包含螯合剂的发酵培养基的制作方法

本发明涉及一种发酵培养基和一种使用所述发酵培养基的发酵方法，其中所述发酵培养基包含基础培养基和具有式(i)r1-ch(coox1)-n(ch2coox1)2的螯合剂，其中r1选自氢、线性或支化的c1-c4烷基、苯基、苄基、ch2oh和ch2ch2coox1，x1为(mxh1-x)，m选自铵或碱金属或上述至少两种的组合，x为0-1，其中x为平均值。发明背景通过培养选定的产生有用物质的微生物的这些物质的生物技术生产现在具有相当大的工业意义。尤其是，蛋白质的工业生产，特别是洗涤-和/或清洁-活性酶，还有药物活性化合物，在过去几十年里通过发酵生产不断增加。对于工业规模的发酵，培养的微生物通常需要复杂的营养素混合物。其中，生产菌株通常在发酵期间需要氮源和碳源，包括例如磷和硫源的盐以及微量元素。在这种复杂的混合物中，在所用ph条件下，不溶性组分(例如盐)的沉淀通常发生在发酵培养基的制备和培养过程中。这种沉淀是不利的，因为它会导致这些沉淀物中所含的营养素无法获得。由于这些沉淀物中的大部分不溶解，它们代表着资产损失。此外，沉淀物的形成导致不均匀性，使得发酵液的搅拌更加困难，从而导致发酵工艺的能耗增加。此外，沉淀物会干扰发酵液中感兴趣的化合物的纯化，因为沉淀物会干扰后续的下游加工操作。通过在发酵培养基中添加螯合剂来解决这个问题，这种螯合剂能够结合某些离子(主要是阳离子)，从而减少不溶性沉淀物的形成。在发酵培养基中，柠檬酸盐通常用作低成本的螯合剂。虽然柠檬酸盐在离子络合反应中是相当有效的，但当柠檬酸盐在高盐负载的发酵培养基中使用时，仍经常观察到显著量不溶物的沉淀。此外，大多数微生物在发酵工艺过程中能够代谢柠檬酸盐，从而导致微生物对螯合剂的显著分解。反过来，在发酵过程期间，螯合效率降低，发生额外沉淀。另一种熟知的螯合剂是edta。然而，edta及其衍生物与对重金属离子如砷、镉和汞的高度结合亲和力的缺点有关。这反过来导致在废水处理厂中发酵废物分解过程期间，此类重金属离子的泄漏增加。因此，需要一种包含螯合剂的发酵培养基，具有改进的络合效率和减少的被培养微生物代谢的倾向。对所述问题的方案通过本发明提供，涉及一种发酵培养基和一种使用所述发酵培养基的发酵方法，其中所述发酵培养基包含基础培养基和具有式r1-ch(coox1)-n(ch2coox1)2(i)的螯合剂，其中r1选自氢、线性或支化的c1-c4烷基、苯基、苄基、ch2oh和ch2ch2coox1，x1为(mxh1-x)，m为一价阳离子，优选选自铵或碱金属或上述至少两种的组合，x为0-1，其中x为平均值。根据上述式(i)的氨基甲酸化物型螯合剂及其相应盐是用于优选碱土金属离子(例如ca2+和mg2+)的有用隐蔽剂(sequestrant)。这类化合物显示出良好的生物降解性，因此是环境友好的。此外，在发酵工艺中使用的浓度范围内，这些化合物显示出对培养微生物的低毒性。为此，推荐它们并将其用于各种目的如洗衣用洗涤剂和自动器皿洗涤(adw)配制剂，特别是用于所谓的不含磷酸盐的洗衣用洗涤剂和不含磷酸盐的adw配制剂(例如参见wo2006002954a1和wo2013160259a1)。根据上述式(i)的化合物也已被公开用于改进除草剂效率(参见wo2014206835a1)。生产该类组分的方法例如描述于wo2015089012a1中。然而，所引用的现有技术均没有教导或建议将根据式(i)的化合物用作发酵培养基中的螯合剂。发明简述本发明涉及一种发酵培养基和一种使用所述发酵培养基的发酵方法，其中所述发酵培养基包含基础培养基和具有式r1-ch(coox1)-n(ch2coox1)2(i)的螯合剂，其中r1选自氢、线性或支化的c1-c4烷基、苯基、苄基、ch2oh和ch2ch2coox1，x1为(mxh1-x)，m为一价阳离子，优选选自铵、碱金属和上述至少两种的组合，x为0-1，其中x为平均值。特别地，本发明涉及一种使用发酵培养基来培养微生物的方法，所述发酵培养基包含基础培养基和具有式r1-ch(coox1)-n(ch2coox1)2(i)的螯合剂，其中r1选自氢、线性或支化的c1-c4烷基、苯基、苄基、ch2oh和ch2ch2coox1，x1为(mxh1-x)，m为一价阳离子，优选选自铵、碱金属和上述至少两种的组合，x为0-1，其中x为平均值。此外，本发明涉及一种通过使用发酵培养基来培养微生物而生产感兴趣的化合物的方法，所述发酵培养基包含基础培养基和具有式r1-ch(coox1)-n(ch2coox1)2(i)的螯合剂，其中r1选自氢、线性或支化的c1-c4烷基、苯基、苄基、ch2oh和ch2ch2coox1，x1为(mxh1-x)，m为一价阳离子，优选选自铵、碱金属和上述至少两种的组合，x为0-1，其中x为平均值。此外，本发明涉及螯合剂在制备发酵培养基，培养微生物和生产感兴趣的化合物中的用途，所述螯合剂具有式r1-ch(coox1)-n(ch2coox1)2(i)，其中r1选自氢、线性或支化的c1-c4烷基、苯基、苄基、ch2oh和ch2ch2coox1，x1为(mxh1-x)，m为一价阳离子，优选选自铵、碱金属和上述至少两种的组合，x为0-1，其中x为平均值。附图简述图1：就具有不同螯合剂的培养基而言，以μl级表示，作为培养物的生物质生长量度的散点图曲线。图2：在50小时培养之后，以μl级表示，在具有ph6.7的微量元素溶液中，在不同螯合剂(柠檬酸、mgda、nta、heedta或egta)下，酶生产的比较，以au[-]表示。图3：在50小时培养之后，以μl级表示，在具有ph7.7的微量元素溶液中，在不同螯合剂(柠檬酸、mgda、nta、heedta或egta)下，酶生产的比较，以au[-]表示。发明详述通过参考以下本发明优选实施方案和本文中包括的实施例的详细描述，可以更容易地理解本发明。定义除非另外指出，否则本文中使用的术语根据相关领域的普通技术人员常规使用来理解。将理解，如说明书和权利要求中使用的，“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”可以根据其中使用的内容表示一个/一种或多个/多种。因此，例如，提及“一个/一种细胞”可以表示可以利用至少一个/一种细胞。在整个本申请中，参考了各种出版物。这些出版物中的全部和这些出版物内引用的那些参考文献的全部公开内容按引用并入本申请中，以更全面地描述本发明所属领域的状况。术语“基础培养基”在本文中用于适于细胞(例如，微生物细胞，例如，细菌细胞和/或真菌细胞)生长的任何类型的液体发酵培养基。术语“复合氮源”在本文中用于发酵培养基的组分，包含不同的含氮化合物，优选地包含有机含氮化合物(例如不同的蛋白质和/或氨基酸)，可包含至多49％的碳水化合物，优选0.5-20％的碳水化合物。术语“复合碳源”在本文中用于发酵培养基的组分，包含不同的含碳化合物(例如碳水化合物)，可包含至多49％的含氮化合物，优选0.5-20％的含氮化合物。术语“工业规模的发酵”(也称为大规模发酵)是指使用大于或等于20升发酵罐体积的发酵工艺。术语“等摩尔”是指螯合剂相对于溶液中存在的多价(优选二价和三价，更优选二价)阳离子的相对浓度，其中螯合剂的摩尔浓度与溶液中二价盐阳离子之和的摩尔浓度相同，其中不包括复合氮源或碳源中所含的盐阳离子。详细描述本发明涉及一种发酵培养基，其包含基础培养基和具有式(i)的螯合剂：r1-ch(coox1)-n(ch2coox1)2其中r1选自氢、线性或支化的c1-c4烷基、苯基、苄基、ch2oh和ch2ch2coox1，x1为(mxh1-x)，m为一价阳离子，优选选自铵、碱金属和上述至少两种的组合，x为0-1，其中x为平均值。