本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及一种兰瑞肽的固相合成方法。
背景技术：
兰瑞肽，英文名称为lanreotide，商品名称为索马杜林，是由法国益普生集团开发的一种长效、缓释的生长抑素八肽类似物，对生长激素、促甲状腺激素、胰岛素以及胰高血糖素素产生抑制作用。兰瑞肽对外周生长抑素受体具有很好的亲和力，其活性强于天然生长抑素，而且作用时间久，是一种长效注射剂药物，每月只需注射两次。早期主要用于对手术或放疗无效的肢端肥大症和生长激素型垂体瘤患者的治疗，随后被fda批准用于无法切除、中高度分化或转移性胃肠胰神经内分泌肿瘤的治疗。
兰瑞肽是由8个氨基酸残基组成、c端酰胺化的多肽，第2位和第7位的半胱氨酸巯基形成1对二硫键，cas号为108736-35-2，分子式为c54h69n11o10s2，分子量为1096.32g/mol，其结构如下：
专利cn104497130a公开了一种采用2+6片段固相合成技术合成兰瑞肽的制备方法。首先采用液相合成方法合成兰瑞肽n端的二肽片段、采用固相合成方法合成兰瑞肽c端6个氨基酸的肽树脂，随后将二肽片段与肽树脂缩合得到兰瑞肽肽树脂，最后将肽树脂裂解得到粗肽，并在液相完成二硫键的氧化。然而该方法操作步骤繁琐，n端二肽片段的液相合成方法反应步骤多、反应时间长；同时在液相中进行二硫键的氧化，需要将粗肽配置成极低的浓度(2～3mg/ml)，需要使用大量溶剂，导致后续分离纯化的难度增加，同时产生大量废液。
技术实现要素：
本发明的目的就是为了克服上述现有技术的不足，依据兰瑞肽自身结构特点，提供一种反应步骤简单、反应时间短、不需要大量溶剂且产物纯化简单的兰瑞肽的固相合成方法。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：
一种兰瑞肽的固相合成方法，包括步骤如下：
1)缩合反应：在缩合体系中，以fmoc氨基树脂为固相合成的载体，树脂经溶胀、脱去fmoc保护基和洗涤后，依次从c端至n端缩合连接8个经活化的、含有侧链保护基的fmoc-氨基酸，得n端氨基含有fmoc保护基的全保护线性肽树脂fmoc-d-2-nal-cys(trt)-tyr(tbu)-d-trp(boc)-lys(boc)-val-cys(trt)-thr(otbu)-氨基树脂；所述依次缩合的保护氨基酸顺序为：fmoc-thr(otbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-val-oh、fmoc-lys(boc)-oh、fmoc-d-trp(boc)-oh、fmoc-tyr(tbu)-oh、fmoc-cys(trt)-oh、fmoc-d-2-nal-oh；
2)对步骤1)制得的全保护线性肽树脂进行环化，得环肽树脂；
3)脱除步骤2)制得的环肽树脂n端d-2-nal氨基上的fmoc保护基，得n端氨基裸露的环肽树脂；
4)脱除步骤3)制得的n端氨基裸露的环肽树脂的侧链保护基，并切割树脂，得兰瑞肽粗肽；
5)对步骤4)制得的兰瑞肽粗肽进行纯化、冻干，得兰瑞肽纯品。
优选的，步骤1)中氨基树脂为：rinkamideam树脂、rinkamide树脂、rinkamidembha树脂或sieber树脂其中任何一种；树脂替代度为0.2～1.4mmol/g。
优选的，步骤1)中，缩合体系为：a+d或a+b+c，其中a为hobt或hoat，b为hatu、hbtu、tbtu或pybop其中任何一种，c为diea或tmp，d为dic。
优选的，步骤2)中，环化方法为：加入i2含量为8eq的1,4-二氧六环溶液，在10～30℃条件下反应1～5h后，分别用四氯化碳和dmf洗涤树脂。
