本发明涉及饲料添加剂——微生物制剂领域，具体涉及一种产抗菌肽的枯草芽孢杆菌菌株sx3411。
背景技术：
2013年中华人民共和国农业部第2045号公告饲料添加剂品种目录中规定了34个菌种可用作动物微生物饲料及饲料添加剂，其中就包含了枯草芽孢杆菌。
枯草芽孢杆菌正常情况下对高温的耐受程度比其他类的细菌强很多，因此非常适合于高温制粒饲料应用；枯草芽孢杆菌可产生和分泌多种对动物肠道有益的物质，包括消化酶类、b族维生素和多种抑菌物质。此外，枯草芽孢杆菌刺激动物肠道，激活免疫系统，提高对疾病的抵抗能力。有资料表明枯草芽孢杆菌可以耐唾液和胆汁的攻击，有较好的耐酸碱特性，在酸性胃环境中能保持活性，是微生物中可直达大小肠的活菌。
抗菌肽通常由12～100个氨基酸残基组成，多含疏水性氨基酸，多数是两亲性阳离子肽。天然抗菌肽抗菌谱广，具有热稳定性和较好的水溶性，对高等动物正常细胞几乎无毒害作用，且不易产生耐药性。对不同物种抗菌肽的研究已成为热点，抗菌肽有可能作为新一代的抗菌药物替代传统抗生素。
来源于细菌的抗菌肽也被称为细菌素（bacteriocin）。细菌素是由某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽，通常细菌素都是一些阳离子肽，具有疏水性或两亲性。细菌素根据它们的生物化学性质分为4类：ⅰ类细菌素，被称为硫醚抗生素，分子质量小于5kda，由19～38个氨基酸组成，具有黏膜活性和耐热性，其分子含有罕见的硫醚氨基酸，如羊毛硫氨酸（lanthionine）和β－甲基羊毛硫氨酸(β-methyllanthionine)。ii类细菌素的分子质量比较小(4～6kda)，具有热稳定性，又能被分成三群：（1）iia类（bacteriociniia）为李斯特菌活性多肽（listeria-activepeptides），在n端带共同序列-y-g-n-g-v-x-c-；（2）iib类（bacteriociniib）为二肽细菌素（two-peptidebacteriocins），其抗菌活性要求两个成份；（3）iic类（bacteriociniic）为巯基活性肽，活性要求有还原性半胱氨酸残基。ⅲ类细菌素分子质量大于30kda，为热不稳定蛋白质。iv类细菌素是复合多肽，活性要求包含有脂类或碳水化合物基团。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是：提供一种产抗菌肽枯草芽孢杆菌菌株sx3411，它能在高温和ph2-11条件下有效抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，改善动物肠道健康。为解决上述技术问题，采取的技术方案如下：
本发明提供的产抗菌肽菌株具体为枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）sx3411，该菌种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号cgmccno.14396。
所述枯草芽孢杆菌菌株（bacillussubtilis）sx3411的菌落形态为：菌落表面粗糙不规则且边缘不整齐，菌落不透明，呈现灰白色或略显黄色。
所述枯草芽孢杆菌菌株sx3411筛选自江西省南昌市麻丘镇一养猪场附近，可产抗菌肽，具有抑制革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的特性。
所述枯草芽孢杆菌菌株sx3411经过发酵培养以后，其发酵液经过超滤管超滤以后，所获得的保留液有很好的抑菌活性，而超滤以后的的滤液很少有抑菌活性。这表明其抑菌物质不是小分子物质，而主要是多肽类物质。
所述枯草芽孢杆菌菌株sx3411，在非连续培养的条件下，在培养的18-20小时开始产生抗菌肽，其发酵液具有抑菌活性。
所述枯草芽孢杆菌菌株sx3411所产生的抗菌肽可以在ph2-11的范围内均有较好的抑菌活性,表明枯草芽孢杆菌菌株sx3411所产生抗菌肽有较好的适应酸碱的特性,适合在肠道内起抑菌作用。
所述枯草芽孢杆菌菌株sx3411所产生的抗菌肽有较好的适应高温的特性，可以在80℃高温下仍有抑菌活性。
有益效果：本发明提供的枯草芽孢杆菌菌株sx3411所具有的特性非常适合用于动物肠道健康的改善。其活菌具有抵抗高温，适于饲料的加工；其所产抗菌肽的抑菌活性可以在温度达到80℃高温时仍有活性，适于工业化的生产加工；其所产抗菌肽具有较好的酸碱适应范围，可在强酸的情况下仍有活性，适于在肠道中发挥功能，显著提高营养物质在肠道中的消化吸收。
附图说明
图1.菌株sx341116srdna序列的系统进化树分析结果
图2.sx3411菌株发酵液经过超滤以后的抑菌试验（注：滤纸片直径8mm）
图3.sx3411菌株发酵液经过超滤以后保留液的sds-page分析
图4.sx3411菌株发酵液的抑菌活性（注：滤纸片直径8mm）
图5.ph值对菌株sx3411发酵液中抑菌物质抑菌活性的影响（注：滤纸片直径8mm）
图6.ph值对菌株sx3411发酵液中抑菌物质抑菌活性的影响（注：滤纸片直径8mm）。
具体实施方式
实施例1
菌株的筛选和鉴定：
