专利名称：一种膜培养筛选鸟苷高产菌的方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体来说是一种鸟苷(Guanosine)高产菌筛选的方法。
背景技术：
鸟苷又名鸟嘌呤核苷或9-( P -D-呋喃核糖基)鸟嘌呤(9-(3 -D-Ribofuranosyl)guanine 鸟嘌呤-9-0 -D-呋喃核糖苷(Guanine-9-0 -D-ribofuranoside)。鸟苷的用途十分广泛，可用于合成食品增鲜剂一5’ -鸟苷酸二钠、呈味核苷酸二钠以及作为医药产品的重要中间体，可形成一系列的下游医药产品，包括核苷类抗病毒药物如利巴韦林、阿昔洛韦等，也是用于制造无环鸟苷(Acyclovir)、三氮唑核苷(ATC)、三磷酸鸟苷钠(GTP)等药物的主要原料。小西等人，通过解除MP脱氢酶的反馈抑制，选育的抗8-氮鸟嘌呤等突变株，把肌苷生产株变为具有产鸟苷能力的突变株；松井等人由枯草芽孢杆菌为出发菌株，诱导具 有甲硫氨酸亚砜突变株，进一步提高鸟苷的产量；Hiroshi Matsui等人进一步筛选出具有阿洛酮糖素抗性和德夸菌素抗性的突变株，增大了鸟苷的积累。但由于鸟苷生产菌是缺陷性生产菌株，在保藏，生产，传代过程中鸟苷高产菌株不可避免的发生负变，造成鸟苷的产量下降，必须进行定期的筛选和复壮。但传统的稀释涂平板法但从菌落形态上很难分辨出高产和负变菌株，初筛很盲目，增大了工作量，而准确度不高，造成筛选周期长，重复工作等弊病。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术而提出一种膜培养筛选鸟苷高产菌的方法，该方法可以应用在鸟苷的大规模工业生产中，快速准确地进行鸟苷高产菌的筛选和复壮。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是一种膜培养筛选鸟苷高产菌的方法，包括有以下步骤
1)将待筛选和复壮的鸟苷生产菌加入灭菌蒸馏水，置振荡器上，混合均匀，制成稀释度为KT2-KT7的菌悬液；
2)将菌悬液接种至膜培养系统中，静置培养；
3)根据膜培养系统中鸟苷生产菌的菌落大小和形态进行判断，初筛出鸟苷高产菌株和负变菌株。按上述方案，所述的膜培养系统由三部分组成，培养皿的底层为步骤I)所述的菌悬液混匀的营养成分不丰富的琼脂培养基，中层为微孔滤膜，上层为浸润了营养丰富的培养液的灭菌滤纸。按上述方案，所述的微孔滤膜孔径为0. 02 ii m,直径为V85mm的聚碳酸酯微孔滤膜。按上述方案，所述的营养成分不丰富的琼脂培养基为双酶糖30±5 g/L，蛋白胨1±0.5 g/L，磷酸二氢钾4±0.5 g/L，硫酸铵6±2g/L，氯化钠1±0. 5 g/L，碳酸钙20±5g/L和硫酸镁3±2 g/L。按上述方案，所述的营养成分丰富的的培养液为酵母粉35±5 g/L，酵母膏10±5g/L和玉米浆10±2 g/L。按上述方案，静置培养条件为28°C -38 °C，培养时间为30 h_44 h。按上述方案，膜培养系统的制备方法为待培养皿的底层的营养成分不丰富的琼脂培养基凝固，培养6 h-8 h后，在其上置一层灭菌的聚碳酸酯微孔滤膜，其上层再布置浸润了营养丰富的培养液的灭菌滤纸，于28°C -38°C继续培养22 h_36 h。按上述方案，步骤3)中的判断方法是膜培养系统中同样条件下生长快，菌落大而润泽的单菌落，为负变菌株，产苷量较低；生长较慢，菌落小而干燥的单菌落，为高产菌株。
