本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种梅毒重组多价融合抗原、梅毒重组抗原质粒和梅毒重组抗原菌株及其制备方法及试剂盒。
背景技术：
梅毒(syphilis)是由梅毒密螺旋体苍白亚种(treponemapallidumsubsp.pallidum，tp)引起的疾病，能导致心血管及中枢神经系统损害严重后果。tp的基因组全长为1138006bp，膜蛋白是梅毒螺旋体的主要抗原，多种膜蛋白对梅毒具有诊断学意义。
现阶段梅毒确诊方法主要采用梅毒螺旋体明胶凝集试验(treponemapallidumparticleassay，tppa)检测梅毒血清抗体，该检测方法在检测时，需要采用梅毒菌体提取物作为抗原，由于梅毒菌体无法在体外培养，这导致梅毒螺旋体明胶凝集试验的成本很高，每人份的梅毒螺旋体明胶凝集实验试剂成本近80元。另外，梅毒螺旋体明胶凝集试验操作步骤繁杂，同时，需要经验丰富的操作人员通过颗粒凝集情况对判断结果进行判断，在颗粒可凝聚但凝聚现象不明显的情况下，判断结果存在较强的主观性，存在误判的风险。因此，梅毒螺旋体明胶凝集试验在我国各基层医院推广受到限制。
技术实现要素：
为了解决现有技术中梅毒螺旋体明胶凝集试验的成本很高且结果判断主观性强使得判断结果存在误判的风险的问题，本发明实施例提供了一种梅毒重组多价融合抗原、梅毒重组抗原质粒和梅毒重组抗原菌株及其制备方法及试剂盒。所述技术方案如下：
一方面，本发明实施例提供了一种梅毒重组多价融合抗原，所述梅毒重组多价融合抗原的氨基酸序列如序列表中seqidno:1所示。
另一方面，本发明实施例提供了梅毒重组抗原质粒，所述梅毒重组抗原质粒包括如seqidno:2所示的梅毒重组多价融合抗原基因。
又一方面，本发明实施例提供了一种制备上述梅毒重组抗原质粒的方法，所述方法包括：
将序列如序列表中seqidno:2所示的梅毒重组多价融合抗原基因连接到pet-his-28a载体上，得到所述梅毒重组抗原质粒。
再一方面，本发明实施例提供了一种梅毒重组抗原菌株，所述梅毒重组抗原菌株包括序列如seqidno:2所示的梅毒重组多价融合抗原基因。
又一方面，本发明实施例提供了一种制备上述梅毒重组抗原菌株的方法，所述方法包括：
将序列如序列表中seqidno:2所示的梅毒重组多价融合抗原基因连接到pet-his-28a载体上，得到所述梅毒重组抗原质粒；
将所述梅毒重组抗原质粒转入大肠杆菌中，得到所述梅毒重组抗原菌株。
再一方面，本发明实施例提供了一种利用上述梅毒重组抗原菌株制备梅毒重组多价融合抗原的方法，所述方法包括：
将所述梅毒重组抗原菌株进行活化培养；
将活化后的所述梅毒重组抗原菌进行扩大培养后，加入诱导剂进行表达培养；
收集所述梅毒重组抗原菌株并进行超声破碎，通过纯化后得到所述梅毒重组多价融合抗原。
具体地，所述活化培养的培养温度为37℃，所述活化培养的培养时间为14-16h；所述扩大培养的培养温度为37℃，所述扩大培养的培养时间为2.5h，所述表达培养的温度为18℃，所述表达培养的培养时间为14h。
具体地，所述纯化的方法包括：将破碎的所述梅毒重组抗原菌株进行离心，得到上清液，将所述上清液利用镍柱层析柱进行层析，并利用洗脱液进行洗脱，得到含有所述梅毒重组多价融合抗原的洗脱液，将洗脱液进行复性透析，得到纯化的所述梅毒重组多价融合抗原。
又一方面，本发明实施例提供了一种用于检测梅毒的试剂盒，所述试剂盒包括包被液，所述包被液包括序列如序列表中seqidno:1所示的梅毒重组多价融合抗原。
