本发明属于生产高纯度莱菔素的技术领域，特别涉及一种连续稳定生产高纯度莱菔素的方法。
背景技术：
十字花科蔬菜中含有大量的硫苷及黑芥子酶，人们在食用此类蔬菜的过程中，蔬菜中存在的黑芥子酶与硫苷充分接触，硫苷快速生成异硫氰酸酯类、硫氰酸酯类和腈类等化合物。现代研究表明，异硫氰酸酯类化合物具有诱导Ⅱ相解毒酶活性、可显著提高人体清除致癌物质的能力以及较强的抑制癌细胞生长增殖的活性，从而赋予了十字花科蔬菜防癌抗癌的功效。
硫苷广泛存在于十字花科植物的种子、根、茎、叶和花蕾中，并且其含量、种类存在较大差异。其中，萝卜苷（4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基硫苷，glucoraphenin）主要分布于萝卜籽中，在一定条件下，黑芥子酶可催化萝卜苷生成莱菔素（4-甲基亚磺酰基-3-丁烯基异硫氰酸酯，sulforaphene）。莱菔素具有抗菌、抗炎、抗突变和抗癌等药理活性，应用前景广阔，市场潜力巨大。
现有生产高纯度莱菔素的方法，如2015年9月2日公开的公开号为CN 104876843A“一种从胭脂萝卜籽中制备高纯度莱菔素的方法”的发明专利，该专利公开的方法是：以市售脱脂后的胭脂萝卜籽粉为原料，经酶解、离心、树脂分离、高效液相色谱制备分离，制备出莱菔素制备液；最后通过醇水快速置换、浓缩以及冷冻干燥，得到高纯度莱菔素产品。该方法存在的主要缺点有：①使用了高效液相色谱作为高纯度产品的制备手段，导致了设备投资以及生产中所需的填料成本较高，且不利于大规模生产。②制备高纯度莱菔素冻干物过程中，由于莱菔素性质及工艺工程特点，导致预冻十分困难，以至于所需预冻温度低，预冻时间长，能耗高，增加了生产成本。③市售脱脂后的胭脂萝卜籽粉多为榨油后产品，在榨油过程中温度较高，造成部分黑芥子酶失活，导致萝卜苷水解不完全，莱菔素收率低，资源浪费大。④所用设备昂贵，技术要求较高，生产能力有限，不便于工业化生产。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有生产莱菔素方法的不足之处，提供一种连续稳定生产高纯度莱菔素的方法，该方法具有生产工艺简单、稳定、连续、易于放大，产品收率高，设备投资成本低，生产成本低，资源综合利用率高等特点。采用本发明方法制备出的高纯度莱菔素具有产品纯度高、性能稳定等特点。
本发明的机理是：采用双水相萃取技术对粗黑芥子酶进行纯化，利用聚乙二醇和硫酸铵在水中以适当的浓度形成互不相容的两水相体系，根据被分离物质在两相体系间的选择性分配，达到纯化黑芥子酶的目的，并可有效保持黑芥子酶的活性及构型。以直链二胺类物质作为柔性链修饰载体，再将黑芥子酶结合到柔性链上，实现酶的柔性固定。酶在进行柔性固定化时，与载体的柔性表面发生接触碰撞，不易造成酶构象改变，可减少酶活的降低。另外，由于酶固定在柔性链上，相对于刚性固定化，酶有很好的自由度、活动性，空间位阻较小，柔性固定化酶与底物作用时，可更好的保留酶游离态的均相催化活性。将固定化黑芥子酶反应柱和莱菔素纯化柱结合，同时实现莱菔素的生成与分离。对得到的低纯度莱菔素采用离心萃取进一步纯化，轻重两相溶液按一定比例分别从两个进料管口进入转鼓和壳体之间形成的环隙型混合区内，借助转鼓的旋转，通过涡轮盘和叶轮使两相快速混合和分散，两相溶液得到充分的传质。混合液在涡流盘的作用下进入转鼓，在福板形成的隔舱区内，混合液很快与转鼓同步回转，在离心力的作用下，比重大的重相液在向上流动过程中逐步远离转鼓中心而靠向转鼓壁；比重小的轻相液体逐步远离转鼓壁而靠向中心，澄清后的两相液体最终分别通过各自堰板进入收集室并由引管分别引出机外，完成两相分离过程。从莱菔素生成、吸附分离、离心萃取，工艺过程连续、周期短，实现莱菔素从水相体系中的快速脱离，从而提高了工艺与产品稳定性。