按上述方案，初筛后还包括进一步复筛，通过将筛选出的高产菌株和负变菌株接入摇瓶，28°C-38°C，转速200 rpm-300 rpm，培养30 h_48 h，取离心后，清液采用HPLC法，准确测定鸟苷的产量。本发明的有益效果在于通过此方法筛选到的鸟苷高产菌，摇瓶培养产苷达18-20g/L。该方法新颖，实施简便，筛选准确率远高于传统筛选方法，对于工厂高产菌株日常的分离，筛选工作起到了提高效率，增加准确率和减少工作量的优化作用。
图I为膜培养系统的结构示意 图2为应用实施例I鸟苷甘油保藏菌膜培养法筛选结果；
图3为应用实施例2鸟苷斜面保藏菌膜培养法筛选结果；
图4为应用实施例3鸟苷发酵菌液膜培养法筛选结果；
图5为应用实施例4鸟苷诱变后的菌株培养法筛选结果。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步详细的说明，但是此说明不会构成对本发明的限制。鸟苷的初筛
将待筛选的鸟苷生产菌加入一定量的灭菌培养基，置振荡器上，混合均勻，制成一定浓度梯度菌悬液，在培养皿的底层注入用菌悬液混匀的营养成分不丰富的琼脂培养基，待凝固后，接种至培养基中，静置培养6 h-8 h。再在培养基上层置一层灭菌的0.02 pm的聚碳酸酯微孔滤膜，滤膜的上层置浸润了营养丰富的培养液的灭菌滤纸，28°C -38°C，继续培养至30 h-44 h。根据培养系统中鸟苷生产菌的菌落大小和形态，初筛出鸟苷高产菌。膜培养系统中同样条件下生长快，菌落大而润泽的单菌落，为负变菌株，产苷量较低；生长较慢，菌落小而干燥的单菌落，为高产菌株。鸟苷的复筛
为了准确确定选出菌株的鸟苷生产能力，对初筛出的菌株进行进一步复筛，特征如下将筛选出的高产菌株和负变菌株接入摇瓶，28°C-38°C，转速200 rpm-. 300 rpm，培养30h-48 h。取离心后，清液采用HPLC法检测，HPLC法条件如下安捷伦HPLC (1100型)工作站(HP Chem station),色谱条件C18 柱(4. 6X 250mm, 10 u m);流动相乙腈-水(3:97),柱温30°C，流速I mL/min，进样量15iiL ;检测波长为260 nm。准确测定鸟苷的产量。并确定采用膜培养系统方法筛选的准确率。实施例I :
一种膜培养筛选鸟苷高产菌的方法，包括有以下步骤将待筛选和复壮的鸟苷生产菌加入灭菌蒸馏水，置振荡器上，混合均匀，制成稀释度为10_5的菌悬液；将菌悬液接种至膜培养系统中进行静置培养，静置培养条件为37°C，培养时间为40h ;根据膜培养系统中鸟苷生产菌的菌落大小和形态，初筛出鸟苷高产菌株和负变菌株，判断标准是膜培养系统中同样条件下生长快，菌落大而润泽的单菌落，为负变菌株，产苷量较低；生长较慢，菌落小而干燥的单菌落，为高产菌株。本发明所述的膜培养系统由三部分组成，如图1，培养皿的底层为菌悬液混匀的
营养成分不丰富的琼脂培养基1，中层为微孔滤膜2，上层为浸润了营养丰富的培养液的灭菌滤纸3，所述的微孔滤膜为孔径为0. 02 u m，直径为u/85_的聚碳酸酯微孔滤膜，所述的营养成分不丰富的琼脂培养基为双酶糖30±5 g/L，蛋白胨1±0.5 g/L，磷酸二氢钾4±0.5 g/L，硫酸铵6±2g/L，氯化钠1±0. 5 g/L，碳酸钙20±5 g/L和硫酸镁3±2 g/L,所述的营养成分丰富的的培养液为酵母粉35±5 g/L，酵母膏10±5 g/L和玉米浆10±2g/L，其制备方法如下待培养皿的底层的营养成分不丰富的琼脂培养基凝固，培养7h后，在其上置一层灭菌的聚碳酸酯微孔滤膜，滤膜的上层再布置浸润了营养丰富的培养液的灭菌滤纸，于30°C继续培养30 h。