进一步地，所述试剂盒还包括：第一抗体、第二抗体、洗脱液、封闭液、显色液和终止显色剂，其中，所述第一抗体包括梅毒抗体阴性对照血清样本和待测血清样本，所述第二抗体为辣根过氧化酶标记的兔抗人免疫球蛋白抗体。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：该梅毒重组多价融合抗原与其它细菌及螺旋体抗原无相似性，不会产生交叉反应；同时，该梅毒重组多价融合抗原所选取的蛋白具有较高的免疫原性，可被不同时期梅毒患者血清抗体识别；梅毒重组多价融合抗原包括五个外膜蛋白抗原性强且适合表达的10个片段，且部分片段通过柔性接头连接能够保证各抗原决定簇的有效暴露，避免蛋白区域相互覆盖和干扰，同时，该梅毒重组多价融合抗原的分子量大小为50kd左右，为可溶性蛋白，通过纯化后可得到纯蛋白组分，这进一步使得该梅毒重组多价融合抗原可以对所有时期的梅毒患者血清进行有效识别，具有该梅毒重组多价融合抗原的梅毒重组质粒、梅毒重组菌株及试剂盒对不同时期的梅毒均具有很高的准确度；同时，该梅毒重组多价融合抗原能够在体外培养，从而降低了该梅毒重组多价融合抗原的制备成本，每人份检测试剂成本约为3元。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例三提供的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果图，其中，m为marker，1为梅毒重组抗原菌株全蛋白，2为破碎的梅毒重组抗原菌株离心后的上清液，3为纯化后的梅毒重组多价融合抗原；
图2是本发明实施例四提供的于450nm波长处检测吸光值柱形图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例一
本发明实施例提供了一种梅毒重组多价融合抗原，该梅毒重组多价融合抗原包括如下外膜蛋白的成分：tp0453(52-187aa和255-287aa)、tp0435(23-121aa)、tp1038(1-36aa)、tp0868(12-69aa和139-227aa)和tp0965(64-90aa、150-218aa、263-287aa和307-320aa)，对于空间结构要求高的两个外膜蛋白片段之间可利用(gggs)n柔性接头进行连接，从而最大限度地保证外膜蛋白的空间结构(α螺旋结构)不被破坏。同时，可以将该梅毒重组多价融合抗原进行大肠杆菌密码子优化，使其表达氨基酸序列如序列表中seqidno:1所示的梅毒重组多价融合抗原，相应地，编码该梅毒重组多价融合抗原的基因碱基序列如序列表中seqidno:2所示，该序列由上海宇枚博生科科技有限公司合成，该基因使该梅毒重组多价融合抗原更适合在大肠杆菌表达系统中进行高效表达。
实施例二
本发明实施例提供了一种梅毒重组抗原质粒，该梅毒重组抗原质粒包括如seqidno:2所示的梅毒重组多价融合抗原基因。
该梅毒重组抗原质粒的制备方法包括：将序列如序列表中seqidno:2所示的梅毒重组多价融合抗原基因连接到pet-his-28a载体(上海宇枚博生科科技有限公司提供)上，得到梅毒重组抗原质粒。
实施例三
本发明实施例提供了一种梅毒重组抗原菌株，该梅毒重组抗原菌株包括序列如序列表中seqidno:2所示的梅毒重组多价融合抗原基因。
制备该梅毒重组抗原菌株的方法包括：将包括序列如序列表中seqidno:2所示的梅毒重组多价融合抗原基因的梅毒重组抗原质粒转入大肠杆菌中，得到梅毒重组抗原菌株，在本实施例中，大肠杆菌可以为roseta菌(该菌株来自于中国科学院武汉病毒所孙宪迅博士的馈赠)。
将梅毒重组抗原菌株在基本培养基上进行活化培养。具体地，将梅毒重组抗原菌株按0.1％的质量分数接种于基本培养基上，于37℃，250rpm培养14-16h，其中，基本培养基包括：质量分数为1％的蛋白胨、质量分数为0.5％的酵母提取物和质量分数为1％的nacl。