优选地，r1选自氢，线性或支化的c1-c4烷基如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基，进一步优选甲基和异丁基和仲丁基，甚至更优选甲基。还优选r1为苯基、苄基、ch2oh或ch2ch2coox1，优选ch2ch2coox1。特别优选如下的式(i)化合物，其中式(i)的r1选自氢、线性或支化的c1-c4烷基和ch2ch2coox1。进一步优选如下的化合物，其中式(i)的r1选自氢和线性或支化的c1-c4烷基，优选甲基。甚至更优选如下的化合物，其中式(i)的r1选自氢、甲基和ch2ch2coox1。优选地，式(i)的r1为氢。在优选实施方案中，r1不为羧基。进一步优选式(i)的r1为甲基。还优选式(i)的r1为ch2ch2coox1。还可将具有至少一种落入式(i)下的不同螯合剂的混合物添加发酵培养基中。优选地，可将至少两种落入具有不同r1定义的式(i)下的螯合剂添加发酵培养基中。优选地，发酵培养基包含基础培养基和具有式(i)的螯合剂：r1-ch(coox1)-n(ch2coox1)2其中r1选自线性或支化的c1-c4烷基、苯基、苄基和ch2oh，x1为(mxh1-x)，m为一价阳离子，优选选自铵或碱金属或上述至少两种的组合，且x为0-1，其中x为平均值。在另一实施方案中，发酵培养基包含基础培养基和具有式(i)的螯合剂：r1-ch(coox1)-n(ch2coox1)2其中r1选自线性或支化的c1-c4烷基，x1为(mxh1-x)，m为一价阳离子，优选选自铵或碱金属或上述至少两种的组合，且x为0-1，其中x为平均值。在另一实施方案中，发酵培养基包含基础培养基和具有式(i)的螯合剂：r1-ch(coox1)-n(ch2coox1)2其中r1为甲基，x1为(mxh1-x)，m为一价阳离子，优选选自铵或碱金属或上述至少两种的组合，且x为0-1，其中x为平均值。在优选实施方案中，m选自铵、碱金属和上述至少两种的组合。在更优选的实施方案中，m选自碱金属，例如锂、钠或钾、铷、铯或上述至少两种的组合，优选钾或钠以及钠和钾的组合，并且甚至更优选钠。在优选实施方案中，x为0-1，其中x为平均值。优选地，x为0.6-1，更优选地x是0或1，优选地x是1。在优选实施方案中，r1是氢或甲基或ch2ch2coox1，x是1，并且x1选自钾和钠以及钠和钾的组合，并且优选钠。在另一优选实施方案中，r1是氢或甲基，x是1，并且x1选自钾和钠以及钠和钾的组合，并且优选钠。优选地，在本发明中使用的螯合剂的实例为通式(ii)化合物：[r1-ch(coo)-n(ch2-coo)2]m3-xhx(ii)其中m选自铵、(相同或不同)碱金属阳离子(例如锂、钠、钾、铷、铯阳离子)和上述至少两种的组合，优选碱金属阳离子为钠和钾，优选钠，以及钠和钾的组合；x为0-3.0，其中x为平均值，优选0-2.0，更优选0-1.0，优选0-0.5，在特别优选实施方案中，x为1或0；r1选自氢，c1-c4烷基如甲基、乙基、异丙基、仲丁基和异丁基，优选氢或甲基。在另一实施方案中，在本发明中使用的螯合剂的优选实例为通式(iii)化合物：[ooc-ch2ch2c-ch(coo)-n(ch2-coo)2]m4-xhx(iii)其中m选自铵、(相同或不同)碱金属阳离子(例如锂、钠、钾、铷、铯阳离子)和上述至少两种的组合，优选碱金属阳离子为钠和钾，优选钠，以及钠和钾的组合；x为0-4.0，其中x为平均值，优选0-3.0，更优选0-2.0，进一步优选0-1.0，优选0-0.5，在特别优选实施方案中，x为1或0。在优选实施方案中，式(i)的r1选自氢、甲基和ch2ch2coox1。其中r1为氢的通式(i)化合物在下文也称为nta，氨三乙酸。其中r1为甲基的通式(i)化合物在下文也称为mgda，甲基甘氨酸二乙酸。其中r1为ch2ch2cooh的通式(i)化合物在下文也称为glda，谷氨酸n,n-二乙酸。在优选实施方案中，螯合剂选自氨三乙酸(nta)、甲基甘氨酸二乙酸(mgda)、谷氨酸n,n-二乙酸(glda)及其盐及其组合。在另一优选实施方案中，本发明的发酵培养基包含基础培养基和如本文所述的根据式(i)的螯合剂，其中所述发酵培养基不包含柠檬酸和/或其盐。优选地，发酵培养基不包含一种或多种选自乙二胺四乙酸(edta)、二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)、羟乙基乙二胺三乙酸(heedta)和乙二醇四乙酸(egta)的螯合剂。优选地，发酵培养基不包含一种或多种选自柠檬酸盐、edta、dtpa、heedta和egta的螯合剂。更优选地，发酵培养基不包含柠檬酸盐和edta。优选地，发酵培养基中不包含柠檬酸盐，一种或多种复合氮源或碳源中所含的柠檬酸盐除外。在优选实施方案中，本文中描述的发酵培养基的螯合剂易于生物降解(基于oecd标准，例如根据如下测定：oecd指南301f、301b、iso9439、92/69/eec、c,4-c)，优选thod的80-100％，更优选80-90％或90-100％bod(28d)。在优选实施方案中，本文中描述的发酵培养基的螯合剂不为培养微生物的天然底物，优选地，培养微生物不能代谢螯合剂。在本发明的一个实施方案中，通式(i)、(ii)或(iii)的化合物是外消旋混合物。在其他实施方案中，通式(i)、(ii)或(iii)的化合物选自纯对映体如l-对映体或者其中一种对映体，优选l-对映体主导的对映体混合物。在本发明的一个实施方案中，通式(i)、(ii)或(iii)的化合物选自主要包含相应l-异构体的对映体混合物，其中对映体过量(ee)为3-97％，优选20-80％，甚至更优选25-75％。优选地，l/d对映体的摩尔比为55:45-99:1，更优选80:20-99:1。在本发明的一个实施方案中，mgda的碱金属盐可选自如下物质的碱金属盐：l-对映体、外消旋混合物和mgda的对映体富集碱金属盐，与d-对映体相比，l-对映体过量。优选l-对映体和d-对映体混合物的碱金属盐，其中l/d的摩尔比为55:45-85:15。与例如外消旋混合物相比，这种混合物表现出更低的吸湿性。glda的碱金属盐可选自如下物质的碱金属盐：l-对映体、外消旋混合物和对映体富集glda，与d-对映体相比，l-对映体过量。优选l-对映体和d-对映体混合物的碱金属盐，其中l/d的摩尔比为80:20或更高，优选85:15至99:1。与例如外消旋混合物或纯d-对映体相比，这种glda碱金属盐具有更好的生物降解性。对映体过量可以通过测量旋光(旋光测定)或优选通过色谱法，例如通过使用手性柱，例如使用一种或多种环糊精作为固定相或使用配体交换(pirkle刷)构思的手性固定相的hplc而测定。优选在铜(ii)盐存在下用固定的光学活性胺如d-青霉胺通过hplc测定ee，尤其是对于r1为甲基的通式(i)或(ii)的化合物。在本发明的上下文中，式(i)、(ii)或(iii)化合物的碱金属盐选自锂盐、钾盐和优选钠盐。式(i)、(ii)或(iii)化合物可以用相应碱部分地或优选地完全地中和。在优选实施方案中，用碱金属中和式(i)、(ii)或(iii)化合物的平均2.7-3个cooh基团，优选用钠中和。在特别优选的实施方案中，螯合剂(a)是式(i)、(ii)或(iii)化合物的三钠盐。