初筛后还需进行进一步复筛，即将筛选出的高产菌株和负变菌株接入摇瓶，30°C，转速200 rpm-300 rpm,培养40h，取离心后，清液采用HPLC法，HPLC法条件如下安捷伦HPLC (1100 型)工作站(HP Chem station),色谱条件C18 柱(4. 6X 250mm, 10 y m);流动相乙腈-水(3:97)，柱温30°C，流速I mL/min，进样量15iiL ;检测波长为260 nm，准确测定
鸟苷的产量。下面结合实施例1，对其作出具体应用实施例。应用实施例I 将鸟苷甘油保藏菌采用膜培养法进行筛选
将保藏半年的鸟苷甘油保藏菌制成10-2-10-7菌悬液，接入膜培养系统进行初筛，在37°C下静置培养40 h。根据菌落形态挑选出可能的负变菌和高产菌，接入摇瓶，37°C，转速200 rpm-300 rpm，培养40 h。取离心后清液，采用HPLC法，准确测定鸟苷的产量。摇瓶检测鸟苷产量低于4g/L的为负变菌，鸟苷产量大于15 g/L的为高产菌，计算该筛选方法对负变菌和高产菌识别的准确率。结果见图2。识别负变株6株，平均产苷率3. 15 g/L，准确率75. 00% ;识别高产株9株，平均产苷率16. 36 g/L，准确率100. 00 %。应用实施例2 将鸟苷斜面保藏菌采用膜培养法进行筛选
将保藏一个月的鸟苷斜面保藏菌制成10_2-10_7菌悬液，接入膜培养系统进行初筛，在37°C下静置培养40 h。根据菌落形态挑选出可能的负变菌和高产菌，接入摇瓶，37°C，转速200 rpm-300 rpm，培养40 h。取离心后清液，采用HPLC法，准确测定鸟苷的产量。摇瓶检测鸟苷产量低于4g/L的为负变菌,鸟苷产量大于15 g/L的为高产菌,计算该筛选方法对负变菌和高产菌识别的准确率。结果见图3。识别负变株10株，平均产苷率3.03 g/L，准确率100. 00 %;识别高产株6株，平均产苷率15. 92 g/L，准确率85. 71 %。
应用实施例3将鸟苷发酵菌液采用膜培养法进行筛选
将发酵48小时的鸟苷发酵液制成10_2_10_7菌悬液，接入膜培养系统进行初筛，在37°C下静置培养40 h。根据菌落形态挑选出可能的负变菌和高产菌，接入摇瓶，37 °C，转速200rpm-300 rpm，培养40 h。取离心后清液，采用HPLC法，准确测定鸟苷的产量。摇瓶检测鸟苷产量低于4g/L的为负变菌，鸟苷产量大于15g/L的为高产菌，计算该筛选方法对负变菌和高产菌识别的准确率。结果见图4。识别负变株3株，平均产苷率3.57 g/L，准确率60. 00 %;识别高产株7株，平均产苷率17. 37 g/L，准确率77. 78 %。应用实施例4将鸟苷诱变后的菌株采用采用膜培养法进行筛选
将鸟苷用NTG诱变后的菌株制成10_2-10_7菌悬液，接入膜培养系统进行初筛，在37°C下静置培养40 h根据菌落形态挑选出可能的负变菌和高产菌，接入摇瓶，37°C，转速200rpm-300 rpm,培养40h。取离心后清液，采用HPLC法，准确测定鸟苷的产量。摇瓶检测鸟苷产量低于4g/L的为负变菌,鸟苷产量大于15g/L的为高产菌，计算该筛选方法对负变菌和高产菌识别的准确率。结果见图5。识别负变株6株，平均产苷率3.23 g/L，准确率75. 00 %;识别高产株9株，平均产苷率18. 21 g/L，准确率87. 50 %。膜培养筛选鸟苷高产菌和负变菌的准确率