按照体积百分浓度为10％的转种量，将活化后的梅毒重组抗原菌株转种到优化培养基中进行扩大培养，发酵培养的培养温度为37℃，发酵培养的培养时间为2.5h，扩大培养时采用的优化培养基包括：质量分数为2％的蛋白胨、质量分数为0.5％的酵母提取物、质量分数为0.05％的氯化钠、体积摩尔浓度为2.5mm/l的氯化钾和体积摩尔浓度为10mm/l的氯化镁，得到大量的梅毒重组抗原菌株。
按照终浓度为体积摩尔浓度为1mmol/l的加入量加入诱导剂iptg(isopropylβ-d-thiogalactoside，异丙基硫代半乳糖苷)进行表达培养，表达培养的培养温度为18℃，表达培养的培养时间为14h，表达培养可以实现梅毒重组抗原的大量诱导表达，且梅毒重组抗原表达为可溶性蛋白。
收集诱导后的梅毒重组抗原菌株，收集方式可以为离心，并将收集后的梅毒重组抗原菌株进行超声破碎，且每毫升超声波处理液中加入0.3g梅毒重组抗原菌株，其中，超声波处理液包括20mm/lph值为8.0的tris–hcl和500mm/l氯化钠；
将破碎的梅毒重组抗原菌株于8000g的离心力下离心20分钟，得到上清液；
向上清液中加入咪唑(imidazole)，使咪唑(imidazole)的终浓度为5mm/l，进行镍柱亲合层析，上样3～5次，并利用洗脱液进行洗脱。具体地，采用imac-5缓冲液(imac-5缓冲液包括：20mm/lph值为8.0的tris–hcl、500mm/l氯化钠和5mm/l咪唑(imidazole))条件，分别用imac-5,20,40,80,100(imac-20,40,80,100相比于imac-5的不同之处在于：咪唑分别为20,40,80,100mm/l)梯度洗脱液进行洗脱，得到含有梅毒重组多价融合抗原的洗脱液，向上述洗脱液中加入甘油，甘油按照洗脱液体积的5％加入，并于4℃的三乙醇胺缓冲盐水溶液中透析复性24h，期间每8h换一次三乙醇胺缓冲盐水溶液，得到纯化的梅毒重组多价融合抗原，该梅毒重组多价融合抗原的氨基酸序列如序列表中seqidno:1所示。将得到的梅毒重组多价融合抗原利用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测，其检测结果如图1所示，由图1可知，梅毒重组多价融合抗原在诱导后得到较好的表达，且表达形式为可溶性蛋白并存在于经过超声破碎后离心的上清液中，该梅毒重组多价融合抗原的分子量为50kd(千道尔顿)，符合预期分子量，将梅毒重组多价融合抗原经过镍柱亲合层析后，其蛋白纯度可以达到95％。
实施例四
本发明实施例提供了一种用于检测梅毒的试剂盒，该试剂盒包括：含有序列如序列表中seqidno:1所示的梅毒重组多价融合抗原的包被液、第一抗体、第二抗体、洗脱液、封闭液、显色液和终止显色剂。其中，包被液为含有梅毒重组多价融合抗原的碳酸盐缓冲液，第一抗体包括梅毒抗体阴性对照血清样本和待测血清样本，第二抗体为辣根过氧化酶(hrp)标记的兔抗人免疫球蛋白抗体(抗体来源是兔子并针对人的igg蛋白的抗体)。
采用该试剂盒对血清样本进行检测，其中，患者血清包括：一期3例、二期9例、潜伏期3例、晚期3例和阴性18例，共计36例(其中18例样本通过梅毒螺旋体明胶凝集试验测试为梅毒阳性，结果结合临床症状确诊梅毒时期，另外18例为梅毒阴性)。通过tppa确诊梅毒阳性时，血清阳性样本(包括一期、二期、潜伏期和晚期样本)的平均od450值p＝1.2，阴性血清的平均od450值n＝0.26，p/n＝4.62。数据进行方差分析后，得到p＜0.01，由此显示梅毒血清阳性样本和梅毒阴性样本存在非常显著的差异。
下面简单介绍一下采用本发明实施例提供的用于检测梅毒的试剂盒进行检测的方法，具体如下：