优选地，如本文所述的式(i)、(ii)或(iii)的螯合剂以相对于发酵培养基中所含的多价、优选二价阳离子和三价阳离子，优选二价阳离子等摩尔的浓度在发酵培养基中使用。优选地，浓度为至少50％等摩尔的，更优选至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、至少175％或至少200％等摩尔的。优选地，以0.1-3.0g/l，更优选0.2-2g/l，最优选0.2-1.5g/l，甚至更优选地0.5-1.5g/l的浓度使用螯合剂。培养微生物通常要求细胞在含有这些细胞生长所需的各种营养源如碳源、氮源和其他营养素如氨基酸、维生素、矿物质等的培养基中培养。发酵培养基可以是基本培养基，例如如wo98/37179中所述，或发酵培养基可以是包含复合氮源和碳源的复合培养基，其中复合氮源可以是部分水解的，如wo2004/003216中所述。因此，本发明的发酵培养基包含基础培养基，其中优选地，基础培养基包含培养微生物生长所需的组分。优选地，基础培养基包含一种或多种选自氮源、磷源、硫源和盐的组分以及任选地一种或多种选自微量营养素如维生素、氨基酸、矿物质和微量元素的其他组分。优选地，所述基础培养基还包含碳源。该类组分通常在本领域内为熟知的(参见例如ausubel等人，shortprotocolsinmolecularbiology，第3版，wiley&sons，1995；sambrook等人，molecularcloning：alaboratorymanual，第二版，1989coldspringharbor，n.y.；talbot，molecularandcellularbiologyoffilamentousfungi：apracticalapproach，oxforduniversitypress，2001；kinghom和turner，appliedmoleculargeneticsoffilamentousfungi，cambridgeuniversitypress，1992；和bacillus(biotechnologyhandbooks)，colinr.harwood，plenumpress，1989)。给定细胞类型的培养条件也可在科学文献和/或细胞来源中找到，如美国菌种保藏中心(atcc)和真菌遗传学库存中心。作为氮源，可单独或组合使用无机和有机氮化合物。合适氮源的说明性实例包括含蛋白质物质，例如来自微生物、动物或植物细胞的提取物，例如植物蛋白制剂，大豆粉，玉米粉，豌豆粉，玉米麸质，棉粕，花生粉，马铃薯粉，肉及酪蛋白，明胶，乳清，鱼粉，酵母蛋白，酵母提取物，胰蛋白胨，蛋白胨，细菌胰蛋白胨(bacto-tryptone)，细菌蛋白胨(bacto-peptone)，微生物细胞、植物、肉或动物体加工产生的废物及其组合。无机氮源的实例是铵、硝酸盐和亚硝酸盐及其组合。在优选实施方案中，所述发酵培养基包含氮源，其中所述氮源是复合物或定义的氮源或其组合。优选地，所述复合氮源选自植物蛋白，优选土豆蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白、花生、棉花蛋白和/或豌豆蛋白、酪蛋白、胰蛋白胨、蛋白胨和酵母提取物及其组合。优选地，定义的氮源选自氨、铵、铵盐(例如氯化铵、硝酸铵、磷酸铵、硫酸铵、乙酸铵)、脲、硝酸盐(nitrate)、硝酸盐(nitratesalt)、亚硝酸盐和氨基酸，优选谷氨酸盐，及其组合。在优选实施方案中，发酵培养基进一步包含碳源。碳源优选为复合物或定义的碳源或其组合。各种糖和含糖物质是合适的碳源，糖可能在聚合的不同阶段存在。本发明中使用的优选复合碳源选自糖蜜、玉米浆、蔗糖、糊精、淀粉、淀粉水解物和纤维素水解物及其组合。优选定义的碳源选自碳水化合物、有机酸和醇，优选葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、乙酸、丙酸、乳酸、甲酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、甘油、肌醇、甘露醇和山梨醇及其组合。优选地，定义的碳源以糖浆的形式提供，糖浆可以包含至多20％，优选至多10％，更优选至多5％的杂质。优选地，碳源是甜菜糖浆、甘蔗糖浆、玉米糖浆，优选高果糖玉米糖浆。优选地，复合碳源选自糖蜜、玉米浆、糊精和淀粉或其组合，其中定义的碳源选自葡萄糖、果糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、糊精、乳糖或其组合。优选地，基础培养基还包含磷源，优选地磷酸盐，和优选地硫源，优选地硫酸盐。优选地，基础培养基还包含盐，优选地无机盐，特别地一种或多种选自碱金属盐、碱土金属盐、磷酸盐和硫酸盐的盐，优选地选自nacl、kh2po4、mgso4、cacl2、fecl3、mgcl2、mncl2、znso4、na2moo4和cuso4。优选地，基础培养基还包含一种或多种维生素，例如盐酸硫胺素、生物素、维生素b12。优选地，基础培养基还包含微量元素，例如fe、mg、mn、co和ni。优选地，发酵培养基包含一种或多种选自na、k、ca、mg、mn、fe、co、cu和ni的盐阳离子，优选地，二价或三价阳离子，更优选地，ca和mg。优选地，发酵培养基包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种或全部选自na、k、ca、mg、mn、fe、co、cu和ni的盐阳离子。优选地，发酵培养基包含盐阳离子na、ca和mg，更优选na、ca、mg和mn，甚至更优选na、k、ca、mg、mn和co、cu和/或ni。特别地，本发明涉及一种发酵培养基，所述发酵培养基包含基础培养基和具有式r1-ch(coox1)-n(ch2coox1)2(i)的螯合剂，其中r1选自氢、线性或支化的c1-c4烷基、苯基、苄基、ch2oh和ch2ch2coox1，x1为(mxh1-x)，m为一价阳离子，优选选自铵或碱金属或上述至少两种的组合，x为0-1，其中x为平均值，并且其中所述发酵培养基包含一种或多种盐阳离子，优选二价或三价盐阳离子，优选微量元素，更优选一种或多种选自na、k、ca、mg、mn、fe、co、cu和ni的盐阳离子，最优选ca和mg。优选地，螯合剂直接溶解于发酵培养基中。在另一优选实施方案中，制备包含螯合剂的溶液，例如储备溶液，随后将其添加到发酵培养基中。优选地，将螯合剂溶解于盐溶液中，优选微量元素溶液，随后将其添加到发酵培养基中。因此，本发明的另一方面涉及一种包含一种或多种微量元素和具有式(i)的螯合剂的微量元素溶液：r1-ch(coox1)-n(ch2coox1)2其中r1选自氢、线性或支化的c1-c4烷基、苯基、苄基、ch2oh和ch2ch2coox1，x1为(mxh1-x)，m为一价阳离子，优选选自铵或碱金属或上述至少两种的组合，x为0-1，其中x为平均值。优选地，微量元素溶液包含一种或多种微量元素和具有式(i)的螯合剂：r1-ch(coox1)-n(ch2coox1)2其中r1选自线性或支化的c1-c4烷基、苯基、苄基和ch2oh，x1为(mxh1-x)，m为一价阳离子，优选选自铵或碱金属或上述至少两种的组合，x为0-1，其中x为平均值。在另一实施方案中，微量元素溶液包含一种或多种微量元素和具有式(i)的螯合剂：r1-ch(coox1)-n(ch2coox1)2其中r1选自线性或支化的c1-c4烷基，x1为(mxh1-x)，m为一价阳离子，优选选自铵或碱金属或上述至少两种的组合，x为0-1，其中x为平均值。