专利名称：一种基因拷贝数的定量检测方法
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种基因拷贝数的定量检测方法。
背景技术：
近年来的研究发现，基因拷贝数变异(copy number variants, CNVs)和单核苷酸多态性(SNPs) —样,是分子进化和遗传多态性的重要遗传标志,也是某些疾病的发病分子基础，当前越来越多的CNVs被发现并提交到相应的分子生物学数据库就分子机制而言，CNVs的实质是一段DNA序列的拷贝数变化。某一个体的一套基因组DNA中，正常情况下某等位基因的拷贝数为2个，如果两条染色体上的此基因均缺失则拷贝数为0，如果其中I条染色体上缺失则拷贝数为1，如果其中I条染色体上于此基因序列后又有I段此基因序列则拷贝数为3 (常称之为多拷贝)，如果2条染色体均出现此基因的重复序列，则拷贝数为4等。由于基因拷贝数的差异，往往直接导致所编码蛋白表达量及表达水平的变化，从而导致一系列的生物学效应。就人类而言，CNVs不仅可以为人类进化研究提供信息，且CNVs所导致的生物学效应，涉及到药物敏感性、药物治疗靶点、疾病的发病机制分析、疾病诊断标志物、疾病治疗疗效评估等众多领域，因此，基因CNVs检测有着非常重要的实际意义。基因拷贝数变异可分为基因缺失和基因多拷贝。当前的检测技术方案主要为针对基因缺失及多拷贝分别进行检测与分析，也就是采用一套技术方案检测基因缺失，采取另一套技术方案检测基因多拷贝。目前，检测基因缺失的主要技术是跨越断裂点PCR(gap-PCR)技术；检测基因多拷贝的技术报道较少，比较典型的为采用长片段PCR扩增检测基因三联体(如珠蛋白基因0 1和/或02)。最近，MLPA技术(多重连接探针扩增技术Multiplex ligation-dependent Probe amplification)的开发与应用，虽然能同时检测基因缺失和基因多拷贝，但其检测成本高、操作繁琐、需要特殊的仪器设备等技术限制，不适合常规使用。因此，开发一种准确稳定、简单实用，能同时检测基因缺失和基因多拷贝的常规技术与方法，是当前的迫切需要。生物体基因组中的看家基因(house-keeping gene,如哺乳动物的0肌动蛋白基因、甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因等)，已证实其没有拷贝数变异，即I套基因组中，其无论在什么情况下都是2个拷贝。根据定量PCR的技术原理，结合基因缺失和基因多拷贝的拷贝数变化规律，可以获知当HKG和受检功能基因的均为正常的2个拷贝，且2个PCR反应的扩增效率均为100%，则两者扩增达到一定产物量的循环数相等，即Ct值相等，Ct值差异为0 ;如果功能基因缺失了 I个，则其扩增达一定产物量较HKG多I个循环，即Ct值差异为I ;如果功能基因为3个拷贝，则其扩增达一定产物量较HKG少0. 27个循环，即Ct值差异为-0. 27 ；如果功能基因完全缺失(拷贝数为0)，就不会有其扩增曲线及Ct值。根据上述规律，结合目前广泛应用的多重TaqMan实时定量PCR技术，通过体系优化及调整，其分析灵敏度可达到的Ct值差异为0. 8 I. 0，故能准确检测功能基因O、1、2拷贝，但不能准确分析Ct值差异仅为0. 27的3个拷贝，故多重TaqMan实时定量PCR技术也存在一定的局限性。因此，如果能发明有效的技术与方法，使功能基因缺失和多拷贝所导致的Ct值差异增大，以达到定量PCR技术的灵敏度有效范围，也就能应用定量PCR技术实现基因缺失和多拷贝的同时快速检测。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基因拷贝数的定量检测方法。本发明所采取的技术方案为
一种基因拷贝数的定量检测方法，包括如下步骤
1)分别选取目的基因、参比基因的扩增序列；
2)分别设计目的基因和参比基因扩增序列的引物、荧光探针，及目的基因扩增序列的封闭探针，封闭探针包括上游封闭探针和下游封闭探针；