本发明的目的是这样实现的：一种连续稳定生产莱菔素的方法，以粗黑芥子酶、交联壳聚糖微球、萝卜籽粕为原料，经过预处理、固定化酶、反渗透、离心萃取、真空浓缩等生产得到高纯度莱菔素。其具体的方法步骤如下：
（1）制备黑芥子酶预处理液
以市售的粗黑芥子酶为原料，按照粗黑芥子酶的质量（g）：缓冲溶液的体积（mL）比为1：60～150的比例，先将粗黑芥子酶加入到缓冲溶液中，缓慢搅拌混合均匀后，放入超声波处理器中，进行超声处理10～15min，用于对粗黑芥子酶的活化与分散。超声完成后，再泵入真空过滤机中，进行真空过滤，分别收集过滤液和滤渣。对于收集的滤渣，经烘干破碎后，可用作饲料添加剂；对于收集的过滤液，即为黑芥子酶预处理液，用作下一步处理。其中，缓冲溶液为pH 6.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液或pH 6.5的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液或pH 6.5的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲溶液。
（2）制备黑芥子酶冻干粉
按照黑芥子酶预处理液：质量分数为20～30%的分子量为600-1000的聚乙二醇溶液：质量分数为15～30%的硫酸铵溶液体积之比为1：2～4：2～4的比例，先将黑芥子酶预处理液、聚乙二醇溶液、硫酸铵溶液混合均匀，然后再泵入分离型管式离心机中，在转速为6000～8000r/min的条件下，进行离心，分别收集离心轻液和离心重液。对于收集的离心轻液，富含聚乙二醇，经调配后，可继续用于第（2）步；对于收集的离心重液，再泵入截留分子量为300～600Da的纳滤器中，在0.25～0.35MPa下，进行第一次纳滤分离，直至纳滤截留液的体积为原体积的10～20%时止，分别收集第一次纳滤滤过液和第一次纳滤截留液。对于收集的第一次纳滤截留液，补充去离子水至原体积，在同等条件下，进行第二次纳滤分离，直至第二次纳滤截留液的体积减少为原体积的5～10%时止，分别收集第二次纳滤滤过液和第二次纳滤截留液。对于收集的第一次和第二次纳滤滤过液，富含硫酸铵，经调配可继续用于第（2）步。对于收集的第二次纳滤截留液，置于-16～-20℃下，预冻2～4h，然后再放置于冷冻干燥机中，在30～60Pa、-50～-60℃下，进行冷冻干燥24～36h，就制备出黑芥子酶冻干粉，用作下一步处理。
（3）制备固定化黑芥子酶
以市售交联壳聚糖微球为原料，按照交联壳聚糖微球的质量（g）：二胺溶液的体积（mL）：质量分数为1.0～2.5%的戊二醛溶液的体积（mL）比为1：12～30：1.5～3.0，先将交联壳聚糖微球分散于二胺溶液中，搅拌均匀后，再加入戊二醛溶液，在60℃下搅拌反应1～1.5h；抽滤后收集滤饼，并按照滤饼的质量（g）：体积分数为40～60%乙醇溶液的体积（mL）比为1：3～5的比例，用乙醇溶液洗涤滤饼，就制备得到了接枝二胺交联壳聚糖微球。按照黑芥子酶冻干粉的质量（g）：pH 6.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液体积（mL）比为1：40～60的比例，先将黑芥子酶冻干粉加入到缓冲溶液中，得到黑芥子酶溶液，再按照接枝二胺交联壳聚糖微球的质量（g）：黑芥子酶溶液的体积（mL）：丙二醛质量浓度为15%的丙二醛溶液的体积（mL）比为1：50～80：4～8的比例，将接枝二胺交联壳聚糖微球加入黑芥子酶溶液中，浸泡1～3h，再加入丙二醛溶液，在温度为30～40℃下进行固定化酶反应2～4h，反应完成后，进行抽滤，分别收集抽滤渣和抽滤液。对于收集的抽滤渣，用2倍于抽滤渣体积的去离子水对抽滤渣进行洗涤，除去夹杂的游离黑芥子酶和丙二醛，分别收集洗涤渣和洗涤液。对于收集的洗涤渣，即为制备出的固定化黑芥子酶，在4℃的条件下保存备用；对于收集的洗涤液，与收集的抽滤液合并、浓缩、调配后，可再次用于固定化黑芥子酶。其中，二胺溶液为质量分数为7.5% 1,2-乙二胺或10% 1,6-己二胺或14.5% 1,10-癸二胺。