在另一实施方案中，微量元素溶液包含一种或多种微量元素和具有式(i)的螯合剂：r1-ch(coox1)-n(ch2coox1)2其中r1为甲基，x1为(mxh1-x)，m为一价阳离子，优选选自铵或碱金属或上述至少两种的组合，x为0-1，其中x为平均值。优选地，微量元素溶液包含至少一种选自na、k、ca、mg、mn、mo、fe、co、cu、zn和ni，最优选地zn、fe、mn、cu、co、ni和mo的盐阳离子。优选地，微量元素溶液包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种或全部选自na、k、ca、mg、mn、mo、fe、co、cu、zn和ni的盐阳离子。优选地，微量元素溶液包含至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种或全部选自mn、mo、fe、co、cu、zn和ni的盐阳离子。优选地，微量元素溶液包含盐阳离子zn、fe、mn、cu、co、ni和mo，更优选地zn、mn、cu、co、ni和mo，优选地，微量元素溶液包含盐阳离子mn、co和cu，优选地mn、fe和ni，最优选地mn、fe、co、cu和ni。优选地，在微量元素溶液中包含选自na、k、ca、mg、mn、mo、fe、co、cu、zn和ni的盐阳离子的各盐的量为0.01-70重量％，优选0.1-65重量％微量元素溶液中所含螯合剂。优选地，微量元素溶液包含一种或多种选自zn、fe、mn、cu、co、ni和mo作为盐阳离子，并且含盐阳离子的盐相比于微量元素溶液中所含螯合剂的量为如下量(以重量表示)：18-17％含zn的盐，32-43％含fe的盐，6-14％含mn的盐，12-27％含cu的盐，58-68％含co的盐，0.7-1.7％含ni的盐和0.08-0.25％含mo的盐。优选地，微量元素溶液包含zn、fe、mn、cu、co、ni和mo作为盐阳离子，并且含盐阳离子的盐相比于微量元素溶液中所含螯合剂的量为如下量(以重量表示)：18-17％含zn的盐，32-43％含fe的盐，6-14％含mn的盐，12-27％含cu的盐，58-68％含co的盐，0.7-1.7％含ni的盐和0.08-0.25％含mo的盐。优选地，微量元素溶液的ph值为ph3-7，优选地ph3-5，优选地ph3-4。优选地，基础培养基还包含消泡剂。优选地，基础培养基还包含选择剂，例如抗生素，例如氨苄西林、四环素、卡那霉素、潮霉素、博来霉素、氯霉素、链霉素或腐草霉素或除草剂，细胞的可选标记物提供对其的抗性。优选地，将发酵培养基的ph值调节为ph6.6-9，优选ph6.6-8.5，优选ph6.6-7.5，更优选ph7.0-8.5。优选地，发酵培养基的电导率在ph值调节之后为0.1-100ms/cm，优选0.1-50ms/cm，更优选5-50ms/cm，甚至更优选0.5-25ms/cm，进一步更优选10-25ms/cm，最优选7-10ms/cm。在优选实施方案中，发酵培养基和使用所述发酵培养基的方法用于工业规模的发酵。优选地，本发明的发酵培养基可用于具有至少20升，优选至少50升，更优选至少300升，进一步优选至少1000升的培养基的任何发酵。另一优选实施方案为使用如本文所定义的发酵培养基来培养微生物的方法，所述发酵培养基包含具有式r1-ch(coox1)-n(ch2coox1)2(i)的螯合剂，其中r1选自氢、线性或支化的c1-c4烷基、苯基、苄基、ch2oh和ch2ch2coox1，x1为(mxh1-x)，m为一价阳离子，优选选自铵或碱金属或上述至少两种的组合，x为0-1，其中x为平均值。优选地，在本发明的培养微生物的方法中，所述微生物在培养过程期间不分解所述螯合剂，优选所述微生物在发酵工艺期间不分解所述螯合剂初始量的80-95％。优选地，与发酵前的发酵培养基相比，发酵后的发酵液中的螯合剂量基本不变，优选80-100％，更优选90-100％，最优选95-100％。本发明的另一优选方法为通过使用如本文所定义的发酵培养基来培养微生物而生产感兴趣的化合物的方法，所述发酵培养基包含具有式(i)r1-ch(coox1)-n(ch2coox1)2的螯合剂，其中r1选自氢、线性或支化的c1-c4烷基、苯基、苄基、ch2oh和ch2ch2coox1，x1为(mxh1-x)，m为一价阳离子，优选选自铵或碱金属或上述至少两种的组合，x为0-1，其中x为平均值。发酵可以作为分批、重复批次、进料-分批、重复进料-分批或连续发酵工艺来进行。在进料-分批工艺中，在发酵开始前没有将包含一种或多种结构和/或催化元素的化合物(如碳源或氮源)添加培养基中，或部分添加，并且在发酵工艺期间分别进料包含一种或多种结构和/或催化元素的化合物的全部或剩余部分。选择用于进料的化合物可以一起进料，或彼此分开进料至发酵工艺中。在重复进料-分批或连续发酵工艺中，在发酵期间另外进料完整的起始培养基。起始培养基可以与进料一起进料或分开进料。在重复进料-分批工艺中，以规律的时间间隔取出一部分包含生物质的发酵液，而在连续工艺中，连续进行部分发酵液的取出。发酵工艺由此补充对应于取出发酵液含量部分的新鲜培养基。在本发明的优选实施方案中，优选进料-分批发酵工艺。许多细胞培养物包括碳源如葡萄糖作为发酵期间细胞培养物中底物进料。因此，优选地，培养微生物的方法包括包含碳源的进料。含碳源的进料可以包括定义的或如本文详细描述的复合碳源或其混合物。优选地，碳源进料中包含螯合剂。发酵时间、ph、温度、消泡或其他特定发酵条件可以根据本领域已知的标准条件来应用。优选地，调节发酵条件以获得感兴趣的蛋白质的最大产量。优选地，发酵期间发酵液的温度为30-45℃，优选35-40℃。优选地，调节发酵期间发酵液的ph为ph6.6-9，优选ph6.6-8.5，优选ph6.6-7.5，优选7.0-8.5。优选地，发酵期间发酵液的电导率为0.1-100ms/cm，优选0.1-50ms/cm，更优选5-50ms/cm，甚至更优选0.5-25ms/cm，进一步更优选10-25ms/cm，最优选7-10ms/cm。优选地，发酵在搅拌和/或摇动发酵培养基下进行。优选地，发酵在以50-2000rpm，优选50-1600rpm，进一步优选800-1400rpm，更优选50-200rpm下搅拌发酵培养基下进行。优选地，在培养期间将氧气添加到发酵培养基中，优选通过如本文所述的搅拌和/或搅动或通过充气，优选在0-3巴空气或氧气下。优选地，发酵在用氧气饱和下进行。优选地，发酵时间为1-200小时，优选1-120小时，更优选10-60小时，甚至更优选20-50小时。优选地，感兴趣的化合物通过培养微生物获得，其中优选地，所述微生物是原核生物或真核生物。优选地，所述微生物是细菌、古细菌、真菌细胞、酵母细胞或真核细胞。有用的原核生物是细菌细胞，如革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。