3)样本检测以待检DNA样本作为模板，对目的基因和参比基因进行多重TaqMan荧光定量PCR反应，并以目的基因拷贝数已知的DNA样本为对照样本，分别记录Ct值；
4)结果分析计算待检样本目的基因的拷贝数相对定量值，判断分析检测样本目的基因的拷贝数。优选的，封闭探针的3’末端经过修饰失去了延伸能力。优选的，目的基因的引物、封闭探针分别与目的基因的结合位点相同。优选的，目的基因、参比基因的引物的5’末端分别引入了 4 7bp与基因组模板非互补的碱基序列。优选的，封闭探针比目的基因的引物的Tm值高3 5°C。优选的，增加封闭探针3’末端与目的基因的结合位点，使封闭探针比目的基因的引物的Tm值高3 5°C。优选的，扩增序列为一段GC含量40 60%、长度70 150bp的DNA序列，且与基因非扩增区无同源序列。优选的，封闭探针的3’末端经Spacer C3修饰。优选的，进行多重TaqMan荧光定量PCR反应时，先预扩增3 5个循环，再进行实时荧光定量检测。优选的，预扩增的变性温度为94 96°C，退火温度为52 55°C;实时荧光定量检测的变性温度为90 92°C，退火温度为60 62°C。优选的，参比基因为待检DNA样本所属物种基因组中的一种看家基因。本发明在进行多重TaqMan荧光定量PCR反应前，需先对多重TaqMan荧光定量PCR反应体系进行优化，优化的步骤如下
1)优化体系中目的基因和参比基因的引物、荧光探针、缓冲液、Taq酶、镁离子、
dNTPs、模板DNA的浓度，使多重TaqMan荧光定量PCR体系中各单重PCR反应的扩增效率达95 100%o2) 优化体系中目的基因的封闭探针浓度，使多重TaqMan荧光定量PCR体系的Ct值比未加封闭探针的Ct值高1. 0 1. 5。由于看家基因在群体中无拷贝数变异现象，故将看家基因作为参比基因。本发明的技术方案中的要求及方法原理如下(I)初始模板封闭的技术策略本发明设计的封闭探针，能与部分初始模板的目的基因扩增序列位点结合，由于封闭探针的3’末端经过修饰失去了延伸能力，故封闭探针能将部分初模板封闭，使其在PCR反应中不能扩增。而目的基因的封闭探针、引物与目的基因的结合位点相同，故封闭探针、引物与模板竞争性结合，封闭探针与模板结合后目的基因不扩增，引物与模板结合后目的基因能正常扩增，这样就导致目的基因和内参基因不能等比例扩增，以至于扩大了目的基因和参比基因Ct值之间的比值，扩大了受检样本初始模板拷贝数差异。
(2)封闭探针的设计原则及通用要求本发明所采用的封闭策略，是基于封闭探针和引物对初始模板的竞争性结合和选择性封闭，因此，封闭探针和引物所结合的模板DNA序列基本一致，所以引物和封闭探针的DNA序列也基本一致，这是关于封闭探针设计的第一个通用要求；其次，封闭的目的是使一部分初始模板在PCR反应中不能扩增，也就是封闭探针与模板的结合不会导致扩增反应，因此，封闭探针的结构也就不同于引物，必须阻止其在PCR反应中发生3’端的延伸，也就是于封闭探针3’末端进行修饰，如Spacer C3标记等，以阻止其3’端延伸，这是关于封闭探针设计的第二个通用要求；另外，封闭探针的Tm值须稍高于扩增引物3 5°C，以保证在退火过程中，封闭探针稍先与初始模板结合以达到封闭目的，为满足这一要求，可增加封闭探针3’末端与目的基因的结合位点，即增加封闭探针3’末端与目的基因互补的碱基序列，这是封闭探针设计的第三个通用要求。(3)反应体系中封闭探针加入量的确定封闭探针量过多则使有效扩增模板太少而影响定量PCR反应的敏感性与稳定性，封闭探针量太少则不能达到定量检测的灵敏度的Ct值差异要求。本发明的技术方案中，首先对多重TaqMan荧光定量PCR体系进行优化调整，使各PCR反应的扩增效率均基本达到100%，然后再调整所加入的封闭探针量，采用的具体方法是在反应体系中加入DNA样本量和扩增引物浓度不变的情况下，分别加入不同浓度的封闭探针，定量检测结果可以观察到，随着封闭探针浓度的增加，目的基因定量PCR的Ct值增高，以未加封闭探针反应体系的Ct值为标准，Ct值增高I. 0 I. 5的封闭探针浓度为合适浓度。