传统的鸟苷生产菌的分离筛选方法为稀释涂平板法，平板上长出的菌株形态差别不大，随机选择数株，并将挑选出的菌株接入摇瓶培养后，采用HPLC法检测鸟苷的精确含量，并计算出筛选方法的准确率。采用传统法对鸟苷甘油保藏菌和鸟苷斜面保藏菌进行筛选，筛选结果见下表I :
表I传统法筛选鸟苷生产菌的准确性
权利要求
1.一种膜培养筛选鸟苷高产菌的方法，包括有以下步骤 1)将待筛选和复壮的鸟苷生产菌加入灭菌蒸馏水，置振荡器上，混合均匀，制成稀释度为KT2-KT7的菌悬液； 2)将菌悬液接种至膜培养系统中，静置培养； 3)根据膜培养系统中鸟苷生产菌的菌落大小和形态进行判断，初筛出鸟苷高产菌株和负变菌株。
2.根据权利要求I中所述膜培养筛选鸟苷高产菌的方法，其特征在于所述的膜培养系统由三部分组成，培养皿的底层为步骤I)所述的菌悬液混匀的营养成分不丰富的琼脂培养基，中层为微孔滤膜，上层为浸润了营养丰富的培养液的灭菌滤纸。
3.根据权利要求2中所述膜培养筛选鸟苷高产菌的方法，其特征在于所述的微孔滤膜孔径为0. 02 V- m,直径为V 85mm的聚碳酸酯微孔滤膜。
4.根据权利要求2或3中所述膜培养筛选鸟苷高产菌的方法，其特征在于所述的营养成分不丰富的琼脂培养基为双酶糖30±5 g/L，蛋白胨1±0.5 g/L，磷酸二氢钾4±0.5g/L，硫酸铵6±2g/L，氯化钠1±0. 5 g/L，碳酸钙20±5 g/L和硫酸镁3±2 g/L。
5.根据权利要求2或3中所述一种膜培养筛选鸟苷高产菌的方法，其特征在于所述的营养成分丰富的的培养液为酵母粉35±5 g/L，酵母膏10±5 g/L和玉米浆10±2 g/L。
6.根据权利要求I中所述膜培养筛选鸟苷高产菌的方法，其特征在于静置培养条件为28°C -38 °C，培养时间为 30 h-44 h。
7.根据权利要求2中所述膜培养筛选鸟苷高产菌的方法，其特征在于膜培养系统的制备方法为待培养皿的底层的营养成分不丰富的琼脂培养基凝固，培养6 h-8 h后，在其上置一层灭菌的聚碳酸酯微孔滤膜，其上层再布置浸润了营养丰富的培养液的灭菌滤纸，于280C -38°C继续培养 22 h_36 h。
8.根据权利要求I中所述膜培养筛选鸟苷高产菌的方法，其特征在于步骤3)中的判断方法是膜培养系统中同样条件下生长快，菌落大而润泽的单菌落，为负变菌株，产苷量较低；生长较慢，菌落小而干燥的单菌落，为高产菌株。
9.根据权利要求8中所述膜培养筛选鸟苷高产菌的方法，其特征在于初筛后还包括进一步复筛，通过将筛选出的高产菌株和负变菌株接入摇瓶，28°C -38°C，转速200 rpm-300rpm，培养30 h-48 h，取离心后，清液采用HPLC法，准确测定鸟苷的产量。
全文摘要
本发明涉及一种鸟苷高产菌筛选的方法，包括有以下步骤1)将待筛选和复壮的鸟苷生产菌加入灭菌蒸馏水，置振荡器上，混合均匀，制成稀释度为10-2-10-7的菌悬液；2)将菌悬液接种至膜培养系统中，静置培养；3)根据膜培养系统中鸟苷生产菌的菌落大小和形态进行判断，初筛出鸟苷高产菌株和负变菌株。本发明的有益效果在于通过此方法筛选到的鸟苷高产菌，摇瓶培养产苷达18-20g/L。该方法新颖，实施简便，筛选准确率远高于传统筛选方法，对于工厂高产菌株日常的分离，筛选工作起到了提高效率，增加准确率和减少工作量的优化作用。
文档编号C12N1/02GK102757898SQ20121009086
公开日2012年10月31日 申请日期2012年3月31日 优先权日2012年2月15日
发明者户业丽, 程波 申请人:武汉工程大学