优选的有用的革兰氏阳性细菌包括，但不限于，芽孢杆菌(bacillus)细胞，例如，嗜碱芽孢杆菌(bacillusalkalophius)、解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(bacilluscirculans)、bacillusclausii、凝结芽孢杆菌(bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(bacillusfirmus)、bacillusjautus、迟缓芽孢杆菌(bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(bacilluslicheniformis)、巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)和苏云金芽孢杆菌(bacillusthuringiensis)。优选地，微生物是芽孢杆菌细胞，优选地，其中芽孢杆菌细胞是枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或迟缓芽孢杆菌的芽孢杆菌细胞。一些其他优选的细菌包括放线菌目(actinomycetales)的菌株，优选地，链霉菌属(streptomyces)，优选地，类球形链霉菌(streptomycesspheroides)(attc23695)、嗜热链霉菌(streptomycesthermoviolaceus)(ifo12382)、青紫链霉菌(streptomyceslividans)或鼠灰链霉菌(streptomycesmurinus)，或streptovertivillumverticilliumssp.verticillium。其他优选的细菌包括类球红细菌(rhodobactersphaeroides)、rhodomonaspalustri、乳链球菌(streptococcuslactis)。更多优选的细菌包括属于粘球菌(myxococcus)的菌株，例如，变绿粘球菌(m.virescens)。优选的革兰氏阴性细菌是大肠杆菌(escherichiacoli)和假单胞菌(pseudomonassp.)，优选地，pseudomonaspurrocinia(atcc15958)或荧光假单胞菌(pseudomonasfluorescens)(nrrlb-11)。另一优选的革兰氏阴性细菌是basfiasucciniciproducens。微生物可以是真菌细胞。如本文中使用的“真菌”包括子囊菌门(ascomycota)、担子菌门(basidiomycota)、壶菌门(chytridiomycota)和接合菌门(zygomycota)，以及卵菌门(oomycota)和半知菌亚门(deuteromycotina)，和所有有丝分裂真菌。子囊菌门的代表性组包括，例如，链孢霉属(neurospora)、正青霉属(eupenicillium)(＝青霉属(penicillium))、翘孢霉属(emericella)(＝曲霉属(aspergillus))、散囊菌属(eurotium)(＝曲霉属(aspergillus))、毁丝霉属(myceliophthora)、c1，和以下所列的真酵母。担子菌门的实例包括蘑菇、rusts和smuts。壶菌门的代表性组包括例如异水霉属(allomyces)、blastocladiella、雕蚀菌属(coelomomyces)，和水生真菌。卵菌门的代表性组包括例如saprolegniomycetous水生真菌(水霉)，如绵霉属(achlya)。有丝分裂真菌的实例包括曲霉属(aspergillus)(例如黑曲霉(aspergillusniger))、青霉属(penicillium)、假丝酵母属(candida)和链格孢属(alternaria)。接合菌门的代表性组包括例如根霉属(rhizopus)和毛霉属(mucor)。一些优选的真菌包括属于半知菌亚门、丝孢菌纲(hyphomycetes)的菌株，例如，镰刀菌属(fusarium)、腐质霉属(humicola)、木霉属(tricoderma)、漆斑菌属(myrothecium)、轮枝菌属(verticillum)、arthromyces、caldariomyces、单格孢属(ulocladium)、埃里格孢属(embellisia)、枝孢属(cladosporium)或德氏霉属(dreschlera)，特别是尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)(dsm2672)、特异腐质霉(humicolainsolens)、里氏木霉(trichodermaresii)、疣孢漆斑菌(myrotheciumverrucana)(ifo6113)、黑白轮枝菌(verticillumalboatrum)、verticillumdahlie、arthromycesramosus(fermp-7754)、caldariomycesfumago、纸龈枝孢(ulocladiumchartarum)、embellisiaalli或dreschlerahalodes。其他优选的真菌包括属于担子菌亚门，担子菌纲(basidiomycetes)的菌株，例如，鬼伞属(coprinus)、毛平革菌(phanerochaete)、云芝属(coriolus)或栓菌属(trametes)，特别是coprinuscinereusf.microsporus(ifo8371)、长根鬼伞(coprinusmacrorhizus)、黄孢原毛平革菌(phanerochaetechrysosporium)(例如，na-12)或栓菌属(之前称为多孔菌属(polyporus))，例如，t.versicolor(例如，pr428-a)。其他优选的真菌包括属于接合菌亚门(zygomycotina)，mycoraceae的菌株，例如，根霉或毛霉，特别是冻土毛霉(mucorhiemalis)。真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如本文中使用的“酵母”包括子囊孢子酵母(酵母目(endomycetales))、产担子酵母和属于半知菌类(fungilmperfecti)的酵母(blastomycetes)。子囊孢子酵母分成蚀精霉科(spermophthoraceae)和酵母科(saccharomycetaceae)。后者由四个亚科组成，裂殖酵母亚科(schizosaccharomycoideae)(例如，裂殖酵母属(schizosaccharomyces))、拿逊酵母亚科(nadsonioideae)、lipomycoideae和saccharomycoideae(例如，克鲁维酵母属(kluyveromyces)、毕赤酵母属(pichia)和酵母属(saccharomyces))。产担子酵母包括leucosporidim、红冬孢酵母属(rhodosporidium)、sporidiobolus、filobasidium和线黑粉菌属(filobasidiella)。属于半知菌类的酵母分成两个科，掷孢酵母科(sporobolomycetaceae)(例如，掷孢酵母属(sporobolomyces)和布勒掷孢酵母属(bullera))和隐球酵母科(cryptococcaceae)(例如，假丝酵母属)。在另一个实施方案中，真菌宿主细胞是丝状真菌细胞，例如阿舒囊霉属(ashbya)，优选棉阿舒囊霉(ashbyagossypii)(棉花假囊酵母(eremotheciumgossypii))。宿主细胞还可以真核细胞，如哺乳动物细胞、昆虫细胞或植物细胞。本发明的方法可以应用于回收任何感兴趣的化合物。因此，优选生产感兴趣的化合物的方法，其中感兴趣的化合物是蛋白质。