(4)短片段目的序列嵌套PCR预扩增设计为保证定量PCR的分析灵敏度达到Ct值差异0. 8 I. 0，除对体系组份的常规优化外，本发明采用了短片段目的序列嵌套PCR预扩增设计，以确保检测体系的特异性、敏感性、稳定性和准确性，其具体的技术要求是PCR扩增序列少于150bp，上下游引物5’端分别引入4 7bp基因组模板非互补碱基，先于高变性温度结合低退火温度预扩增3 5个循环，以合成下一步荧光定量检测的人工模板序列；再于低变性温度给合高退火温度进行实时荧光定量检测。这种设计，采用短片段扩增，可明显提高PCR体系扩增效率和敏感性；低变性温度给合高退火温度可保证定量检测的模板为预扩增所合成的人工模板序列，减少与待检样本基因组DNA其它序列的非特异性扩增而提高体系的特异性、稳定性和准确性。(5)样本检测设置要求及数据分析模式根据定量PCR技术原理，如果2个PCR反应的扩增效率均为100%，且初始模板拷贝数相同，则两者扩增达到一定产物量所需的循环数相同，即Ct值相同。然而，在实际检测中，由于仪器荧光读取性能及阈值设定的差异，会导致2个PCR反应的Ct值不相等，但是，在同一仪器、同一批试剂和同一批检测反应中，两者之间的差异为一恒定值。因此，在每一批样本检测时，以待检目的基因拷贝数已知的正常标本为对照样本，取I 2份对照样本与待检样本同样条件下进行多重PCR检测，结合文献报道的 fMGt相对定量数据分析模式(Kenneth J，et al. METHODS. 2001; 25: 402 - 408.),以对照样本的I 2个PCR反应的Ct值差异(ACt)为标准，将待检样本的ACt与其比较，计算两ACt间的差异值(AACt)，最后计算待检样本目的基因拷贝数相对定量值2_AAet，该值即为待检样本目的基因相对于内参基因拷贝数的倍数，故可得到目的基因的拷贝数，但由于实际检测中因为操作过程及仪器本身的误差，得到的数值近似等于理论值，具体的计算公式如下
待检样本(或对照样本)目的基因ACt = Ct_g的基因一 Ct_*比基因 待检样本目的基因AACt = ACt_；^检样本一ACt__样本 待检样本目的基因拷贝数相对定量值2_AAet。本发明的有益效果是
本发明能直接定量检测功能基因的拷贝数，直接反映受检基因是否有缺失、缺失的数目、以及多拷贝(CNVs)，从而实现基因缺失和基因多拷贝的同步快速检测，本发明方法灵敏度高，只需普通的荧光定量PCR仪就能完成基因缺失和基因多拷贝的同步快速检测，通过实验也证实本发明的方法准确可靠。本发明采用初始模板封闭策略，在检测体系中加入一定量目的基因封闭探针，利用探针、引物与扩增模板的竞争性结合，将一部分初始模板封闭，使其在PCR反应中不能扩增，使功能基因缺失和多拷贝所导致的Ct值差异增大。本发明采用多重TaqMan实时荧光定量PCR技术，以短片段扩增子设计方式，经过对核酸模板的选择性封闭及扩增子模板预扩增，能定量检测样本中基因组目的基因拷贝数。
图I是不同封闭探针浓度的小鼠SRY基因定量PCR检测Ct值变化 图2是小鼠SRY基因CNVs封闭前后ACt及2_AAet值对比分析 图3是不同封闭探针浓度的a I、a 2基因定量PCR检测Ct值变化图。
具体实施例方式下面结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限如此。实施例I小鼠SRY质粒载体基因拷贝数的检测
本实施方案选择小鼠SRY基因质粒载体为检测对象，应用本发明同时检测基因缺失和基因多拷贝的方法，检测SRY基因拷贝数，通过对基因拷贝数结果的分析，以观察本方法用于检测目的基因缺失及多拷贝的可行性与有效性，尤其是封闭探针的封闭效果观察。选择依据及代表性
采用基因克隆技术，将一段约400bp的小鼠SRY基因序列，一段约400bp的小鼠看家基因运-Actin，连接至T载体环状DNA序列中，分别作为目的基因和参比基因的检测对象。所构建的T载体，经转化、增菌、分离、纯化后，采用紫外分光光度法检测其浓度及纯度。由于所采用的载体相同，克隆的片段长度基本一致，所以，根据其浓度配制成目的基因与参比基因拷贝数比例为0:1、0.5:1、1:1、1.5:1、2:1的基因拷贝数已知样本，其对应的则是目的基因O拷贝(缺失2个)、I拷贝(缺失I个)、2拷贝(正常)、3拷贝(多拷贝)、4拷贝(多拷贝);然后，根据本发明所建立的检测方法进行目的基因拷贝数定量检测，以验证本方法的可行性与有效性。实验步骤