抗原包被：将梅毒重组多价融合抗原加入至ph值为9.6的碳酸盐缓冲液中，并配制成浓度为1.25mg/ml的包被液，并分别加入至聚苯乙烯板中，每个孔中加入100μl的包被液，并于4℃下孵育14～18h，倾去包被液，得到包被抗原。
残余抗原洗脱：用洗脱液(洗脱液为三乙醇胺吐温缓冲盐水溶液，具体地，洗脱液包括质量百分比为8％的氯化钠、质量百分比为0.02％的氯化钾、质量百分比为0.3％的tris碱和浓度为0.5％的吐温20)浸泡包被抗原30s，倾去溶液，每次把聚苯乙烯板中水分拍干净。残余抗原洗脱步骤可重复3次，得到包被的抗原。
封闭：每个孔中加入封闭液(封闭液为含有脱脂牛奶的三乙醇胺缓冲盐水溶液，具体地，封闭液包括：质量百分比为5％的脱脂牛奶，质量百分比为8％的氯化钠、质量百分比为0.02％的氯化钾和质量百分比为0.3％的tris碱)300μl，37℃封闭2h，倾去封闭液。
残余脱脂牛奶洗脱：用洗脱液(三乙醇胺吐温缓冲盐水溶液)浸泡30s，倾去洗脱液。残余脱脂牛奶洗脱步骤可重复3次，每次都要把聚苯乙烯板中的水分拍干净。
孵育第一抗体：将梅毒抗体阴性对照血清样本和待测血清样本分别用三乙醇胺吐温缓冲盐水溶液进行稀释，梅毒抗体阴性对照血清样本与三乙醇胺吐温缓冲盐水溶液的比例为1：149，待测血清样本与三乙醇胺吐温缓冲盐水溶液的比例为1：149，并向聚苯乙烯板中的一部分孔内加入100μl稀释后的梅毒抗体阴性对照血清样本，向聚苯乙烯板中的另一部分孔内加入100μl稀释后的待测血清样本，并分别于37℃的温箱孵育1h，倾去三乙醇胺吐温缓冲盐水溶液，得到结合了抗原的第一抗体。
残留第一抗体洗脱：用三乙醇胺吐温缓冲盐水溶液浸泡残余第一抗体1分钟，倾去三乙醇胺吐温缓冲盐水溶液。残留第一抗体洗脱步骤可重复5次，每次都把聚苯乙烯板中的水分拍干净。
孵育第二抗体：将辣根过氧化酶(hrp)标记的兔抗人作为第二抗体igg(购买于武汉博士德生物科技有限公司)，按照第二抗体与三乙醇胺吐温缓冲盐水溶液为1：5000的比例将第二抗体进行稀释，将稀释后的第二抗体向聚苯乙烯板中的每个孔内加入100μl，并于37℃的温箱孵育45分钟，倾去三乙醇胺吐温缓冲盐水溶液，得到了与第一抗体结合的第二抗体。
残留第二抗体洗脱：用三乙醇胺吐温缓冲盐水溶液浸泡残余第二抗体1分钟，倾去三乙醇胺吐温缓冲盐水溶液，残留第二抗体洗脱步骤可重复5次，每次都把聚苯乙烯板中水分拍干净。
显色反应：向聚苯乙烯板的每个孔中加入tmb(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，北京索莱宝生物科技有限公司)显色液50μl，在避光条件下，于37℃显色20分钟后，向每个孔中加入50μl0.5n的硫酸(终止显色剂)用于终止显色反应。
采用酶标仪于450nm波长处检测吸光值，并根据样本吸光值(通过待测血清样本制备的第一抗体)/阴性样本吸光值(通过梅毒抗体阴性对照血清样本制备的第一抗体)>2.1，则为梅毒阳性样本，样本吸光值/阴性样本吸光值<2.1，则为梅毒阴性样本(在本实施例中，阴性对照样本采用甲苯胺红不加热血清试验(tolulizedredunheatedserumtest，trust)和tppa检测结果均为阴性的梅毒阴性血清，其吸光值为0.25)，经过计算可知，本实施例提供的36例样本中，有18例样本的样本吸光值/阴性样本吸光值均大于2.1(一期的三例梅毒阳性样本吸光值分别是：1.13、1.25和1.03；一期的三例梅毒阳性样本的样本吸光值/阴性样本吸光值分别为4.25、5和4.12；二期的九例梅毒阳性样本吸光值分别是：1.37、1.45、1.67、1.61、1.30、1.67、1.53，1.21和1.37；二期的九例梅毒阳性样本的样本吸光值/阴性样本吸光值分别为5.48、5.80、6.68、6.44、5.20、6.68、6.12，4.48和5.