在优选实施方案中，发酵方法用于以相对高产量生产感兴趣的蛋白质。优选地，感兴趣的蛋白质以至少2g蛋白质(干物质)/kg未处理发酵培养基的量表达；优选以至少3g蛋白质(干物质)/kg未处理发酵培养基的量；更优选以至少5g蛋白质(干物质)/kg未处理发酵培养基的量，更优选以至少10g蛋白质(干物质)/kg未处理发酵培养基的量，甚至更优选以至少20g蛋白质(干物质)/kg未处理发酵培养基的量表达。优选地，感兴趣的蛋白质是酶，特别是归类为氧化还原酶(ec1)、转移酶(ec2)、水解酶(ec3)、裂解酶(ec4)、异构酶(ec5)或脂肪酶(ec6)的酶(ec编号根据国际生物化学和分子生物学联合命名委员会的酶命名，推荐(1992)，包括1993-1999公开的增补)。最优选地，酶是水解酶(ec3)，优选地，糖苷酶(ec3.2)或肽酶(ec3.4)。尤为优选的酶是选自淀粉酶(特别是α-淀粉酶(ec3.2.1.1))、纤维素酶(ec3.2.1.4)、乳糖酶(ec3.2.1.108)、甘露聚糖酶(ec3.2.1.25)、脂肪酶、植酸酶(ec3.1.3.8)和蛋白酶的酶；特别是选自淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、植酸酶和纤维素酶的酶，优选地，淀粉酶或蛋白酶，优选地，丝氨酸蛋白酶(ec3.4.21)。最优选是丝氨酸蛋白酶。在优选实施方案中，感兴趣的蛋白酶是洗涤剂酶。在特别优选的实施方案中，以下水解酶是优选的：蛋白酶：合适的蛋白酶包括细菌或真菌来源的那些。蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例是枯草杆菌蛋白酶，尤其是源自芽孢杆菌的那些，例如，novo枯草杆菌蛋白酶、carlberg枯草杆菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168(描述于wo89/06279)。优选地，枯草杆菌蛋白酶是使用由asp32、his64和ser221组成的催化三联体的丝氨酸蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶bpn‘编号)，优选地，枯草杆菌蛋白酶的pi值为ph7.0至ph10.0，优选ph8.0至ph9.5。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)以及wo89/06270和wo94/25583中所述的镰刀菌蛋白酶。因此，优选地，所述酶选自淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、甘露聚糖酶、植酸酶和纤维素酶，优选淀粉酶或蛋白酶，优选枯草杆菌蛋白酶。有用的蛋白酶的实例是wo92/19729、wo98/20115、wo98/20116和wo98/34946中所述的变体，尤其是在以下一个或多个位置具有置换的变体：27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。其他有用的蛋白酶描述于wo2012080201和wo2013060621。另一优选的蛋白酶是根据de102012215642a1的seqidno:1的蛋白酶及其变体，其中优选的变体包括位置3、4、99、194和199的一个或多个突变(使用来自dsm5483的碱性蛋白酶的编号)，优选包括一个或多个以下突变：s3t、v4i、r99e、v194m和v199i，优选s3t、v4i、r99e和v199i，更优选r99e，或r99e结合两个另外的选自s3t、v4i和v199i的突变，优选de102012215642a1的seqidno:1具有r99e或s3t、v4i、v194m和v199i，或s3t、v4i和v199i。另一优选的蛋白酶是根据de102012215642a1的seqidno:2的蛋白酶及其变体，其中优选的变体包括位置99的突变以及位置99和100之间的插入，其中插入是天冬氨酸(asp，d)残基。在这个实施方案中，优选位置99的突变是s99a。其他优选的蛋白酶变体是de102011118032a1的seqidno:7，包括突变s3t、v4i和v205i，或de102011118032a1的seqidno:8，包括突变s3t、v4i、v193m、v199i和l211d，使用来自dsm5483的碱性蛋白酶的编号。优选的商业上可利用的蛋白酶包括alcalase(tm)、savinase(tm)、primase(tm)、duralase(tm)、esperase(tm)和kannase(tm)(novozymesa/s)，maxatase(tm)、maxacal(tm)、maxapem(tm)、properase(tm)、purafect(tm)、purafectoxp(tm)、fn2(tm)、和fn3(tm)(genencorinternationalinc.)。脂肪酶：合适的脂肪酶包括细菌或真菌来源的那些。有用的脂肪酶的实例包括来自腐质霉属(嗜热真菌属(thermomyces)的同义词)的脂肪酶，例如，来自柔毛腐质霉(h.lanuginosa)(绵毛嗜热丝菌(t.lanuginosus))，如ep258068和ep305216中所述的，或来自特异腐质霉，如wo96/13580中所述的，假单胞菌脂肪酶，例如，来自产碱假单胞菌(p.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(p.pseudoalcaligenes)(ep218272)、洋葱假单胞菌(p.cepacia)(ep331376)、施氏假单胞菌(p.stutzeri)(gb1,372,034)、荧光假单胞菌、假单胞菌属菌株sd705(wo95/06720和wo96/27002)、p.wisconsinensis(wo96/12012)、芽孢杆菌脂肪酶，例如，来自枯草芽孢杆菌(dartois等(1993)，biochemicaetbiophysicaacta,1131,253-360)、嗜热脂肪芽孢杆菌(jp64/744992)或短小芽孢杆菌(wo91/16422)。其他实例是脂肪酶变体，如wo92/05249、wo94/01541、ep407225、ep260105、wo95/35381、wo96/00292、wo95/30744、wo94/25578、wo95/14783、wo95/22615、wo97/04079和wo97/07202中所述的那些。优选的商业上可利用的脂肪酶包括lipolase(tm)和lipolaseultra(tm)(novozymesa/s)。淀粉酶：合适的淀粉酶(α和/或β)包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰突变体或蛋白质工程化突变体。淀粉酶包括，例如，获自芽孢杆菌的α-淀粉酶，例如，地衣芽孢杆菌的特定菌株，更详细地描述于gb1,296,839中。有用的淀粉酶的实例是wo94/02597、wo94/18314、wo96/23873和wo97/43424中所述的变体，尤其是在以下的一个或多个位置具有置换的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。商业上可利用的淀粉酶是duramyl(tm)、termamyl(tm)、fungamyl(tm)和bant(tm)(novozymesa/s)、rapidase(tm)和purastar(tm)(来自genencorinternationalinc.)