I、目的基因和参比基因扩增序列的选择
以小鼠SRY基因为目的基因、小鼠P-Actin (3肌动蛋白)为参比基因，按本发明的技术策略要求，选取扩增序列
SRY基因的扩增序列见SEQ ID NO. 1，P-Actin基因的扩增序列见SEQ ID NO. 2。2、引物、荧光探针、封闭探针设计
按本发明方法，设计相应的引物、荧光探针、封闭探针，包括特异性扩增SRY的上下游引物，上下游封闭探针和荧光探针，P-Actin基因的上下游引物和荧光探针，各引物、探针序列见表I。表中，引物5’末端的小与字母为与基因组|旲板非互补的喊基序列，封闭探针3’端的小写字母为增加的与基因组模板互补的碱基序列，使SRY封闭探针比SRY引物的Tm值高4°C。
权利要求
1.一种基因拷贝数的定量检测方法，包括如下步骤 1)分别选取目的基因、参比基因的扩增序列； 2)分别设计目的基因和参比基因扩增序列的引物、荧光探针，及目的基因扩增序列的封闭探针，封闭探针包括上游封闭探针和下游封闭探针； 3)样本检测以待检DNA样本作为模板，对目的基因和参比基因进行多重TaqMan荧光定量PCR反应，并以目的基因拷贝数已知的DNA样本为对照样本，分别记录Ct值； 4)结果分析计算待检样本目的基因的拷贝数相对定量值，判断分析检测样本目的基因的拷贝数。
2.根据权利要求I所述的基因拷贝数的定量检测方法，其特征在于封闭探针的3’末端经过修饰失去了延伸能力。
3.根据权利要求I所述的基因拷贝数的定量检测方法，其特征在于目的基因的引物、封闭探针分别与目的基因的结合位点相同。
4.根据权利要求I所述的基因拷贝数的定量检测方法，其特征在于目的基因、参比基因的引物的5’末端分别引入了 4 7 bp与基因组模板非互补的碱基序列。
5.根据权利要求I所述的基因拷贝数的定量检测方法，其特征在于封闭探针比目的基因的引物的Tm值高3 5°C。
6.根据权利要求I所述的基因拷贝数的定量检测方法，其特征在于扩增序列为一段GC含量40 60%、长度70 150bp的DNA序列，且与基因非扩增区无同源序列。
7.根据权利要求2所述的基因拷贝数的定量检测方法，其特征在于封闭探针的3’末端经Spacer C3修饰。
8.根据权利要求I所述的基因拷贝数的定量检测方法，其特征在于进行多重TaqMan荧光定量PCR反应时，先预扩增3 5个循环，再进行实时荧光定量检测。
9.根据权利要求8所述的基因拷贝数的定量检测方法，其特征在于预扩增的变性温度为94 96°C，退火温度为52 55°C ;实时荧光定量检测的变性温度为90 92°C，退火温度为60 62°C。
10.根据权利要求I所述的基因拷贝数的定量检测方法，其特征在于参比基因为待检DNA样本所属物种基因组中的一种看家基因。
全文摘要
本发明公开了一种基因拷贝数的定量检测方法，包括如下步骤分别设计目的基因和参比基因扩增序列的引物、荧光探针，及目的基因扩增序列的封闭探针；样本检测以待检DNA样本作为模板，对目的基因和参比基因进行多重TaqMan荧光定量PCR反应，并以已知目的基因拷贝数的DNA样本为对照样本，分别记录Ct值；结果分析。本发明能直接定量检测功能基因的拷贝数，直接反映受检基因是否有缺失、缺失的数目、以及多拷贝(CNVs)，从而实现基因缺失和基因多拷贝的同步快速检测，本发明方法灵敏度高，只需普通的荧光定量PCR仪就能完成基因缺失和基因多拷贝的同步快速检测，通过实验也证实本发明的方法准确可靠。
文档编号C12Q1/68GK102618646SQ20121009006
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月30日 优先权日2012年3月30日
发明者周万军, 徐湘民 申请人:南方医科大学