（4）制备萝卜苷粗提物
以萝卜籽粕为原料，按照萝卜籽粕的质量（kg）：体积分数为50～80%乙醇溶液的体积（L）之比为1：6～9的比例，先在室温下连续搅拌浸提4～7h，再用质量分数为2～6%的柠檬酸溶液调节pH至2～3，然后再泵入澄清型管式离心机中，在转速为15000～20000r/min的条件下，进行离心，分别收集离心清液和沉渣。对于收集的沉渣，因含有丰富的蛋白质，经干燥处理后可用作动物饲料添加剂。对于收集的离心清液，泵入反渗透浓缩器中，在0.15～0.25MPa下，进行第一次反渗透浓缩，直到第一次反渗透截留液的体积减少至原体积的10～15%为止，分别收集第一次反渗透透过液和第一次反渗透截留液。在收集的第一次反渗透截留液中，加入去离子水，补充至原体积，在同等条件下，再进行第二次反渗透浓缩，直到第二次反渗透截留液的体积减少至原体积的5～10%为止，分别收集第二次反渗透透过液和第二次反渗透截留液。对于收集第二次反渗透截留液，置于-16～-20℃下，预冻2～4h，然后再放置于冷冻干燥机中，在30～60Pa、-50～-60℃下，进行冷冻干燥24～36h，就制备出萝卜苷粗提物，用作下一步处理；对于收集的第二次反渗透透过液，与收集的第一次反渗透透过液合并，采用升膜式蒸发器回收乙醇，经调配后得到体积分数为50～80%乙醇溶液，可继续使用。
（5）制备反应分离耦合固定化酶反应器
将制备得到的固定化黑芥子酶装入层析柱中，用与固定化黑芥子酶等体积的去离子水进行反冲，就得到固定化黑芥子酶反应柱，用于萝卜苷酶解。将市售已活化的吸附树脂（SP207树脂或D101树脂或SP750树脂）分散于去离子水中，并装配成吸附树脂层析柱，再用与吸附树脂层析柱等体积的去离子水进行反冲，排出吸附树脂层析柱中的气泡，就得到了莱菔素纯化柱，用于分离生成的莱菔素。将固定化黑芥子酶反应柱和莱菔素纯化柱进行连接，就组装出反应分离耦合固定化酶反应器，收集备用。对于收集的反冲液，泵入生化处理池，进行生化处理，达标后排放。
（6）制备低纯度莱菔素
按照萝卜苷粗提物的质量（g）：pH 6.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液的体积（mL）为1：15～20的比例，将萝卜苷粗提物分散于缓冲溶液中，得到萝卜苷粗提物溶液，再按照固定化黑芥子酶反应柱：萝卜苷粗提物溶液的体积比为1：5～8的比例，将萝卜苷溶液以流速为固定化黑芥子酶反应柱体积的6～10倍/小时的速度，泵入固定化黑芥子酶反应柱中，进行连续反应与吸附。反应与吸附完成后，将固定化黑芥子酶反应柱流出端与吸附了莱菔素的莱菔素纯化柱断开。再按照莱菔素纯化柱：体积分数为40～60%的乙醇溶液的体积比为1：1～3的比例，乙醇溶液为洗脱液，洗脱液流速为莱菔素纯化柱体积的2～4倍/小时，将洗脱液泵入吸附了莱菔素的莱菔素纯化柱中，进行莱菔素洗脱分离。对于收集的洗脱液，泵入到真空薄膜蒸发器中，在真空度为0.09～0.095MPa、温度为20～30℃条件下，进行真空薄膜蒸发，得到低纯度莱菔素，纯度达88.2～90.5%。其中，反应分离耦合固定化酶反应器中的固定化黑芥子酶反应柱和莱菔素纯化柱活化后可重复多次使用。
（7）制备高纯度莱菔素
按照低纯度莱菔素的质量（g）：去离子水的体积（mL）的比例为1：10～20的比例，将低纯度莱菔素溶于去离子水中，得到低纯度莱菔素溶液。按照低纯度莱菔素溶液：二氯甲烷的体积比为1：1～2的比例，将低纯度莱菔素溶液与二氯甲烷分别以流速80～100mL/min泵入离心萃取机中，分别收集水相和油相。油相泵入到真空浓缩器中，在真空度为0.09～0.095MPa、温度为20～30℃条件下，进行真空浓缩，得到高纯度莱菔素。莱菔素纯度达98.6～99.7%，总收率达90.7～91.5%。回收的二氯甲烷可继续用于离心萃取，水相可再次用于低纯度莱菔素溶液的配制。