优选的，步骤3)中脱fmoc的方法为：加入体积分数为20％pip-dmf溶液，在10～30℃条件下进行两次脱fmoc保护：第一次脱fmoc保护和第二次脱fmoc保护，再用dmf洗涤树脂ph至7；第一次脱fmoc保护反应时间为5min，第二次脱fmoc保护反应时间为10min。
优选的，步骤4)中，切割树脂的方法为：加入裂解试剂，在10～30℃条件下反应2～5h后，抽滤，将滤液加至10倍体积预冷的乙醚中进行沉淀、离心，再用乙醚将沉淀洗涤，真空干燥，得兰瑞肽粗肽。
优选的，裂解试剂由tfa、tis、edt、苯酚和h2o组成的混合溶剂，其中体积份数比为tfa:tis:edt:苯酚:h2o＝90:2.5:2.5:2.5:2.5。
优选的，步骤5)中，纯化方法为：采用反相高效液相色潽法对兰瑞肽粗肽进行两步纯化：第一步纯化和第二步纯化；第一步纯化：流动相a相为体积分数0.1％tfa-h2o溶液，流动相b相为体积分数0.1％tfa-acn溶液；第二步纯化转盐：流动相a相为体积分数0.1％乙酸-h2o溶液，流动相b相为体积分数0.1％乙酸-acn溶液；所述两步纯化均为梯度洗脱：洗脱时间为60min，洗脱梯度b相为10％～60％，流速为80ml/min，紫外检测波长220nm。
优选的，步骤1)中，缩合反应具体步骤如下：
a)fmoc氨基树脂溶胀：向fmoc氨基树脂中加入dcm，将树脂溶胀0.5h后，再用dmf洗涤树脂两次；
b)fmoc氨基树脂脱fmoc保护：向步骤a)溶胀后的fmoc氨基树脂中，加入体积分数20％pip-dmf溶液在10～30℃条件下进行两次脱fmoc保护：第一次脱fmoc保护和第二次脱fmoc保护，再用dmf洗涤树脂ph至7；第一次脱fmoc保护反应时间为5min，第二次脱fmoc保护反应时间为10min；
c)氨基酸活化：在10～30℃条件下，将保护氨基酸和缩合体系混合后活化5min，得活化氨基酸；
d)缩合反应：将步骤c)制得的活化氨基酸加至步骤b)脱保护的氨基树脂中，在10～30℃条件下进行氨基酸的缩合反应1～5h，得线性全保护肽树脂；
保护氨基酸、缩合体系与fmoc氨基树脂按摩尔质量比为2～5:2～5:1。
本发明的有益效果：
本发明一种兰瑞肽的固相合成方法，采用固相合成方法直接合成全保护线性兰瑞肽肽树脂，简化了生产工艺，反应时间短；同时在固相合成中进行二硫键的氧化，具有效率高、溶剂使用量少和有利于产品纯化，适合工业化生产制备。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以助于理解本发明的内容。本发明中所使用的方法如无特殊规定，均为常规的生产方法；所使用的原料，如无特殊规定，均为常规的市售产品。
本发明中所使用的缩写的具体含义列于下表中：
实施例1
全保护线性兰瑞肽肽树脂的制备：
1)氨基树脂的溶胀：取25g替代度为0.8mmol/g的rinkamideam树脂，加入200mldcm将树脂溶胀0.5h，抽干溶剂，再用dmf洗涤树脂两次，抽干溶剂。
2)fmoc保护基的脱除：向步骤1)溶胀后的fmoc氨基树脂中，加入200ml体积分数20％pip-dmf溶液，在25℃条件下进行两次脱fmoc保护：第一次脱fmoc保护和第二次脱fmoc保护，再用dmf洗涤树脂ph至7，抽干溶剂；第一次脱fmoc保护时间为5min，第二次脱fmoc保护时间10min。
3)氨基酸活化：取60mmolhobt、60mmolfmoc保护氨基酸和60mmoldic用适量的dmf溶解，在25℃条件下反应5min，得活化氨基酸。
4)氨基酸缩合反应：将步骤3)中活化后的氨基酸加至步骤2)脱除fmoc保护基的氨基树脂中，在25℃条件下进行氨基酸的缩合反应2h，茚三酮显色反应监控反应进程，最终得到全保护线性兰瑞肽肽树脂fmoc-d-2-nal-cys(trt)-tyr(tbu)-d-trp(boc)-lys(boc)-val-cys(trt)-thr(otbu)-rinkamideam树脂。
