本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种具有杀线虫活性的蛋白酶pase4及其应用。
背景技术：
植物线虫病是由植物寄生线虫侵袭和寄生引起的植物病害。受害植物可因侵入线虫吸收体内营养而影响正常的生长发育；线虫代谢过程中的分泌物还会刺激寄主植物的细胞和组织，导致植株畸形，以及利用天敌控制等。使农产品减产和质量下降。其中，香蕉穿孔线虫(radopholussimilis)又名香蕉烂根病，是香蕉、花卉种植业及很多经济作物的最危险的专性寄生线虫，寄主范围非常广泛，已报道的寄主植物有350多种。该线虫除严重危害香蕉、胡椒和椰子外，还危害大豆、玉米、高梁、甘蔗、茄子、咖啡、番茄和马铃薯等经济作物及红掌、竹芋、棕榈等观赏植物。由于该线虫危害严重，因此，有55个国家对其实施官方控制，中国也将该线虫列为禁止入境的一类植物检疫危险性有害生物。
目前防治该线虫主要还是以化学杀线剂为主，而化学药剂的大量使用对环境、人畜、植物和其它有益生物造成极大的危害和其它负面影响，在许多国家和地区已被严格限制使用。生物防治手段具有环保、安全和可持续性等特点，研究和利用有效的生物防治方法防治香蕉穿孔线虫已倍受关注。
另外，微生物分泌的胞外蛋白酶被认为是线虫致病的重要毒力因子，它能降解线虫的体壁，进一步促进病原菌侵染线虫体内组织而致线虫死亡。在过去很长一段时间人们主要通过纯培养方法筛选具有生防功能的微生物及其活性物质。然而能够利用传统纯培养方法获得的微生物种类不到自然环境中的1％，超过99％的微生物尚不可被纯化培养。20世纪90年代建立的宏基因组学技术，既能从可纯培养的微生物中获得功能基因和基因簇，又能从不可纯培养的微生物中筛选出大量新的活性基因和基因簇，从而成为获取新的生防微生物资源的有效工具，许多具有生防活性功能的物质通过该技术得到发掘和利用。
近年来，已有报道从土壤、海底淤泥和热泉等不同环境样品的中筛选得到具有生物催化活性蛋白酶。为了找到完整的蛋白酶基因全序列，还要对克隆的全基因组测序或构建与筛选亚克隆，然而全序列测序成本较高，不适宜用于大量克隆子的筛选，而通过构建质粒亚克隆从环境中筛选目的基因是一种可行的方法。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是为了克服上述现有技术的不足，从香蕉穿孔线虫发生地采集土壤样品并构建香蕉根际土壤微生物宏基因组fosmid文库，通过功能驱动筛选方法筛选含蛋白酶活性的fosmid克隆，然后通过构建和筛选亚克隆的方式，从目标克隆中寻找目标蛋白酶基因，并利用无菌的胡萝卜纯愈伤组织培养繁殖无菌香蕉穿孔线虫对目标蛋白酶基因进行活性测定，得到一种具有杀线虫活性的蛋白酶基因pase4。
本发明的第一个目的是提供一种蛋白酶pase4及其编码基因。
本发明的第二个目的是提供所述蛋白酶或其编码基因在防治植物线虫病害中的应用。
本发明的第三个目的是提供所述蛋白酶或其编码基因在防治香蕉线虫中的应用。
本发明的第四个目的是提供一种杀线虫制剂。
本发明的第五个目的是提供所述基因pase4的扩增引物对。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：
一种具有杀线虫活性的蛋白酶pase4，其氨基酸序列如seqidno：1所示。
一种编码所述蛋白酶pase4的基因pase4，其核苷酸序列如seqidno：2所示。
上述蛋白酶pase4或其编码基因pase4在防治植物线虫病害中的应用，尤其是在防治香蕉穿孔线虫病害方面的应用，均应在本发明的保护范围之内。
一种含有所述蛋白酶pase4的杀线虫制剂，也应在本发明的保护范围之内。
优选地，该杀线虫制剂是指杀香蕉穿孔线虫制剂。
另外，一种扩增上述基因pase4的引物对也再本发明的保护范围之内，该引物对包括上下游引物e1和e2，序列分别如seqidno：3和4所示。
该引物对可特异性地检测蛋白酶pase4基因，有望应用于样本中蛋白酶pase4基因的检测，用于评价样本的杀线或抗线潜力。
本发明从香蕉穿孔线虫发生地采集土壤样品，并构建香蕉根际土壤微生物宏基因组fosmid文库，通过功能驱动筛选方法筛选含蛋白酶活性的fosmid克隆，然后构建亚克隆筛选获得具有杀线虫活性的蛋白酶。本发明所构建的文库，fosmid载体的外源dna插入片段大小为35～45kbp左右，大于或小于该范围片段都不能被插入到载体上，从而降低了fosmid文库的假阳性。利用上述筛选得到杀线虫活性最高的亚克隆子进而扩增得到蛋白酶pase4基因，并诱导表达蛋白酶pase4，利用无菌的胡萝卜愈伤组织培养繁殖无菌香蕉穿孔线虫，测定蛋白酶pase4对线虫的毒性，证明了蛋白酶pase4及其作用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种具有杀线虫活性的蛋白酶pase4及其编码基因。并且试验证明了其杀线活性，含有蛋白酶pase4基因插入片段的亚克隆子处理线虫48h时，线虫死亡率达到65.7％；纯化的蛋白酶pase4溶液浸泡无菌香蕉穿孔线虫36h时，部分线虫开始僵直死亡；当浸泡时间为60h时，线虫体内组织大部分被消解，结构模糊不清，虫体变透明，体内出现许多大小不一的泡状结构。表明蛋白酶pase4具有显著的防治线虫的效果，尤其是针对香蕉穿孔线虫，在香蕉穿孔线虫病害的防治方面具有重要的意义和应用前景。
附图说明
图1为香蕉根际土壤宏基因文库筛选得到的克隆子在sma平板上降解脱脂奶粉的情况(37℃，48h)；pro1～pro6：具有蛋白酶活性的克隆子；l：空白对照epi300菌株(epicenter)；r：空转化载体对照pcc1fos-epi300。
图2为克隆子pro1～pro6的fosmiddna电泳图谱；m：dnamarker；f1～f6：分别为提取pro1～pro6的fosmiddna。
图3为亚克隆子在sma平板上降解脱脂奶粉的情况(37℃，48h)；pro1’、pro4’和pro6’：分别由质粒f1、f4和f6剪切的dna片段所构建的具有蛋白酶活性的亚克隆子；ck：空转化载体对照pjet1.2-e.coli(dh5α)。
图4为亚克隆子插入片段的pcr扩增检测；m：dnamarker；l1、l4和l6：分别为亚克隆子pro1’、pro4’和pro6’插入片段的pcr扩增产物。
图5为转化子p4easy-bl21在sma平板上降解脱脂奶粉的情况；l：转化空载体对照peasy-bl21；r：转化子p4easy-bl21。
图6为蛋白酶pase4对香蕉穿孔线虫的毒性症状(25℃，ph7.0)；a，b：用蛋白酶pase4溶液(25μg/ml)浸泡60h后的香蕉穿孔线虫；c，d：分别为用bsa溶液(25μg/ml)和pbs溶液浸泡60h后的香蕉穿孔线虫。
图7为荧光标记蛋白酶pase4对香蕉穿孔线虫的毒性症状；a：fitc-pase4溶液浸泡12h和60h的香蕉穿孔线虫荧光检测图(λ＝488nm)；b：fitc-bsa溶液浸泡12h和60h的香蕉穿孔线虫荧光检测图(λ＝488nm)。
图8为遗传改造荧光假单胞菌p4mcs-pf36和p4tn5-pf36的筛选及检测。a和b为遗传改造荧光假单胞菌p4mcs-pf36和p4tn5-pf36在sma平板上降解脱脂奶粉情况(37℃，48h)，其中，a为导入重组质粒(pase4-mcs2)转化子p4mcs-pf36，b为空转化载体(pbbr1mcs-2)对照mcs-pf36，c为蛋白酶表达阳性接合子p4tn5-pf36，d为空载体(putmini-tn5)接合子对照tn5-pf36；c为菌株p4mcs-pf36的重组质粒双酶切鉴定，m为dnamarker，1：重组质粒pase4-mcs2，2：pase4-mcs2经ecori、bamhi双酶切；d为菌株p4tn5-pf36的pase4基因southern杂交，1：阳性对照pase4基因的pcr产物，2：kpni酶切消化pf36基因组dna，3：kpni酶切消化p4tn5-pf36基因组dna。
图9为遗传改造荧光假单胞菌p4mcs-pf36和p4tn5-pf36发酵上清液对香蕉穿孔线虫的致死率和毒性；a为不同处理对线虫致死率测定(25℃，浸泡48h)，(n＝5，p＜0.05)；b为香蕉穿孔线虫浸泡于发酵上清液60h后表现的毒性性状(25℃)，其中，1：对照处理pf36，2：p4tn5-pf36处理，3：p4mcs-pf36处理。
图10为不同处理的香蕉植株在接种香蕉穿孔线虫90d后的长势；a：空白对照h2o；b：p4tn5-pf36+香蕉穿孔线虫(rs)；c：pf36+rs，d：h2o+rs，e：mcs-pf36+rs；f：p4mcs-pf36+rs；g：tn5-pf36+rs，h：lb+rs。
具体实施方式
下面结合说明书附图和具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1蛋白酶pase4及其编码基因pase4的获得
1、香蕉根际土壤宏基因组fosmid文库构建和蛋白酶克隆子的筛选
(1)文库构建和蛋白酶阳性克隆子筛选方法
土样采自香蕉穿孔线虫发生蕉园的香蕉根际。土壤总dna提取参照helene等方法(2005)，并用microelutednaclena-upkit(omega)进行纯化。按照epicenter公司copycontroltmfosmidlibraryproductionkit使用说明构建土壤宏基因组fosmid文库，使用含有氯霉素(cm，12.5μg/ml)和脱脂奶粉(2％，w/v)的lb琼脂(sma)平板筛选具有蛋白酶活性的fosmid克隆子。
(2)结果
构建的土壤宏基因组文库包含约35000个克隆，插入片段平均长度约为30kb，覆盖微生物基因组大小约1.05gb；通过sma平板筛选得到6个具有蛋白酶水解活性的克隆子，分别编号为pro1～pro6(图1)。
2、具有蛋白酶活性的亚克隆子的筛选
(1)筛选方法
使用bac/pacdnakit(omega)提取蛋白酶阳性克隆子的fosmiddna，利用超声波(100w，30s/次，3次)随机剪切fosmiddna，胶回收1～5kb之间的dna条带，回收产物与平末端克隆载体pjet1.2(thermo)连接并转化e.coli(dh5α)，涂到含有氨苄青霉素(amp，50μg/ml)的sma平板上筛选具有蛋白酶活性的亚克隆子。通过引物pjet1.2-f/pjet1.2-r(thermo)测定插入片段dna序列，进入merops网络数据库对蛋白酶进行分类和鉴定。
(2)结果
提取pro1～pro6的fosmiddna得到质粒f1～f6(图2)，由f1、f4和f6构建的亚克隆文库中筛选得到具有蛋白酶活性的亚克隆子，分别编号为pro1’、pro4’和pro6’(图3)；另外，由f2、f3和f5所构建的亚克隆文库没有筛选到蛋白酶活性的亚克隆子。
利用载体pjet1.2的通用引物扩增亚克隆子pro1’、pro4’和pro6’的插入片段，分别得到长度为2881bp(l1)、2657bp(l4)和2010bp(l6)的片段(图4)；测序后确定l1、l4和l6各自含有一个完整的orf并编码3种对应的蛋白酶，分别编号为pase1(540aa)、pase4(564aa)和pase6(509aa)。根据merops数据库的分类信息表明，pase1和pase4属于金属蛋白酶m4家族成员。
3、蛋白酶亚克隆发酵上清液杀线虫生物活性测定
(1)检测方法
以华南农业大学植物线研究室培养保存的香蕉穿孔线虫作为靶标，参照huang等(2005)方法进行杀线虫生物活性测定。将筛选得到的蛋白酶亚克隆子接种于含有amp(50μg/ml)的lb培养基中，37℃，200rpm培养48h后，8000×g离心10min，收集蛋白酶亚克隆子发酵上清液。试验设置如下处理：蛋白酶亚克隆子发酵上清液、pjet1.2-e.coli发酵上清液、amp+lb和h2o；将各处理液加入到12孔平底细胞培养板中，每孔添加2ml处理液和200条线虫，25℃条件下于12h、24h、36h和48h时间段统计各处理液中的线虫死亡率(针刺法检查线虫活性)，每处理5重复。
(2)检测结果
对亚克隆发酵上清液的杀线虫生物活性进行了测定，在各检测时间段内pro1’、pro4’和pro6’处理的线虫死亡率都显著(p＜0.05)高于其它处理；其中pro4’处理在各时间段的线虫死亡率均最高，除在浸泡12h和24h时与pro1’处理差异不显著外(p＞0.05)，与其他处理差异均显著(p＜0.05)。这些结果表明，3个亚克隆子分泌的蛋白酶均具有明显的杀线虫活性，其中pro4’分泌的蛋白酶杀线虫活性显著最大。因此选取亚克隆子pro4’作为后续研究的靶标基因。
4、蛋白酶pase4基因的扩增及其表达蛋白酶pase4对香蕉穿孔线虫的毒性
(1)实验方法
1)经杀线虫生物活性测定试验筛选出杀线虫活性最高的亚克隆子pro4’，根据其插入的片段的序列信息，设计引物e1和e2扩增蛋白酶pase4基因，扩增产物经过测序分析，获得蛋白酶pase4基因的开放阅读框序列，如seqidno：2所示，其编码的蛋白酶pase4的氨基酸序列如seqidno：1所示。
e1和e2的引物序列如下：
e1(seqidno：3)：5’-atgaaaaaacatcaggtctc-3’
e2(seqidno：4)：5’-gttgataccaaccgctttgt-3’
2)扩增产物与平末端表达载体peasy(c端6×his标签；transgen)连接得到重组质粒pase4-peasy。经测序检验正确后转化e.colibl21(de3)并涂到含有amp(50μg/ml)的sma平板上筛选得到蛋白酶表达阳性重组子p4easy-bl21。将重组子接种于含有amp的lb培养基中诱导表达蛋白酶pase4，诱导条件为：0.1mmiptg，220rpm，28℃培养16h。最后，在4℃，1200rpm离心条件下收集重组子的发酵上清液，并利用his-bind柱(takara)和10k-mwco浓缩管(thermo)分离纯化目的蛋白(具体操作按使用说明进行)。参照griffitts等(2001)方法，将纯化的目的蛋白用异硫氰酸荧光素(fitc)进行标记，纯化蛋白和标记蛋白同时用于后续的线虫毒性测定。
为了排除其它因素的影响，试验以无菌香蕉穿孔线虫为靶标。线虫毒性测定参照luo等(2013)方法并改良，试验在24孔平底细胞培养板中进行，每孔添加1ml纯化蛋白酶液(25μg/ml，ph7.0)，接入单条无菌香蕉穿孔线虫浸泡于其中，并分别以牛血清白蛋白(bsa，ph7.0)和磷酸盐缓冲液(pbs，ph7.0)作为阴性对照和空白对照。避光条件下放入25℃培养箱中，每隔12h取出观察线虫的形态结构和组织病理变化，每处理10个重复，fitc标记处理通过自动聚焦荧光显微镜(nikon)观察，检测波长为488nm。
(2)结果分析
通过引物e1/e2扩增pase4基因，并连接表达载体peasy得到重组质粒pase4-peasy，pase4-peasy经测序和ndei、xhoi双酶切检验正确后转化e.colibl21得到转化子p4easy-bl21，将其接种到sma平板上出现明显的水解带，而转化空载体对照peasy-bl21并没有出现脱脂奶粉水解现象(图5)，表明蛋白酶pase4基因得到正确表达。
用纯化的蛋白酶pase4溶液(25μg/ml)浸泡无菌香蕉穿孔线虫36h时，部分线虫开始僵直死亡；当浸泡时间为60h时，线虫体内组织大部分被消解，结构模糊不清，虫体变透明，体内出现许多大小不一的泡状结构(图6)，而对照bsa和pbs处理的线虫依然存活，并未发现有组织病理变化。fitc-pase4荧光标记显示，蛋白酶pase4从线虫口针进入食道直至贯穿肠道，随着时间延长向两侧扩散，最后占据整条虫体内部，出现许多大小不一但无荧光标记信号的泡状结构(图7)。
实施例2蛋白酶pase4用于香蕉线虫的防治中的应用
1、蛋白酶pase4基因导入香蕉穿伴生细菌——荧光假单胞菌
（1）转化方法
蛋白酶pase4基因分别通过载体转化和接合转座的方法导入目标菌荧光假单胞菌pf36。目标菌荧光假单胞菌pf36（分类命名为：pseudomonasfluorescenspf36）由发明人筛选得到，已于2017年11月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心；保藏编号为gdmccno：60278；保藏地址为：中国广东省微生物研究所。
1)载体转化法
以实施例1中的pase4-peasy为模板，使用如下引物扩增蛋白酶pase4基因。
上游引物m1：
下横线为ecori酶切位点，波浪线为核糖体结合位点；
下游引物m2：
下横线为bamhi酶切位点，波浪线为6×his标签序列。
扩增产物与广宿主表达载体pbbr1mcs-2连接后得到重组质粒pase4-mcs2，并转化感受态pf36细胞，最后涂到含卡那霉素(kan，30μg/ml)的sma平板上筛选具有蛋白酶活性的转化子p4mcs-pf36。
2)接合转座法
接合转座：参照biomedal公司putmini-tn5kmkit使用说明进行三亲本接合试验。
以实施例1中的pase4-peasy为模板，使用如下引物扩增蛋白酶pase4基因。
上游引物t1：
下横线为noti酶切位点，波浪线为核糖体结合位点
下游引物t2：
下横线为noti酶切位点，波浪线为6×his标签序列
扩增产物与载体putmini-tn5(biomedal)连接得到重组质粒pase4-tn5，重组质粒pase4-tn5在辅助菌e.colidh5α(prk2013，biomedal)协助下转移到受体菌pr36，并通过tn5的转座作用将pase4基因整合到pf36基因组中。最后通过含有kan(30μg/ml)和cm(34μg/ml)的sma平板筛选具有蛋白酶活性的接合子p4tn5-pf36。
(2)结果
利用m1/m2引物扩增蛋白酶pase4基因，连接到载体pbbrlmcs-2得到重组质粒pase4-mcs2，经ecori和bamhi双酶切检验正确后转化感受态pf36细胞得到转化子p4mcs-pf36，将其接种到sma平板上出现明显水解带，而空转化载体对照mcs-pf36并没有出现脱脂奶粉降解现象(图8中a图)。提取p4mcs-pf36的重组质粒作双酶切(ecori和bamhi)，得到一条约5kb载体片段条带和一条约1.7kb目的片段条带(图8中c图)，结果表明构建的重组质粒pase4-mcs2成功转化伴生细菌pr36，并且pase4基因在其中得到正确表达。
利用t1/t2引物扩增蛋白酶pase4基因，连接载体putmini-tn5得到重组质粒pase4-tn5，经noti酶切检验正确后转化e.colidh5α(λpir)得到供体菌p4tn5-dh5α。将供体菌p4tn5-dh5α、辅助菌e.colidh5α(prk2013)和受体菌pf36混合孵育后得到接合子p4tn5-pf36，将其接种到sma平板上出现明显水解带，而空转化接合子tn5-pf36并没有出现脱脂奶粉降解现象(图8中b图)。提取p4tn5-pf36基因组dna，经southern杂交检测确定pase4基因以单拷贝插入到受体菌pf36基因组中(图8中d图)。说明蛋白酶pase4基因成功整合到pf36基因组中并得到正确表达。
2、p4mcs-pf36和p4tn5-pf36发酵上清液杀线虫生物活性测定
(1)方法
将p4mcs-pf36和p4tn5-pf36分别接种于含有kan(34μg/ml)的lb培养基中，37℃，200rpm培养48h后，离心收集发酵上清液。
试验共设置如下处理：p4mcs-pf36发酵上清液、mcs-pf36发酵上清液、p4tn5-pf36发酵上清液、tn5-pf36发酵上清液、pf36发酵上清液、lb+kan和h2o，浸泡48h后统计各处理液中线虫死亡率，每处理5重复。
(2)结果
用p4mcs-pf36和p4tn5-pf36发酵上清液浸泡线虫48h的结果表明(图9中a图)，p4mcs-pf36和p4tn5-pf36处理的线虫死亡率分别为63.9％和42.0％，两者间差异显著(p＜0.05)，并都显著(p＜0.05)地高于其它处理。mcs-pf36、tn5-pf36和pf36处理的线虫死亡率分别为12.7％、10.3％和12.3％，三者无显著(p＞0.05)差异，但都显著(p＜0.05)高于lb+kan和h2o处理。当浸泡时间为60h时，p4mcs-pf36和p4tn5-pf36处理的线虫表现的毒性性状(图9中b图)与用蛋白酶pase4处理的相似，而在pf36对照处理中，线虫没有表现异常的变化。因此推断，pase4基因可以通过改造菌p4mcs-pf36和p4tn5-pf36介导表达，并实现对香蕉穿孔线虫的毒杀作用，且在相同的处理条件下，p4mcs-pf36比p4tn5-pf36的杀线虫活性更强。
3、p4mcs-pf36和p4tn5-pf36对香蕉穿孔线虫防治效果及其对作物安全性测定
(1)方法
供试香蕉穿孔线虫为从巴西蕉根际土壤中分离的种群，供试香蕉品种为大蕉(musaparaolisiac)，种植基质为沙土∶炭土∶有机土＝1∶1∶2(121℃灭菌30min)，盆钵1.8l塑料花盆(装基质土1.5l)。
试验共设置如下处理：p4mcs-pf36+香蕉穿孔线虫(rs)、p4tn5-pf36+rs、mcs-pf36+rs、tn5-pf36+rs、pf36+rs、lb+rs、h2o+rs、p4mcs-pf36、p4tn5-pf36、pf36和h2o。
当香蕉苗长至5～6叶期时，需接菌的处理按菌液浓度为106cfu/g(基质土)注入香蕉苗根际土壤中，接菌3d后再接种香蕉穿孔线虫，接虫量为1000条(混合虫态)/株，接种方法参照wang等(2016)。蕉株被接种线虫后在温室条件(25～32℃)生长90d，统计各处理香蕉苗的株高、鲜重、根重、根内线虫数、基质线虫数及线虫繁殖率等指标，评估遗传改造菌对香蕉穿孔线虫的防治效果及其对香蕉作物的安全性。共进行2次试验，每次试验设置4个重复。
(2)结果
盆栽试验结果表明，p4tn5-pf36+rs处理的香蕉苗根内线虫数(每克)、基质土线虫数和总线虫数都显著(p＜0.05)低于其它处理，而株高、茎&叶鲜重和根重均显著(p＜0.05)大于其它接种rs的处理。
在另外的6个接种rs的处理中，p4mcs-pf36+rs处理的香蕉苗根内线虫数(每克)和总线虫数与其他5个处理差异均不显著(p＞0.05)，该处理的株高与pf36+rs处理株高差异不显著(p＞0.05)，但显著(p＜0.05)高于其他4个处理，该处理的茎&叶鲜重和根重与mcs-pf36+rs、tn5-pf36+rs、pf36+rs处理差异不显著(p＞0.05)，但显著(p＜0.05)大于lb+rs和h2o+rs处理。因此，改造菌p4tn5-pf36对香蕉穿孔线虫的防控效果最好，能显著(p＜0.05)抑制香蕉穿孔线虫的繁殖数量，且植株长势较好(图10)；然而，p4mcs-pf36对香蕉穿孔线虫的防控效果并不明显。
此外，改造菌p4mcs-pf36和p4tn5-pf36对香蕉苗的安全性测定结果显示，p4tn5-pf36处理与pf36、p4mcs-pf36和h2o处理相比，株高显著(p＜0.05)最低，地上部和根部鲜重差异不显著(p＞0.05)，而pf36、p4mcs-pf36和h2o处理之间的株高、茎&叶鲜重和根重均无显著(p＞0.05)差异；经p4mcs-pf36和p4tn5-pf36处理的植株没有表现出明显的受害症状，因此确定改造菌对香蕉作物安全。
序列表
<110>华南农业大学
<120>一种具有杀线虫活性的蛋白酶pase4及其应用
<160>4
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>564
<212>prt
<213>未知(unknown)
<400>1
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