本发明涉及生物技术领域，特别是用于扩增流感病毒h1n1时所用到的用生物反应器扩增流感病毒h1n1的一套优化的工艺方法。
背景技术：
mdck细胞是流感病毒的包装细胞,目前的流感病毒疫苗小规模生产依旧主要以鸡胚培养的方式生产，存在工艺落后，无法进一步优化，劳动力密集，产能不足的情况。因此mdck细胞的生物反应器大规模培养以及流感病毒h1n1大规模扩增技术具有十分重要的市场意义。
要完善流感病毒h1n1扩增工艺，首先必须对mdck细胞生理和生长特性有全面认识，对h1n1感染细胞后的复制机理有深入了解。细胞感染病毒前后会发生多种变化，如细胞干重、蛋白和dna含量、细胞大小都有不同程度的增加，感染的过程需要更多的能量。因此在培养病毒阶段更要注意营养物质的适度补给。一方面及时补充葡萄糖，因为在病毒扩增过程中，一旦葡萄糖耗竭会导致病毒扩增的停止。另一方面，根据氨基酸代谢的变化测定，适当补充最易消耗的几种氨基酸。
关于生物反应器扩增mdck细胞和流感h1n1病毒的工艺优化已有一定研究，目前基本以悬浮培养mdck扩增病毒的工艺为主流，同样也有以微载体cytodex系列为生物反应器载体扩增流感病毒h1n1的研究报导，以上培养系统具有容易放大的优点，但由于悬浮培养剪切力较高，单个细胞病毒产量相对较低。
技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种生物反应器扩增流感病毒h1n1的优化工艺方法，在fibradisk为载体的生物反应器上最大程度优化流感病毒h1n1的生物反应器扩增工艺，从而获得高滴度的流感病毒h1n1，并且稳定可重复，适用于流感病毒h1n1疫苗的生产。
一种生物反应器扩增流感病毒h1n1的优化工艺方法，采用聚纤维纸片载体在生物反应器内扩增犬肾上皮细胞（mdck），然后进行流感病毒复制扩增，具体如下：
在生物反应器内加入生长液，所述的生长液为含10%的胎牛血清的dmem培养基，接种mdck细胞，批次换液培养7天，密度达到6.0×106个/ml以上，培养细胞7天后换液成无血清培养基加0.5%的胰酶，接种流感病毒h1n1，35℃静止吸附病毒3小时，加入5%胎牛血清，继续培养21小时，弃去全部培养液，并用pbs冲洗一遍去除血清，全部换成无血清dmem培养基加0.25%水解乳蛋白和0.25%的胰酶，静止再吸附2小时以利于病毒再感染正常细胞，同时每24小时补充2g/l的葡萄糖；
连续培养扩增病毒，每24小时批次换液，分别收获48、72、96、120小时上清；120小时后，细胞每日葡萄糖消耗低于1g/l，用低渗缓冲液破细胞，反复冲洗三次，收获细胞内病毒。
所述的生物反应器规格为5-10l，所用聚纤维纸片载体为fibradisk，质量为150克。
所述流感病毒h1n1的接种量moi为0.05。
所述的方法，接毒后收获方式采用批式换液收获，同时补充相同体积的维持液，所述的维持液包含dmem、0.25%水解乳蛋白、0.25%的胰酶，收获时间点为48、72、96和120小时。
所述的生物反应器物理参数设定：细胞培养阶段，ph7.2-7.6、温度37℃、溶氧55-80%；接毒后，ph7.3-7.5、温度35℃、溶氧50-70%。
本发明具有以下优点和效果：优化了病毒培养的条件和参数，尽可能达到了最大收获滴度，该方法同时具有很高的重复性和稳定性，在一定规模下生产h1n1产品具有很好性价比和应用前景，可以节约人力物力成本并提高产能。本发明应用的聚纸纤维载体有其他载体无法相比的优点即相同体积下扩增细胞病毒的效率最高，在中小型产业规模下即可满足产能的需求，因此具有非常好的应用前景。同时本发明积极探索了无血清培养的简易替代方式，在实际应用上具有方便操作和经济实用的价值。
附图说明
图1.安普ap20sc反应器细胞葡萄糖消耗和流感h1n1的tcid50曲线；
图2.nbsbioflo310反应器细胞葡萄糖消耗和流感h1n1的tcid50曲线。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，以下用具体实施例来解释说明本发明。应理解，该实施例仅用于说明本发明而不是用于对本发明进行限制，下面实施例中未提及的具体实验方法，按照常规实验方法进行。