茚三酮显色方法为：取少量树脂至于试管中，dmf洗涤两次，在试管中分别加入体积分数85％苯酚-乙醇溶液、吡啶和质量分数5％茚三酮-乙醇溶液各两滴，于120℃条件下加热反应3min后，用dmf洗涤两次，观察树脂颜色。
实施例2
兰瑞肽环肽树脂的制备：
向实施例1制得的全保护线性兰瑞肽肽树脂中加入i2含量为8eq的1,4-二氧六环溶液，在25℃条件下反应2.5h后，分别用200ml四氯化碳、200mldmf和200mldcm洗涤肽树脂2次，得兰瑞肽环肽树脂。
实施例3
脱除环肽树脂n端氨基的fmoc保护基：
1)向实施例2制得的环肽树脂中加入体积分数20％pip-dmf溶液，在10～30℃条件下进行两次脱fmoc保护：第一次脱fmoc保护和第二次脱fmoc保护，再用dmf洗涤树脂ph至7，抽干溶剂，第一次脱fmoc保护反应时间为5min，第二次脱fmoc保护反应时间为10min。
2)分别用300mldcm和300mlmeoh交替洗涤肽树脂三次，洗涤时间5min/次，将肽树脂收缩，抽干溶剂，真空干燥，得兰瑞肽树脂。经测兰瑞肽肽树脂增重率99％。
实施例4
兰瑞肽环肽树脂的裂解与侧链保护基的脱除：
将实施例3制得的兰瑞肽树脂置于1l圆底烧瓶中，加入10倍体积的裂解试剂，在25℃条件下反应3h后，抽滤，将滤液加至10倍体积预冷的乙醚中进行沉淀、离心，再用乙醚将沉淀洗涤四次；裂解试剂体积份数比为tfa:tis:edt:苯酚:h2o＝90:2.5:2.5:2.5:2.5。
真空干燥，得兰瑞肽粗肽。
经检测兰瑞肽粗肽纯度为90％。
实施例5
兰瑞肽粗品纯化：
采用反相高效液相色潽法对实施例4中制得的兰瑞肽粗肽进行两步纯化：第一步纯化和第二步纯化；第一步纯化：流动相a相为体积分数0.1％tfa-h2o溶液，流动相b相为体积分数0.1％tfa-acn溶液，第二步纯化转盐：流动相a相为体积分数0.1％乙酸-h2o溶液，流动相b相为0.1％乙酸-acn溶液；两步纯化均采用梯度洗脱：c18制备柱(50×250mm，10μm)，洗脱时间为60min，洗脱梯度b相为10％～60％，流速为80ml/min，紫外检测波长220nm。
经浓缩、冻干，得兰瑞肽纯品，经检测兰瑞肽总收率70.3％。
上述实施例中，改变氨基树脂种类为：rinkamide树脂、rinkamidembha树脂、rinkamidebha树脂或sieber树脂其中任何一种；改变氨基树脂替代度为0.2～1.4mmol/g；改变原料的投料比例为：保护氨基酸、缩合体系与fmoc氨基树脂按摩尔质量比为2～5:2～5:1；改变反应溶剂、改变反应温度10～30℃、反应时间；改变缩合体系为：a+d或a+b+c，其中a为hobt或hoat，b为hatu、hbtu、tbtu或pybop其中任何一种，c为diea或tmp，d为dic等，均可实现本发明的兰瑞肽的制备方法。
惟以上所述者，仅为本发明的具体实施例而已，当不能以此限定本发明实施的范围，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110>润辉生物技术（威海）有限公司
<120>一种兰瑞肽的固相合成方法
<160>1
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>8
<212>prt
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(8)
<223>xaa(1)=nal;xaa(2)=d-trp
<400>1
xaacystyrxaalysvalcysthr
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