。纤维素酶：合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰突变体或蛋白质工程化突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属、腐质霉属、镰刀菌属、梭孢壳属(thielavia)、支顶孢属(acremonium)的纤维素酶，例如，美国专利no.4,435,307、u.s.5,648,263、u.s.5,691,178、u.s.5,776,757和wo89/09259中公开的产自特异腐质霉、嗜热毁丝霉(myceliophthorathermophila)和尖孢镰刀菌的真菌纤维素酶。尤其合适的纤维素酶是具有护色益处的碱性或中性纤维素酶。这样的纤维素酶的实例是ep0495257、ep0531372、wo96/11262、wo96/29397、wo98/08940中描述的纤维素酶。其他实例是纤维素酶变体，如wo94/07998、ep0531315、美国专利no.5,457,046、u.s.5,686,593、u.s.5,763,254、wo95/24471、wo98/12307和pct/dk98/00299中所述的那些。商业上可利用的纤维素酶包括celluzyme(tm)和carezyme(tm)(novozymesa/s)、clazinase(tm)和puradaxha(tm)(genencorinternationalinc.)和kac-500(b)(tm)(kaocorporation)、氧化还原酶：可以根据本发明处理的氧化还原酶包括过氧化物酶、氧化酶，如漆酶。过氧化物酶：呈现过氧化物酶活性的酶可以是酶分类(ec1.11.1.7)包括的任何过氧化物酶，或从其衍生的呈现过氧化物酶活性的任何片段。特别地，优选重组产生的过氧化物酶，例如，根据wo92/16634的源自鬼伞属的过氧化物酶，特别是长根鬼伞(c.macrorhizus)或灰盖鬼伞(c.cinereus)，或其变体，例如，wo93/24618和wo95/10602中所述的变体。漆酶和漆酶相关的酶：在本发明的上下文中，漆酶和漆酶相关的酶考虑了由酶分类(ec1.10.3.2)包括的任何漆酶，由酶分类(ec1.10.3.1)包括的任何儿茶酚氧化酶，由酶分类(ec1.3.3.5)包括的任何胆红素氧化酶或酶分类(ec1.14.18.1)包括的任何单酚单加氧酶。微生物漆酶可以源自细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)，并且合适的实例包括源自源自曲霉属、镰孢霉属的漆酶，例如，粗糙链孢霉(n.crassa))、柄孢壳菌属(podospora)、botrytis、金线菌属(collybia)、层孔菌属(fomes)、香菇属(lentinus)、侧耳属(pleurotus)、栓菌属(trametes)(例如，绒毛栓菌(t.villosa)和变色栓菌(t.versicolor))、丝核菌属(rhizoctonia)(例如，立枯丝核菌(r.solani))、鬼伞属(例如，褶皱鬼伞(c.plicatilis)和灰盖鬼伞)、小脆柄菇属(psatyrella)、毁丝霉属(例如嗜热毁丝霉)、柱顶孢属(schytalidium)、多孔菌属(polyporus)(例如，p.pinsitus)、射脉菌属(phlebia)(例如射脉菌(p.radita)(wo92/01046))，或革盖菌属(coriolus)(例如，毛革盖菌(c.hirsutus)(jp2-238885)的漆酶，特别是可获自栓菌属、毁丝霉属、柱顶孢属或多孔菌属的漆酶。此外，通过重组dna技术或通过化学修饰制得的感兴趣的蛋白质的蛋白质工程化变体可以是特别感兴趣的。本发明的另一实施方案为具有式(i)的螯合剂在制备微量元素溶液或发酵培养基(优选如本文更详细地描述)中的用途：r1-ch(coox1)-n(ch2coox1)2其中r1选自氢、线性或支化的c1-c4烷基、苯基、苄基、ch2oh和ch2ch2coox1，x1为(mxh1-x)，m为一价阳离子，优选选自铵或碱金属或上述至少两种的组合，x为0-1，其中x为平均值(如本文详细地描述)。本发明的另一实施方案为具有式(i)的螯合剂在发酵生产感兴趣的化合物(优选蛋白质，特别优选酶)(如本文所述)中的用途：r1-ch(coox1)-n(ch2coox1)2其中r1选自氢、线性或支化的c1-c4烷基、苯基、苄基、ch2oh和ch2ch2coox1，x1为(mxh1-x)，m为一价阳离子，优选选自铵或碱金属或上述至少两种的组合，x为0-1，其中x为平均值(如本文所述)。本发明的另一实施方案为具有式(i)的螯合剂在制备微量元素溶液或发酵培养基(优选如本文更详细地描述)中的用途：r1-ch(coox1)-n(ch2coox1)2其中r1选自线性或支化的c1-c4烷基、苯基、苄基和ch2oh，x1为(mxh1-x)，m为一价阳离子，优选选自铵或碱金属或上述至少两种的组合，且x为0-1，其中x为平均值(如本文详细地描述)。本发明的另一实施方案为具有式(i)的螯合剂在制备微量元素溶液或发酵培养基(优选如本文更详细地描述)中的用途：r1-ch(coox1)-n(ch2coox1)2其中r1选自线性或支化的c1-c4烷基，优选甲基，x1为(mxh1-x)，m为一价阳离子，优选选自铵或碱金属或上述至少两种的组合，且x为0-1，其中x为平均值(如本文详细地描述)。从本发明的方法得到的感兴趣的化合物可以由发酵液来纯化和通过本领域已知的方法来加工。在以下实施例中进一步说明本发明，所述实施例并不是打算以任何方式限制所要求保护的本发明的范围。实施例以下实施例只是用于说明本发明。对本领域技术人员显而易见的各种可能的变化也落入本发明的范围内。除非另外指出，通过应用遗传工程和通过培养微生物发酵生产化合物中使用的标准设备、方法、化学品和生物化学品，来进行以下实验。还可以参见sambrook等人(molecularcloning:alaboratorymanual，第2版，coldspringharborlaboratory，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，ny，1989)和chmiel等人(bioprocesstechnik1.einführungindiebioverfahrenstechnik，gustavfischerverlag，stuttgart，1991)。实施例实施例1：具有不同螯合剂对现有技术螯合剂柠檬酸的微量元素溶液在不同温度和ph条件下关于沉淀和颜色形成的比较。制备微量元素溶液：将微量元素溶液与如下螯合剂之一一起混合：柠檬酸、nta、mgda、glda、edta、dtpa、egta或heedta。因此，首先，称量各螯合剂，与所用二价阳离子是等摩尔的。测量ph并将其用25％naoh或20％h2so4调节为ph7.0。然后，添加盐(nh4)2fe(so4)2*6h2o、cuso4*5h2o、znso4*7h2o、mnso4*h2o、co(no3)2、niso4*6h2o和na2moo4*2h2o。每次补充各化合物后，对溶液进行ph值、颜色和沉淀的表征。在添加最后化合物(即na2moo4)后，将溶液等分。一份样品在室温下储存24小时，一份样品在4℃下储存。