本发明涉及生物技术领域，特别是用于扩增流感病毒h1n1时所用到的一套全面优化的工艺方法。该方法用聚纤维纸片（fibradisk）载体利用生物反应器扩增犬肾上皮细胞（mdck）从而建立h1n1复制扩增的全套工艺流程。本发明建立在对流感病毒h1n1复制扩增体系全面适应的条件下，在细胞培养阶段用含10%的血清的dmem培养基，吸附3小时（吸附液：含浓度0.25%水解乳蛋白+0.5%胰酶的dmem培养基），在病毒接种吸附后至24小时在吸附液中添加5%的胎牛血清，在收获病毒阶段采用无血清培养基添加0.25%的水解乳蛋白加0.25%的胰酶，同时每24小时补充2g/l的葡萄糖，采用批式收获换液的方式，该方法在减轻后期纯化难度并适应生物制品的要求的基础上，最大程度优化了工艺并达到较高的病毒滴度。因此本发明所建立的优化工艺是具有良好重复性、高效流感病毒h1n1扩增工艺，可适用于任何以聚纸纤维（fibradisk）为载体的生物反应器扩增流感病毒h1n1，fibradisk培养系统为非悬浮贴壁方式，聚有低剪切力的优势。
生物反应器大规模扩增流感病毒h1n1的一套优化工艺方法，具有如下步骤：1）在生物反应器内加入生长液（高糖dmem+10%胎牛血清），接种mdck细胞，批次换液培养7天，密度达到6.0×106个/ml以上，接种流感病毒h1n1，35℃静止吸附3小时，连续培养扩增病毒，每24小时左右批次换液收获；（2）120小时后，细胞每日葡萄糖消耗低于1g/l，用低渗缓冲液破细胞，反复冲洗三次，收获细胞内病毒。
本发明的技术方案为：应用生物反应器全面优化h1n1大规模扩增工艺，具体步骤如下：
(一)准备材料：
1.微载体：fibradisk纸片载体150克；
2.细胞：本发明所选细胞为可以复制流感病毒h1n1的细胞即犬肾上皮细胞（mdck），购自美国atcc；
病毒：本发明所用病毒株流感h1n1(a/newcaledonia/20/99)；接种moi为0.05；
细胞生长液：含体积浓度10%胎牛血清的dmem培养基（美国gibco公司）；
接种吸附液：含浓度0.25%水解乳蛋白+0.5%的胰酶（美国gibco公司）的dmem培养基（美国gibco公司）；
细胞维持液：含浓度0.25%水解乳蛋白+0.25%的胰酶（美国gibco公司）的dmem培养基（美国gibco公司）；
（二）细胞培养：
1.细胞工厂培养种子细胞和病毒：细胞复苏后，在flask细胞培养瓶子（美国corning公司，）进行传代，每3天按1:4传，直至40瓶150mlflask培养瓶消化共得到6×108个细胞，接种到10层细胞工厂,（美国corning公司），底面积为640cm2，三天后消化得到1.3±0.1×109个细胞左右。从最初构建后在25cm2方瓶培养得到约为105tcid50/ml感染滴度的病毒，每次接种量即感染复数moi为0.05，然后从75cm2扩增至150cm2，最后到细胞工厂（底面积640cm2），得到种子病毒滴度大于7.5log10tcid50/ml，用于反应器的接种。
（三）在生物反应器内加入生长液，接种mdck细胞，批次换液培养6-7天，密度达到6.0×106个/ml以上，换液成无血清dmem培养基，接种流感病毒h1n1，34℃静止吸附3小时，然后加入5%的胎牛血清，继续培养21小时，换液成无血清培养基加0.25%水解乳蛋白，再静止吸附2小时。接毒后收获方式采用批式收获，同时补充相同体积的维持液，收获时间点为49、72、96和120小时，每24小时补充葡萄糖2g/l。生物反应器物理参数设定：（1）细胞培养阶段ph7.2-7.5、温度37℃、溶氧50-80%。（2）接毒后，ph7.3-7.5、温度35℃、溶氧50-70%。
（四）96-120小时后，细胞每日葡萄糖消耗低于1g/l，用低渗缓冲液破细胞，反复冲洗三次，收获细胞内病毒；
本发明与其他生物反应器工艺比较，具有根据原理全面优化的特点，同时积极探索了无血清培养的简易替代方式，在实际应用上具有方便操作和经济实用的价值。本发明通过应用5l工作体积生物反应器和150g/5lfibradisk纸片载体高密度连续培养宿主细胞，可收获20l原液病毒的滴度7.5log10tcid50/ml。
实施例1
生物反应器：中国杭州安普生物工程有限公司10l激流式生物反应器，工作体积为8l，其中细胞灌注袋体积为4l，细胞密度以4l计算，仪器型号：ap20sc；
微载体：fibradisk纸片载体150g（杭州安普生物工程有限公司）；
细胞：mdck，购自美国atcc；
病毒：流感h1n1型，疫苗通用株（a/newcaledonia/20/99）；接种moi=0.05；
细胞生长液：含体积浓度10%血清的dmem培养基（美国gibco公司）；
接种吸附液：含浓度0.25%水解乳蛋白+0.5%的胰酶（美国gibco公司）的dmem培养基（美国gibco公司）；
细胞维持液：含体积浓度0.25%水解乳蛋白+0.25%的胰酶（美国gibco公司）的dmem培养基（美国gibco公司）；
生长液葡萄糖含量测定方法：
葡萄糖测定试剂盒（葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法），上海荣盛生物药业有限公司
