分注入hilichplc柱(watersatlantisc18,2.1x150mm)。使用从具有70%乙腈ph为9.8的5mm乙酸铵(a)至ph为9.8的5mm乙酸铵(b)线性梯度按50ul/分钟的流速将化合物洗脱20分钟以上,接下来在b中保持5分钟且在a中进行10分钟的再平衡。使用正电喷雾电离来用三重四极杆质谱仪检测洗脱化合物。该仪器以mrm模式操作以检测nar。nar是通过与在相同条件下注入的标准物(sigmaaldrich)比较来进行定量的。
序列表
<110>帝斯曼知识产权资产管理有限公司
<120>烟酸核糖苷的微生物生产
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