然后，对样品再次进行ph值、颜色和沉淀行为的表征。将ph值重新调节为ph6，并研究沉淀。结果：具有柠檬酸作为螯合剂的微量元素溶液在添加na2moo4和最后混合后显示出翡翠绿色显色且为清澈透明溶液。测量的ph值为ph4.6。在储存24小时后，沉淀物形成红色丸粒。该状态在ph调节为ph6后甚至更明显。具有氨三乙酸(nta)作为螯合剂的微量元素溶液在添加na2moo4和最后混合后显示出翡翠绿色显色且为清澈透明溶液。测量的ph值为ph2.5。在储存24小时后和在ph调节为ph6后，都没有出现任何沉淀物。具有甲基甘氨酸二乙酸(mgda)作为螯合剂的微量元素溶液在添加na2moo4和最后混合后显示出蓝绿色显色且为清澈透明溶液。测量的ph值为ph2.8。在储存24小时后和在ph调节为ph6后，都没有出现任何沉淀物。具有谷氨酸n,n-二乙酸(glda)作为螯合剂的微量元素溶液在添加na2moo4和最后混合后显示出淡蓝色显色且为清澈透明溶液。测量的ph值为ph3.7。在4℃下储存3小时后，溶液变成绿色并检测到沉淀物。在室温下24小时和ph重新调节为ph6后，溶液颜色变成褐色且形成沉淀物。具有乙二胺四乙酸(edta)作为螯合剂的微量元素溶液在添加cuso4后显示出从淡黄色到淡蓝色显色。在补充cuso4下，出现强烈白色沉淀物。在ph调节为ph4后，沉淀物溶解且在最终混合后显色变成蓝色和透明溶液。测量的ph值为ph3。在储存24小时和ph调节为ph6后，没有注意到进一步沉淀。具有二亚乙基三胺五乙酸(dtpa)作为螯合剂的微量元素溶液在添加na2moo4和最后混合后显示出暗绿色显色且为透明溶液。测量的ph值为ph2.6。在储存24小时和ph调节为ph6后，没有检测到沉淀。具有乙二醇四乙酸(egta)作为螯合剂的微量元素溶液在添加na2moo4和最后混合后显示出暗蓝色显色且为透明溶液。测量的ph值为ph2.7。在储存24小时和ph调节为ph6后，溶液变成更暗和褐色。具有羟乙基乙二胺三乙酸(heedta)作为螯合剂的微量元素溶液在添加na2moo4和最后混合后显示出暗蓝色显色且为透明溶液。测量的ph值为ph2.6。在储存24小时和ph调节为ph6后，没有检测到沉淀。就络合和沉淀而言总结，螯合剂nta、mgda、dtpa和heedta显示出比柠檬酸盐好的结果。实施例2：包含具有不同螯合剂对现有技术螯合剂柠檬酸的微量元素溶液的发酵培养基在不同温度和ph条件下关于沉淀和颜色形成的比较。制备包含具有不同螯合剂的微量元素溶液的培养基：将发酵培养基与不同螯合剂混合。因此，将去离子水、ca(no3)2*4h2o、mgso4*7h2o、nh4h2po4和kh2po4以该特定顺序与相应螯合剂混合。首先，称量各螯合剂，与所用二价阳离子是等摩尔的。在测量ph后，将所有三种培养基各自等分六次。将各培养基的三份等分试样调节为ph6.7，将其他三份样品调节为ph7.7。将样品与如实施例1中所述微量元素溶液混合并在35℃、室温和4℃下储存24小时。然后，表征颜色形成和沉淀。结果：具有柠檬酸作为螯合剂的发酵培养基在不同温度和ph条件下在所有样品中显示出强烈沉淀。具有nta和mgda作为螯合剂的发酵培养基在ph调节为6下就样品而言显示出低沉淀。在ph调节为7.7下就样品而言没有发生沉淀。在不同温度条件下，没有检测到沉淀上区别。实施例3：包含具有不同螯合剂的微量元素溶液的培养基在小规模培养中关于生物质生长和产物形成的比较。微量滴定板培养：对于类似培养物，采用在线监测的微量滴定板培养体系(biolector，m2plabs)。总共以14g/l的量供应葡萄糖，培养48小时。微量元素溶液如上文所述组成，螯合剂柠檬酸盐、mgda、nta、edta、dtpa、heedta或egta在重复时在每种方法中被等摩尔补充。对于两种方法分别将微量元素溶液的ph值调节为ph6.7和ph7.7。作为培养基，补充1g/l的微量元素溶液与螯合剂之一、24g/lkh2po4、2ml/lmgso4*7h2o、8ml/l8％ca(no3)2溶液和5.6g/l(nh4)2no3。用氢氧化钠将ph值调节为ph7.3，并在121℃、1巴的超压下灭菌30分钟。将不同的发酵培养基各自700μl等分到biolector花板(flowerplate)/微量滴定板(m2plabs)，并在30℃，摇动器频率1200rpm下培养48小时，接种地衣芽孢杆菌后，产生枯草杆菌蛋白酶。在培养过程中，每15分钟用光学传感器在线测量生物质生长的氧分压、ph和散射光。产物形成：关于蛋白酶形成的表征，用酪蛋白基活性测定法测量酶活性。结果：生物质的形成以散点图的形式进行测量，以其中mgda或nta补充作为螯合剂的培养基显示出生长最快和最高值。与用于其中柠檬酸盐或egta用作螯合剂的培养的那些相比，生物质生长开始延迟，最大值约低20％。heedta作为螯合剂，显示出强延迟生长和更低生物质形成，在edta或dtpa作为螯合剂的培养物中未检测到生长。与柠檬酸、egta、heedta，尤其是dtpa和edta相比，在微量元素溶液和培养基中补充mgda或nta作为螯合剂的培养物就生长和最大散点值而言显示出更好的(高20％的散点)形成(参见图1)。用不同螯合剂培养导致不同的蛋白酶活性，因此测量不同的酶形成(参见图2和图3，归一化活性单位，au)。mgda和nta的酶活性与现有技术标准柠檬酸盐水平相当。egta作为螯合剂的结果低约25％，heedta作为螯合剂的结果甚至低60％。两种ph值的结果是类似的。实施例4：包含具有不同螯合剂的微量元素溶液的培养基在大规模培养中关于生物质生长和产物形成的比较。在20l规模中培养工艺：在培养基中，以葡萄糖为主要碳源，复合植物蛋白为氮源，在具有ph、po2和温度探针的挡板搅拌槽反应器(str)中进行发酵工艺。通过气体分析监测o2和co2的浓度。对于培养，选择进料-分批模式，初始工作容积为10l。作为生物反应器，21l钢制容器与3台6叶片的rushton涡轮机一起使用。用于种子和主要培养基的培养基制备和灭菌分别在生物反应器中进行。培养基含有复合植物蛋白、nh4h2po4、kh2po4、mn(ii)so4*h2o、fe(ii)so4*7h2o、mgso4*7h2o、ca(no3)2*4h2o、上述微量元素溶液、消泡剂和2ml/lmgda或柠檬酸。将ph值调节为ph6.5。将培养基在生物反应器中在搅拌条件(600rpm)下在121℃下灭菌60分钟。关于接种地衣芽孢杆菌产生枯草杆菌蛋白酶，使用2％的起始工作容积，来自具有相同培养基的种子培养发酵罐。种子培养在37℃下进行，16小时后在指数生长期期间收获。主要培养在37℃下进行，po2依赖的搅拌级联从350-1400rpm，ph7.7，通气速率为1.5vvm。接种8小时后开始葡萄糖进料。w/柠檬酸w/mgda滴定度(生产量)100％104％sty(生产量)100％110％表1：特征性发酵指示物(归一化为％)，对于生物质生长(ctr[mmol/l*h])和蛋白酶形成(滴定度[g/l]，时空产率(sty)[g/l*h]，滴定度/ctr)，对于mgda作为螯合剂，与柠檬酸作为螯合剂比较。如上所示，在利用mgda为螯合剂的发酵工艺中，测得较高的产物滴定度和时空产率(sty)。测定地衣芽孢杆菌培养后发酵液中mgda的浓度，在计算相应稀释步骤后，与培养前发酵培养基中mgda的浓度进行比较。通过用fecl溶液滴定以电位法来测定mgda的浓度。发酵过程期间降解的mgda的量低于5％。当前第1页12