步骤1.样品采集于江西省南昌市麻丘镇的数个家庭养猪场周边的排粪沟附近，采集点包括猪粪、附近土壤和水体，以10ml的离心管收集每个样品，每次采集30～50个样品，分三次采集。
步骤2.样品收集结束后，在每个装样品的离心管中加入无菌水悬浮样品，随即在100℃沸水中处理样品10min，处理结束后每个样品取100ul涂布于lb固体培养基上，37℃培养24h，收集可能的芽孢杆菌菌落，是为粗筛。
步骤3.粗筛的菌落分别接种在带有0.5mllb液体培养基的1.5ml的离心管中，37℃培养24～30h，而后离心收集上清液，滤纸法用固定大小的滤纸片蘸取上清液，以金黄色葡萄球菌为抑菌对象，筛选有抑菌活性的菌株，获得一株具抑菌活性的菌株sx3411。
步骤4.菌种的鉴定采用16srdna测序的方法。经pcr扩增后，获得的16srdna序列并上传genbank数据库，其序列号（accessionno）为ky848340.1，在ncbi中进行blast比对（见图1），确定菌种为枯草芽孢杆菌，即bacillussubtilissx3411。
实施例2
超滤法粗分离发酵液中的抗菌肽
步骤1.将购买于美国millipore公司的3kd的超滤离心管置于0.2mo1/lnaoh溶液中，浸泡30min以上，取出，浸泡于20%酒精中保存。
步骤2无菌双蒸水清洗超滤管后，取500μl发酵上清液于3kd超滤管中，5,000-10,000r/min离心，中间的离心速度逐步增大，最终超滤管内保留液体积约为40μl，收集保留液和滤液。
步骤3.各取20μl的保留液与滤液进行滤纸片扩散法做抑菌活性实验（滤纸片直径8mm）。以金黄色葡萄球菌为目标菌，结果表明仅有保留液存在较好的抑菌活性，而滤液无抑菌活性（见图2）。这表明小分子的物质无抑菌活性，起抑菌活性的主要是多肽类物质。
步骤4.将超滤离心以后的保留液进行sds-page电泳分析，初步判断抗菌物质为抗菌肽，其分子量比较小，约5kda大小（见图3）。
实施例3
sx3411菌株发酵液抑菌物质对细菌的抑菌活性
步骤1.sx3411菌株的活化
-70℃保存的sx3411菌种取出用新鲜lb液体培养基稀释，用接种环接种至lb固体培养基，37℃恒温培养箱培养12h。挑取单菌落至新鲜lb培养基，37℃于摇床200rpm/min进行扩大培养。
步骤2.指示菌株的活化
用到的革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌（staphylococcusaureus）、枯草芽孢杆菌（bacillussubtilis）（注：非本筛选菌株）和猪链球菌（streptococcussuis）；革兰氏阴性菌种：沙门氏杆菌(salmonellasp)、大肠杆菌(escherichiacoli)和嗜水气单胞杆菌(aeromonas.hydrophila)。这些菌用作为指示菌株测定sx3411发酵液的抑菌活性。
分别将上述菌株经稀释后，使用接种环接种至lb固体培养基，37℃恒温培养箱培养12h。挑取单菌落至新鲜lb培养基，37℃于摇床200rpm/min进行中扩大培养，用紫外分光光度计测量菌液od600，培养至od600=1左右，停止培养。
步骤3.sx3411菌株发酵液的制备
枯草芽孢杆菌sx3411发酵液10000r/min离心15min，弃菌体取上清液，即得到抗菌物质粗提液。
步骤4.指示菌悬液的制备
将培养至od600=1时的指示菌分别用新鲜灭菌的lb液体培养基进行梯度稀释，得到10-1、10-2、10-3、10-4的指示菌悬液。
步骤5.涂布法制备抑菌平板
配制好lb固体培养基，121℃灭菌20min，冷却至大约55℃左右时，每个培养皿倾倒约30ml；凝固后，加入100ul指示菌悬液在平板中均匀涂布，菌液不可过多，以平板上无液体流淌为宜，37℃培养10min。
步骤6.滤纸片法测定sx3411菌株发酵液的抑菌物质的抑菌活性
使用无菌的新鲜lb液体培养基作为对照，将2层滤纸片轻轻粘在制备好的抑菌平板上，轻轻按压一下。取25μlsx3411菌株的发酵液缓慢滴到直径为8mm的圆形滤纸片上，按照顺时针方向进行实验。加完样品后，放在4℃冰箱4h以上使发酵液在琼脂糖平板上充分扩散，然后放置在37℃恒温培养箱培养12h左右，定时查看抑菌圈出现的情况，做好记录和测量抑菌圈直径。经过发酵培养60h以后，sx3411菌株发酵液的抑菌活性得到体现。研究表明，sx3411菌株发酵液可抑制所有的革兰氏阳性菌，即金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和猪链球菌，在发酵的18h时开始有抑菌活性，在36-42h时有最好抑菌活性（见图4）；而对革兰氏阴性菌沙门氏杆菌和大肠杆菌无抑菌活性，对嗜水气单胞杆菌有较好的抑菌活性，在发酵的16h时开始有抑菌活性，在42h时有最高抑菌活性（见图4）。
实施例4
菌株sx3411发酵液抑菌物质理化性质分析
步骤1.选用菌株sx3411在最适发酵时间下的发酵液进行理化性质的研究，以金黄色葡萄球菌为指示菌株，按照实施例3中的实验步骤进行菌株sx3411的发酵培养，获得带抑菌物质的发酵液。
步骤2.ph值对菌株sx3411发酵液中抑菌物质抑菌活性的影响