本发明采用上述技术方案后，主要有以下效果：
1、采用双水相萃取技术纯化黑芥子酶，具有传质速度快、分相时间短、能耗较低、分离步骤少、效率高、处理容量大、条件温和、易于工业化放大、不会引起黑芥子酶的失活或变性等优点。
2、基于直链二胺类物质作为柔性链，实现黑芥子酶的柔性固定，酶活力回收率达89.4%，重复使用半衰期超过50次，显著改善了固定化酶系统活力低、稳定性差等问题。
3、利用外源性固定化黑芥子酶作为催化剂，解决了萝卜籽粕中酶活性低而导致的莱菔素收率低问题。
4、工艺过程从莱菔素生成、吸附分离、离心萃取到得到高纯度莱菔素产品，过程连续、周期短，实现莱菔素从水相体系中的快速脱离，从而提高了工艺与产品稳定性。
5、采用离心萃取设备代替传统萃取设备，具有处理量大、传质效率高、节能效果好、设备占地面积小、综合投资成本低等特点。
6、本技术工艺可获得两种不同纯度的莱菔素，满足不同的市场需求，实现最大化利用。
7、本发明开发出一套设备投资成本低、生产成本低、资源综合利用率高且适合工业化的生产方法，具有重要的应用价值。
8、本发明得到的莱菔素产品稳定性好，能在-4℃长期保存。
采用本发明方法制备的产品，可广泛应用于医药、保健品、食品和日化等行业。
四、具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步说明本发明。
实施例1
一种连续稳定生产莱菔素的方法，具体方法步骤如下：
（1）制备黑芥子酶预处理液
以市售的粗黑芥子酶为原料，按照粗黑芥子酶的质量：缓冲溶液的体积比为1 g：60 mL的比例，先将粗黑芥子酶加入到缓冲溶液中，缓慢搅拌混合均匀后，放入超声波处理器中，进行超声处理10min；超声完成后，再泵入真空过滤机中，进行真空过滤，分别收集过滤液和滤渣；其中，缓冲溶液为pH 6.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液。
（2）制备黑芥子酶冻干粉
按照黑芥子酶预处理液：质量分数为20%的分子量为600-1000的聚乙二醇溶液：质量分数为15～30%的硫酸铵溶液体积之比为1：2：2的比例，先将黑芥子酶预处理液、聚乙二醇溶液、硫酸铵溶液混合均匀，然后再泵入分离型管式离心机中，在转速为6000r/min的条件下，进行离心，分别收集离心轻液和离心重液；对于收集的离心重液，再泵入截留分子量为300Da的纳滤器中，在0.25MPa下，进行第一次纳滤分离，直至纳滤截留液的体积为原体积的10%时止，分别收集第一次纳滤滤过液和第一次纳滤截留液；对于收集的第一次纳滤截留液，补充去离子水至原体积，在同等条件下，进行第二次纳滤分离，直至第二次纳滤截留液的体积减少为原体积的5%时止，分别收集第二次纳滤滤过液和第二次纳滤截留液；对于收集的第二次纳滤截留液，置于-16℃下，预冻2h，然后再放置于冷冻干燥机中，在30Pa、-50℃下，进行冷冻干燥24h，就制备出黑芥子酶冻干粉，用作下一步处理。
（3）制备固定化黑芥子酶
以市售交联壳聚糖微球为原料，按照交联壳聚糖微球的质量：二胺溶液的体积：质量分数为1.0%的戊二醛溶液的体积比为1 g：12 mL：1.5 mL，先将交联壳聚糖微球分散于二胺溶液中，搅拌均匀后，再加入戊二醛溶液，在60℃下搅拌反应1h；抽滤后收集滤饼，并按照滤饼的质量：体积分数为40%乙醇溶液的体积比为1 g：3 mL的比例，用乙醇溶液洗涤滤饼，就制备得到了接枝二胺交联壳聚糖微球；按照黑芥子酶冻干粉的质量：pH 6.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液体积比为1 g：40mL的比例，先将黑芥子酶冻干粉加入到缓冲溶液中，得到黑芥子酶溶液，再按照接枝二胺交联壳聚糖微球的质量：黑芥子酶溶液的体积：丙二醛质量浓度为15%的丙二醛溶液的体积比为1 g：50 mL：4mL的比例，将接枝二胺交联壳聚糖微球加入黑芥子酶溶液中，浸泡1h，再加入丙二醛溶液，在温度为30℃下进行固定化酶反应2h，反应完成后，进行抽滤，分别收集抽滤渣和抽滤液对于收集的抽滤渣，用2倍于抽滤渣体积的去离子水对抽滤渣进行洗涤，分别收集洗涤渣和洗涤液；对于收集的洗涤渣，即为制备出的固定化黑芥子酶，在4℃的条件下保存备用；其中，二胺溶液为质量分数为7.5% 1,2-乙二胺。
（4）制备萝卜苷粗提物
以萝卜籽粕为原料，按照萝卜籽粕的质量：体积分数为50%乙醇溶液的体积之比为1 kg：6 L的比例，先在室温下连续搅拌浸提4h，再用质量分数为2%的柠檬酸溶液调节pH至2，然后再泵入澄清型管式离心机中，在转速为15000r/min的条件下，进行离心，分别收集离心清液和沉渣；对于收集的离心清液，泵入反渗透浓缩器中，在0.15MPa下，进行第一次反渗透浓缩，直到第一次反渗透截留液的体积减少至原体积的10%为止，分别收集第一次反渗透透过液和第一次反渗透截留液；在收集的第一次反渗透截留液中，加入去离子水，补充至原体积，在同等条件下，再进行第二次反渗透浓缩，直到第二次反渗透截留液的体积减少至原体积的5%为止，分别收集第二次反渗透透过液和第二次反渗透截留液；对于收集第二次反渗透截留液，置于-16℃下，预冻2h，然后再放置于冷冻干燥机中，在30Pa、-50℃下，进行冷冻干燥24h，就制备出萝卜苷粗提物，用作下一步处理。
（5）制备反应分离耦合固定化酶反应器
将制备得到的固定化黑芥子酶装入层析柱中，用与固定化黑芥子酶等体积的去离子水进行反冲，就得到固定化黑芥子酶反应柱；将市售已活化的吸附树脂，即SP207树脂，分散于去离子水中，并装配成吸附树脂层析柱，再用与吸附树脂层析柱等体积的去离子水进行反冲，就得到了莱菔素纯化柱；将固定化黑芥子酶反应柱和莱菔素纯化柱进行连接，就组装出反应分离耦合固定化酶反应器，收集备用。
（6）制备低纯度莱菔素
按照萝卜苷粗提物的质量：pH 6.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液的体积为1 g：15mL的比例，将萝卜苷粗提物分散于缓冲溶液中，得到萝卜苷粗提物溶液，再按照固定化黑芥子酶反应柱：萝卜苷粗提物溶液的体积比为1：5的比例，将萝卜苷溶液以流速为固定化黑芥子酶反应柱体积的6倍/小时的速度，泵入固定化黑芥子酶反应柱中，进行连续反应与吸附；反应与吸附完成后，将固定化黑芥子酶反应柱流出端与吸附了莱菔素的莱菔素纯化柱断开；再按照莱菔素纯化柱：体积分数为40%的乙醇溶液的体积比为1：1的比例，乙醇溶液为洗脱液，洗脱液流速为莱菔素纯化柱体积的2倍/小时，将洗脱液泵入吸附了莱菔素的莱菔素纯化柱中，进行莱菔素洗脱分离；对于收集的洗脱液，泵入到真空薄膜蒸发器中，在真空度为0.09MPa、温度为20℃条件下，进行真空薄膜蒸发，得到低纯度莱菔素，纯度达88.2%。
（7）制备高纯度莱菔素
按照低纯度莱菔素的质量：去离子水的体积的比例为1 g：10mL的比例，将低纯度莱菔素溶于去离子水中，得到低纯度莱菔素溶液；按照低纯度莱菔素溶液：二氯甲烷的体积比为1：1的比例，将低纯度莱菔素溶液与二氯甲烷分别以流速80mL/min泵入离心萃取机中，分别收集水相和油相；油相泵入到真空浓缩器中，在真空度为0.09MPa、温度为20℃条件下，进行真空浓缩，得到高纯度莱菔素；莱菔素纯度达98.6%，总收率达90.7%。
实施例2
一种灰毡毛忍冬叶含漱液的制备方法，具体方法步骤如下：
（1）制备黑芥子酶预处理液
以市售的粗黑芥子酶为原料，按照粗黑芥子酶的质量：缓冲溶液的体积比为1 g：100 mL的比例，先将粗黑芥子酶加入到缓冲溶液中，缓慢搅拌混合均匀后，放入超声波处理器中，进行超声处理12min；超声完成后，再泵入真空过滤机中，进行真空过滤，分别收集过滤液和滤渣；其中，缓冲溶液为pH 6.5的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲溶液。
（2）制备黑芥子酶冻干粉
按照黑芥子酶预处理液：质量分数为25%的分子量为600-1000的聚乙二醇溶液：质量分数为20%的硫酸铵溶液体积之比为1：3：3的比例，先将黑芥子酶预处理液、聚乙二醇溶液、硫酸铵溶液混合均匀，然后再泵入分离型管式离心机中，在转速为7000r/min的条件下，进行离心，分别收集离心轻液和离心重液；对于收集的离心重液，再泵入截留分子量为400Da的纳滤器中，在0.30MPa下，进行第一次纳滤分离，直至纳滤截留液的体积为原体积的15%时止，分别收集第一次纳滤滤过液和第一次纳滤截留液；对于收集的第一次纳滤截留液，补充去离子水至原体积，在同等条件下，进行第二次纳滤分离，直至第二次纳滤截留液的体积减少为原体积的8%时止，分别收集第二次纳滤滤过液和第二次纳滤截留液；对于收集的第二次纳滤截留液，置于-18℃下，预冻3h，然后再放置于冷冻干燥机中，在45Pa、-55℃下，进行冷冻干燥30h，就制备出黑芥子酶冻干粉，用作下一步处理。
（3）制备固定化黑芥子酶
以市售交联壳聚糖微球为原料，按照交联壳聚糖微球的质量：二胺溶液的体积：质量分数为1.8%的戊二醛溶液的体积比为1 g：16 mL：2.2 mL，先将交联壳聚糖微球分散于二胺溶液中，搅拌均匀后，再加入戊二醛溶液，在60℃下搅拌反应1.2h；抽滤后收集滤饼，并按照滤饼的质量：体积分数为50%乙醇溶液的体积比为1 g：4 mL的比例，用乙醇溶液洗涤滤饼，就制备得到了接枝二胺交联壳聚糖微球；按照黑芥子酶冻干粉的质量：pH 6.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液体积比为1 g：50 mL的比例，先将黑芥子酶冻干粉加入到缓冲溶液中，得到黑芥子酶溶液，再按照接枝二胺交联壳聚糖微球的质量：黑芥子酶溶液的体积：丙二醛质量浓度为15%的丙二醛溶液的体积比为1 g：65 mL：6 mL的比例，将接枝二胺交联壳聚糖微球加入黑芥子酶溶液中，浸泡2h，再加入丙二醛溶液，在温度为35℃下进行固定化酶反应3h，反应完成后，进行抽滤，分别收集抽滤渣和抽滤液对于收集的抽滤渣，用2倍于抽滤渣体积的去离子水对抽滤渣进行洗涤，分别收集洗涤渣和洗涤液；对于收集的洗涤渣，即为制备出的固定化黑芥子酶，在4℃的条件下保存备用；其中，二胺溶液为质量分数为10% 1,6-己二胺。
（4）制备萝卜苷粗提物
以萝卜籽粕为原料，按照萝卜籽粕的质量：体积分数为65%乙醇溶液的体积之比为1 kg：7 L的比例，先在室温下连续搅拌浸提5h，再用质量分数为4%的柠檬酸溶液调节pH至2.5，然后再泵入澄清型管式离心机中，在转速为18000r/min的条件下，进行离心，分别收集离心清液和沉渣；对于收集的离心清液，泵入反渗透浓缩器中，在0.20MPa下，进行第一次反渗透浓缩，直到第一次反渗透截留液的体积减少至原体积的12%为止，分别收集第一次反渗透透过液和第一次反渗透截留液；在收集的第一次反渗透截留液中，加入去离子水，补充至原体积，在同等条件下，再进行第二次反渗透浓缩，直到第二次反渗透截留液的体积减少至原体积的8%为止，分别收集第二次反渗透透过液和第二次反渗透截留液；对于收集第二次反渗透截留液，置于-18℃下，预冻3h，然后再放置于冷冻干燥机中，在45Pa、-55℃下，进行冷冻干燥30h，就制备出萝卜苷粗提物，用作下一步处理。
（5）制备反应分离耦合固定化酶反应器
将制备得到的固定化黑芥子酶装入层析柱中，用与固定化黑芥子酶等体积的去离子水进行反冲，就得到固定化黑芥子酶反应柱；将市售已活化的吸附树脂，即D101树脂，分散于去离子水中，并装配成吸附树脂层析柱，再用与吸附树脂层析柱等体积的去离子水进行反冲，就得到了莱菔素纯化柱；将固定化黑芥子酶反应柱和莱菔素纯化柱进行连接，就组装出反应分离耦合固定化酶反应器，收集备用。
（6）制备低纯度莱菔素
按照萝卜苷粗提物的质量：pH 6.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液的体积为1 g：18mL的比例，将萝卜苷粗提物分散于缓冲溶液中，得到萝卜苷粗提物溶液，再按照固定化黑芥子酶反应柱：萝卜苷粗提物溶液的体积比为1：6的比例，将萝卜苷溶液以流速为固定化黑芥子酶反应柱体积的8倍/小时的速度，泵入固定化黑芥子酶反应柱中，进行连续反应与吸附；反应与吸附完成后，将固定化黑芥子酶反应柱流出端与吸附了莱菔素的莱菔素纯化柱断开；再按照莱菔素纯化柱：体积分数为50%的乙醇溶液的体积比为1：2的比例，乙醇溶液为洗脱液，洗脱液流速为莱菔素纯化柱体积的3倍/小时，将洗脱液泵入吸附了莱菔素的莱菔素纯化柱中，进行莱菔素洗脱分离；对于收集的洗脱液，泵入到真空薄膜蒸发器中，在真空度为0.092MPa、温度为25℃条件下，进行真空薄膜蒸发，得到低纯度莱菔素，纯度达90.5%。
（7）制备高纯度莱菔素
按照低纯度莱菔素的质量：去离子水的体积的比例为1 g：15 mL的比例，将低纯度莱菔素溶于去离子水中，得到低纯度莱菔素溶液；按照低纯度莱菔素溶液：二氯甲烷的体积比为1：1.5的比例，将低纯度莱菔素溶液与二氯甲烷分别以流速90mL/min泵入离心萃取机中，分别收集水相和油相；油相泵入到真空浓缩器中，在真空度为0.092MPa、温度为25℃条件下，进行真空浓缩，得到高纯度莱菔素；莱菔素纯度达99.7%，总收率达91.5%。
实施例3
一种灰毡毛忍冬叶含漱液的制备方法，具体方法步骤如下：
（1）制备黑芥子酶预处理液
以市售的粗黑芥子酶为原料，按照粗黑芥子酶的质量：缓冲溶液的体积比为1 g：150 mL的比例，先将粗黑芥子酶加入到缓冲溶液中，缓慢搅拌混合均匀后，放入超声波处理器中，进行超声处理10min；超声完成后，再泵入真空过滤机中，进行真空过滤，分别收集过滤液和滤渣；其中，缓冲溶液为pH 6.5的柠檬酸钠-柠檬酸缓冲溶液。
（2）制备黑芥子酶冻干粉
按照黑芥子酶预处理液：质量分数为30%的分子量为600-1000的聚乙二醇溶液：质量分数为30%的硫酸铵溶液体积之比为1：4：4的比例，先将黑芥子酶预处理液、聚乙二醇溶液、硫酸铵溶液混合均匀，然后再泵入分离型管式离心机中，在转速为8000r/min的条件下，进行离心，分别收集离心轻液和离心重液；对于收集的离心重液，再泵入截留分子量为600Da的纳滤器中，在0.35MPa下，进行第一次纳滤分离，直至纳滤截留液的体积为原体积的20%时止，分别收集第一次纳滤滤过液和第一次纳滤截留液；对于收集的第一次纳滤截留液，补充去离子水至原体积，在同等条件下，进行第二次纳滤分离，直至第二次纳滤截留液的体积减少为原体积的10%时止，分别收集第二次纳滤滤过液和第二次纳滤截留液；对于收集的第二次纳滤截留液，置于-20℃下，预冻4h，然后再放置于冷冻干燥机中，在60Pa、-60℃下，进行冷冻干燥36h，就制备出黑芥子酶冻干粉，用作下一步处理。
（3）制备固定化黑芥子酶
以市售交联壳聚糖微球为原料，按照交联壳聚糖微球的质量：二胺溶液的体积：质量分数为2.5%的戊二醛溶液的体积比为1 g：30 mL：3.0 mL，先将交联壳聚糖微球分散于二胺溶液中，搅拌均匀后，再加入戊二醛溶液，在60℃下搅拌反应1.5h；抽滤后收集滤饼，并按照滤饼的质量：体积分数为60%乙醇溶液的体积比为1 g：5 mL的比例，用乙醇溶液洗涤滤饼，就制备得到了接枝二胺交联壳聚糖微球；按照黑芥子酶冻干粉的质量：pH 6.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液体积比为1 g：60 mL的比例，先将黑芥子酶冻干粉加入到缓冲溶液中，得到黑芥子酶溶液，再按照接枝二胺交联壳聚糖微球的质量：黑芥子酶溶液的体积：丙二醛质量浓度为15%的丙二醛溶液的体积比为1 g：80 mL：8 mL的比例，将接枝二胺交联壳聚糖微球加入黑芥子酶溶液中，浸泡3h，再加入丙二醛溶液，在温度为40℃下进行固定化酶反应4h，反应完成后，进行抽滤，分别收集抽滤渣和抽滤液对于收集的抽滤渣，用2倍于抽滤渣体积的去离子水对抽滤渣进行洗涤，分别收集洗涤渣和洗涤液；对于收集的洗涤渣，即为制备出的固定化黑芥子酶，在4℃的条件下保存备用；其中， 14.5% 1,10-癸二胺。
（4）制备萝卜苷粗提物
以萝卜籽粕为原料，按照萝卜籽粕的质量：体积分数为80%乙醇溶液的体积之比为1 kg： 9 L的比例，先在室温下连续搅拌浸提7h，再用质量分数为6%的柠檬酸溶液调节pH至3，然后再泵入澄清型管式离心机中，在转速为20000r/min的条件下，进行离心，分别收集离心清液和沉渣；对于收集的离心清液，泵入反渗透浓缩器中，在0.25MPa下，进行第一次反渗透浓缩，直到第一次反渗透截留液的体积减少至原体积的15%为止，分别收集第一次反渗透透过液和第一次反渗透截留液；在收集的第一次反渗透截留液中，加入去离子水，补充至原体积，在同等条件下，再进行第二次反渗透浓缩，直到第二次反渗透截留液的体积减少至原体积的10%为止，分别收集第二次反渗透透过液和第二次反渗透截留液；对于收集第二次反渗透截留液，置于-20℃下，预冻4h，然后再放置于冷冻干燥机中，在60Pa、-60℃下，进行冷冻干燥36h，就制备出萝卜苷粗提物，用作下一步处理。
（5）制备反应分离耦合固定化酶反应器
将制备得到的固定化黑芥子酶装入层析柱中，用与固定化黑芥子酶等体积的去离子水进行反冲，就得到固定化黑芥子酶反应柱；将市售已活化的吸附树脂，即SP750树脂，分散于去离子水中，并装配成吸附树脂层析柱，再用与吸附树脂层析柱等体积的去离子水进行反冲，就得到了莱菔素纯化柱；将固定化黑芥子酶反应柱和莱菔素纯化柱进行连接，就组装出反应分离耦合固定化酶反应器，收集备用。
（6）制备低纯度莱菔素
按照萝卜苷粗提物的质量：pH 6.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液的体积为1 g：20 mL的比例，将萝卜苷粗提物分散于缓冲溶液中，得到萝卜苷粗提物溶液，再按照固定化黑芥子酶反应柱：萝卜苷粗提物溶液的体积比为1：8的比例，将萝卜苷溶液以流速为固定化黑芥子酶反应柱体积的6～10倍/小时的速度，泵入固定化黑芥子酶反应柱中，进行连续反应与吸附；反应与吸附完成后，将固定化黑芥子酶反应柱流出端与吸附了莱菔素的莱菔素纯化柱断开；再按照莱菔素纯化柱：体积分数为60%的乙醇溶液的体积比为1：3的比例，乙醇溶液为洗脱液，洗脱液流速为莱菔素纯化柱体积的4倍/小时，将洗脱液泵入吸附了莱菔素的莱菔素纯化柱中，进行莱菔素洗脱分离；对于收集的洗脱液，泵入到真空薄膜蒸发器中，在真空度为0.095MPa、温度为30℃条件下，进行真空薄膜蒸发，得到低纯度莱菔素，纯度达90.5%。
（7）制备高纯度莱菔素
按照低纯度莱菔素的质量：去离子水的体积的比例为1 g：20 mL的比例，将低纯度莱菔素溶于去离子水中，得到低纯度莱菔素溶液；按照低纯度莱菔素溶液：二氯甲烷的体积比为1：2的比例，将低纯度莱菔素溶液与二氯甲烷分别以流速100mL/min泵入离心萃取机中，分别收集水相和油相；油相泵入到真空浓缩器中，在真空度为0.095MPa、温度为30℃条件下，进行真空浓缩，得到高纯度莱菔素；莱菔素纯度达99.0%，总收率达91.2%。