将标明r1和r2的试剂等量混合各1ml，加入20ul样品，37℃水浴13min，显色后，在波长505nm处读取吸光值。
葡萄糖（mmol/l）=样本吸光度（a）/校准吸光度（a）×校准液浓度；
葡萄糖(g/l)=mmol/l×18糖耗(g/l)=原培养基葡萄糖含量(g/l)-培养24小时后葡萄糖含量(g/l)。
流感病毒h1n1感染性滴度和ha滴度测定方法
1.常规通用tcid法（reed-muench法），病毒样品以10倍稀释度接种于96孔细胞培养板，96小时候通过显微镜下细胞病变效应（cpe）产生的噬斑计算病毒tcid50感染性滴度。ha滴度测定方法为96孔板鸡红细胞测定法，（who/2002）标准方法。
种子细胞培养：细胞工厂培养种子细胞和病毒：细胞复苏后，在flask细胞培养瓶子（美国corning公司，）进行传代，每3天按1:4传，直至40瓶150mlflask培养瓶消化共得到6×108个细胞，接种到10层细胞工厂,（美国corning公司），底面积为640cm2，三天后消化得到1.3×109个细胞左右。
病毒种子培养：从最初构建后在25平方厘米（cm2）方瓶培养得到约为5.8log10tcid50/ml感染滴度的病毒，每次接种量即感染复数moi为0.05，然后从75平方厘米（cm2）扩增至150cm2，最后到细胞工厂（底面积640cm2），得到种子病毒滴度大于7.2log10tcid50/ml。
生物反应器培养细胞：生物反应器灌注袋内已加入灭菌后的150克fibradisk载体，用ph7.2的磷酸盐缓冲液（pbs）浸泡过夜，弃去后加入细胞生长液8l作为循环总体积（其中灌注袋工作体积4l，为载体和细胞培养固定场所，低剪切力无搅拌，激流袋工作体积4l，为液体搅拌溶氧区），接种mdck细胞至灌注袋，接种量为（1.3±0.1）×109个细胞，进行培养。培养参数设定为：ph7.2-7.6、温度37℃(48-120小时为35℃)、溶氧55-80%、搅拌速度40-60rpm。每天定时取样测定葡萄糖消耗情况，从而估计细胞生长情况，在稳定条件下，葡萄糖消耗与细胞密度线性相关。换液模式采用批式换液，分别在48小时换液4l，96小时换液5l，144小时换液6l，168小时细胞计数在（2.8±0.3）×1010个细胞，密度达到6×106个/ml。具体工艺流程参数见表1。葡萄糖消耗情况见图1。
病毒培养：细胞培养7天后全部换液成吸附液，接种病毒。
病毒收获：168小时换液8l，在接种吸附液条件下吸附病毒3小时，然后加入5%的胎牛血清，继续培养21小时，换液成维持液。接毒后收获方式采用批式收获，同时补充相同体积的维持液，收获时间点为48、72、96和120小时各收获5l。共收获上清15l，用低渗缓冲液破细胞，反复冲洗三次，收获细胞内病毒2l。病毒滴度测定结果见表2和图1。
实施例2
生物反应器：bioflo310细胞反应器（美国nbs公司）；微载体：fibradisk纸片载体150g（美国nbs公司）；
病毒：流感h1n1型，疫苗通用株（a/newcaledonia/20/99）；接种moi=0.05；
细胞生长液：含体积浓度10%血清的dmem培养基（美国gibco公司）；
接种吸附液：含浓度0.25%水解乳蛋白+0.5%的胰酶（美国gibco公司）的dmem培养基（美国gibco公司）；
细胞维持液：含体积浓度0.25%水解乳蛋白+0.25%的胰酶（美国gibco公司）的dmem培养基（美国gibco公司）；
细胞培养：5ｌ反应器内已加入灭菌后的150gfibradisk载体，用ph7.2的磷酸盐缓冲液pbs浸泡过夜，弃去后加入细胞生长液，接种mdck细胞，接种量为（1.3±0.1）×109个细胞，进行培养。培养参数设定为：ph值7.2-7.6、温度37℃、溶氧55-80%、搅拌速度60rpm。每天定时取样测定葡萄糖消耗情况，从而估计细胞生长情况，在稳定条件下，葡萄糖消耗与细胞密度线性相关。换液模式采用批式换液，分别在48小时换液3l,72小时换液4l,96小时换液4l120小时换液4l，144小时细胞计数在（2.6±0.3）×1010个细胞，密度达到4×106个/ml。具体工艺流程参数见表3，葡萄糖消耗情况见图2。
病毒收获：144小时换液5l，在无血清条件下吸附病毒3小时，然后加入5%的胎牛血清，继续培养20小时，换液成无血清培养基加0.25%水解乳蛋白，静止再吸附2小时，继续培养。接毒后收获方式采用批式收获，同时补充相同体积的维持液，收获时间点为48、72、96和120小时收获4l。共收获上清16l，用低渗缓冲液破细胞，反复冲洗三次，收获细胞内病毒2l。病毒滴度测定结果见表4和图2。