分别取上述得到的sx3411菌株发酵液，分别用1mol/lhcl溶液和1mol/lnaoh溶液调节至ph=2、ph=4、ph=5、ph=7、ph=8、ph=9、ph=10、ph=11、ph=12及无处理的菌株发酵液做阳性对照(ck﹢)，25℃下处理1h。处理结束后用灭菌的新鲜lb液体培养基为空白对照(ck﹣)，检测不同ph处理下发酵液抑制金黄色葡萄球菌活性。结果表明，在ph2～11范围内，sx3411菌株发酵液抑菌成份仍有抑菌活性，且稳定（见图5）。
步骤3.温度对菌株sx3411发酵液中抑菌物质抑菌活性的影响
分别取上述得到的sx3411菌株发酵液，分别在40℃、60℃、80℃、100℃下各处理30min和1h，处理结束后以未处理的发酵液（ck﹢）和灭菌新鲜的lb液体培养基(ck﹣)为对照，检测不同温度处理下对发酵液活性的影响。结果表明，在处理30min时，菌株sx3411发酵液抑菌物质的抑菌活性在检测的40～80℃范围内，抑菌活性衰减的慢（见图6）；而处理60min时，其抑菌活性随温度升高而衰减。这两种处理时间的sx3411菌株发酵液均在80℃处理后仍有抑菌活性（见图6）。
序列表
<110>江西天佳生物工程股份有限公司
江西师范大学
<120>一株产抗菌肽的枯草芽孢杆菌菌株sx3411
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1434
<212>dna
<213>枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)
<400>1
aatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacggg60
tgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaa120
taccggatggttgtttgaaccgcatggttcaaacataaaaggtggcttcggctaccactt180
acagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgat240
gcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcct300
acgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgc360
gtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtaccgtt420
cgaatagggcggtaccttgacggtacctaaccagaargccacgggctaactacgtgccag480
gcagccgcggtaataacgtaggtggcaaagcgttgtccggaaattattgggcgtaaaggg540
ctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcatt600
ggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaat660
gcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgct720
gaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaac780
gatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagca840
ctccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaagggawttgacgggggcccgca900
caagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaacctttaccaggtcttga960
catcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcsggggcagagtgacaggtggtgc1020
atggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccc1080
ttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccgg1140
aggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgct1200
acaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgtt1260
ctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcg1320
gatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacg1380
agagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaacctttaggagccagccgccgaa1434