本发明涉及一株菌株及其菌剂的生产方法，具体涉及一株用于发酵青绿饲料的粪肠球菌及其菌剂的生产方法，属于微生物
技术领域：
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背景技术：
：青贮饲料是指：含水率为65％～75％的青绿饲料经切碎后，在密闭缺氧的条件下，通过厌氧乳酸菌的发酵作用，抑制各种杂菌的繁殖，而得到的一种粗饲料。青贮饲料气味酸香、柔软多汁、适口性好、营养丰富、利于长期保存，是家畜优良饲料来源，主要用于喂养反刍动物，比新鲜饲料耐储存，营养成分强于干饲料。技术实现要素：本发明的第一个目的在于提供一株用于发酵青绿饲料、可有效改善青贮饲料的饲用品质、提高青贮饲料的感官评价、调节青贮饲料的pH值、控制氨态氮与总氮的比值、增加乳酸含量的菌株。本发明的第二个目的在于提供含有上述菌株、发酵时间短、活菌数高的菌剂的生产方法。为了实现上述第一个目标，本发明采用如下的技术方案：一株用于发酵青绿饲料的菌株，其特征在于，分类命名为粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14617，保藏日期为2017年09月15日。为了实现上述第二个目标，本发明采用如下的技术方案：含有前述菌株的菌剂的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：Step1：将菌株接种在种子培养基中，36℃～38℃培养24h；Step2：将发酵的种子接入发酵培养基中，控制pH值5.0～9.0，发酵温度30℃～40℃，转速200rpm～300rpm，通气比1:0.3～1:0.8，罐压0.02MPa～0.07MPa，培养24h；Step3：将所得发酵液离心，按菌体：冻干保护剂质量比为1:1～4的比例混合均匀；Step4：将混合后的菌体置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥得到菌粉。前述的生产方法，其特征在于，在Step1中，前述种子培养基为TSA培养基。前述的生产方法，其特征在于，在Step2中，前述发酵培养基为：按质量百分比计，胰蛋白胨1.5％、大豆蛋白胨0.5％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、柠檬酸氢二铵0.2％、葡萄糖2％、氯化钠0.5％，pH自然。前述的生产方法，其特征在于，在Step3中，前述冻干保护剂为：按重量比计，麦芽糊精：脱脂奶粉：葡萄糖＝4～8：1～6：1～3。本发明的有益之处在于：1、本发明提供的保藏编号为CGMCCNo.14617的粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)，可以有效改善青贮饲料的饲用品质，提高青贮饲料的感官评价，调节青贮饲料的pH值，控制氨态氮与总氮的比值，增加乳酸含量。2、本发明提供的菌剂的生产方法，发酵时间短，活菌数高，发酵24h后活菌数可以达到2000亿/克以上，冻干后活菌数可以达到400亿/克以上。具体实施方式以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。一、菌株的分离与筛选我们将采集于诸城的青贮饲料样品，利用稀释分离培养的方法，涂布于TSA培养基上，在37℃厌氧培养罐中培养24h，然后从中挑选出了生长较快、菌落整齐单一的一株。随后我们利用16SrRNA序列同源性分析技术对该株菌进行了分子鉴定，并将得到的序列在NCBI中进行了比对，比对结果显示：我们挑选的菌株与粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的序列相似性为99％。2017年09月15日，我们将该菌株送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行保藏，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCCNo.14617。二、准备培养基1、种子培养基种子培养基为TSA培养基：按质量百分比计，胰蛋白胨1.5％、大豆蛋白胨0.5％、氯化钠0.5％、琼脂1.5％，pH自然。2、发酵培养基发酵培养基为新配方培养基：按质量百分比计，胰蛋白胨1.5％、大豆蛋白胨0.5％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、柠檬酸氢二铵0.2％、葡萄糖2％、氯化钠0.5％，pH自然。我们在TSA培养基的基础上省去了琼脂，添加了牛肉膏、酵母膏、柠檬酸氢二铵和葡萄糖，营养更充分，粪肠球菌生长会更快，产量会更高。三、生产菌剂1、获得种子液将菌株接种在种子培养基中，36℃～38℃培养24h。在本实施例中，培养温度为37℃。2、发酵培养将发酵的种子接入发酵培养基中，控制pH值5.0～9.0，发酵温度30℃～40℃，转速200rpm～300rpm，通气比1:0.3～1:0.8，罐压0.02MPa～0.07MPa，培养24h。在本实施例中，发酵条件为：pH值7.0，发酵温度37℃，转速220rpm，通气比1:0.5，罐压0.05MPa。3、加入冻干保护剂(1)确定冻干保护剂的配方冻干保护剂为：按重量比计，麦芽糊精：脱脂奶粉：葡萄糖＝4～8：1～6：1～3。将所得发酵液离心，按菌体：冻干保护剂质量比为1:1的比例混合均匀，然后将混合后的菌体置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥得到菌粉。对照组：不加冻干保护剂。经检测，各组菌粉对应的活菌数如下：活菌数第1组1060亿/克第2组1082亿/克第3组1100亿/克第4组1073亿/克第5组1042亿/克对照组500亿/克由上表可知，麦芽糊精：脱脂奶粉：葡萄糖在4～8：1～6：1～3这个范围内，均可较好的保护菌体，其中，麦芽糊精：脱脂奶粉：葡萄糖＝6：3：2混合时，保护效果最好。(2)确定冻干保护剂的用量将所得发酵液离心，按菌体：冻干保护剂(麦芽糊精：脱脂奶粉：葡萄糖＝6：3：2)质量比为1:1～4的比例混合均匀，然后将混合后的菌体置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥得到菌粉，经检测，各组菌粉对应的活菌数如下：菌体：冻干保护剂活菌数第1组1:11100亿/克第2组1:2700亿/克第3组1:3560亿/克第4组1:4420亿/克由上表可知，菌体：冻干保护剂在1:1～4这个范围内，均可较好的保护菌体，考虑到冻干保护剂的使用成本，菌体：冻干保护剂＝1:1是最佳的使用方案。(3)将菌体与冻干保护剂混合在本实施例中，将菌体与冻干保护剂按质量比1:1的比例混合均匀，其中，冻干保护剂使用的是麦芽糊精：脱脂奶粉：葡萄糖＝6：3：2混合。4、冷冻干燥将混合后的菌体置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥得到菌粉。四、活菌数测定样品1：发酵液离心后得到菌体，从中采集10g作为样品1。样品2：冷冻干燥后得到菌粉，从中采集10g作为样品2。将样品1和样品2分别进行稀释分离培养，涂布在MRS培养基上，培养24h进行活菌落计数。由上表可知，两样品的活菌数均较高。五、发酵青绿饲料取两吨新鲜的、粉碎的玉米秸秆作为基质，向基质中喷洒1kg上述菌粉，然后放入青绿饲料发酵池中，密封发酵45d。发酵结束后，将饲料搅拌均匀，取100g进行样品鉴定。1、感官评价颜色气味酸味结构黄绿色，有光泽芳香酸味浓湿润、紧密由上表可以看出，本发明提供的保藏编号为CGMCCNo.14617的粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)可以提高青贮饲料的感官评价，使青贮饲料品相、卖相更好。2、饲用品质从奶牛场随机选择10头成年正常产奶，并且体重在500kg、日产奶量在20kg以上的泌乳牛，其中，5头作为实验组饲喂上述发酵饲料，5头作为对照组饲喂原始饲料。每天测定平均日产奶量，连续测定7天，测定结果如下：由上表可以看出，本发明提供的保藏编号为CGMCCNo.14617的粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)可以有效改善青贮饲料的饲用品质，使青贮饲料更有营养，并且更易被吸收。3、pH值、氨态氮与总氮比值、乳酸含量pH值氨态氮与总氮比值乳酸含量4.25.1％1.2％由上表可以看出，本发明提供的保藏编号为CGMCCNo.14617的粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)不仅可以调节(降低)青贮饲料的pH值，使青贮饲料不易被杂菌污染，有效保护了青贮饲料，而且可以控制氨态氮与总氮的比值(更低)，使青贮饲料蛋白质分解较少，有效保护了青贮饲料的营养，同时还可以增加乳酸含量，乳酸含量是评定青贮饲料品质的可靠指标，优质的青贮饲料中含较多的乳酸，可以提高口感和营养吸收。需要说明的是，上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。当前第1页1 2 3