48；潜伏期的三例梅毒阳性样本吸光值分别是：0.92、0.93和0.87；潜伏期的三例梅毒阳性样本的样本吸光值/阴性样本吸光值分别为3.48、3.72和3.48；三例晚期梅毒阳性样本吸光值分别是：1.23、1.03和1.12；三例晚期梅毒阳性样本的样本吸光值/阴性样本吸光值分别为4.92、4.12和4.48)，则该18例样本为梅毒阳性样本(其结果与ttpa结合临床判断的结果一致)；另外18例阴性样本的样本吸光值/阴性样本吸光值均小于2.1，具体吸光值为：0.30、0.21、0.37、0.22、0.30、0.16、0.29、0.30、0.36、0.22、0.17、0.16、0.27、0.30、0.33、0.38、0.20和0.19；18例阴性样本的样本吸光值/阴性样本吸光值分别为1.2、0.8、1.5、0.9、1.2、0.6、1.1、1.2、1.4、0.9、0.7、0.6、1.1、1.2、1.3、1.5、0.8和0.8。则该18例阴性样本均与ttpa结合临床判断的结果一致，具体地，在450nm波长处检测的阳性样本与阴性样本的吸光值柱形图如图2所示，由图2可知，图中p梅毒患者阳性血清样本检测结果，其中18例梅毒阳性样本的od平均值为1.2，图中n为梅毒患者阴性血清样本检测结果，18例梅毒阴性样本的od平均值为0.26。由该结果可知p与n的显著性差异性分析p<0.01，这表明p与n两组数值具有极显著性差异，由此可见，本申请提供的用于检测梅毒的试剂盒具有较高的准确性。
本发明实施例提供的梅毒重组多价融合抗原与其它细菌及螺旋体抗原无相似性，且不会产生交叉反应；同时，该梅毒重组多价融合抗原所选取的蛋白具有较高的免疫原性，可被不同时期梅毒患者血清抗体识别；梅毒重组多价融合抗原包括10个抗原性强且适合表达的片段，且部分片段通过柔性接头连接能够保证各抗原决定簇的有效暴露，避免蛋白区域相互覆盖和干扰，同时，该梅毒重组多价融合抗原的分子量大小为50kd左右，即为可溶性蛋白，通过纯化后可得到纯蛋白组分，这进一步使得该梅毒重组多价融合抗原可以对所有时期的梅毒患者血清进行有效识别，具有该梅毒重组多价融合抗原的梅毒重组质粒、梅毒重组菌株及试剂盒对不同时期的梅毒均具有很高的准确度，同时，该梅毒重组多价融合抗原能够在体外培养，从而降低了该梅毒重组多价融合抗原的制备成本，每人份检测试剂成本约为3元。此外，该试剂盒通过显色反应后测定样本吸光值，根据样本吸光值/阴性样本吸光值计算结果，根据计算后的结果判断样本的属性，这使得采用本实施例提供的试剂盒可以简单且直观的判断结果，避免了操作人员的主观性对结果的影响。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>江汉大学
<120>梅毒重组多价融合抗原、梅毒重组抗原质粒和梅毒重组抗原菌株及其制备方法及试剂盒
<160>2
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>502
<212>prt
<213>苍白密螺旋体(treponemapallidum)
<400>1
alaglyalaglyalaleuileseralaileileglyalahisglyser
151015
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202530
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<211>1506
<212>dna
<213>苍白密螺旋体(treponemapallidum)
<400>2
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