一种淡紫拟青霉固体培养基制备及发酵生产方法与流程

本发明涉及微生物技术及生物利用领域，具体涉及一种淡紫拟青霉固体培养基制备及发酵生产方法。

背景技术：

根结线虫已给农作物的生产带来严重的危害。近几年来报道的有效防治根结线虫的真菌很多其中最引人注意的一种是淡紫拟青霉。据文献报道淡紫拟青霉对根结线虫有着明显的抑制效果。针对淡紫拟青霉的大规模发酵生产及培养基制备成为了一个研究热点之一。

专利201610790557公开了一种淡紫拟青霉发酵生产方法及淡紫拟青霉二级液体培养基的方法，液体培养基采取黄豆粉为主要原料；专利201010209110公开了一种淡紫拟青霉的培养方法，选取麸皮、玉米、甘蔗渣为主要原料；专利201210074067公开了一种淡紫拟青霉及其培养方法和应用，培养基选取米糠、玉米粉为主要原料；专利201611258790公开了淡紫拟青霉及其规模化制备方法，培养基选取玉米秸秆为主要原料。本文提供一种使用廉价原料，分别对淡紫拟青霉固体和液体进行发酵的培养基组成、发酵工艺要点进行研究。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种淡紫拟青霉固体培养基制备及发酵生产方法，制备廉价有效的淡紫拟青霉固体培养基，解决了淡紫拟青霉固体发酵的关键操作，扩大了菌体产量，提高了菌体抗病能力。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案实现：

一种淡紫拟青霉固体培养基制备，具体包括以下步骤：

1.淡紫拟青霉一级菌种制备

1)培养基原料：玉米粉5～10g，玉米浆10～15g，脲0.1～0.5g，葡萄糖2～5g，硫酸铵1～2.5g，磷酸氢二铵1～2.5g，酵母粉1～2.5g，水200～500g；

2)配制培养基：取15g～20g玉米粉熬成浆，再将其他原料加入，搅拌，加水，装入1个1000ml的三角瓶；

3)灭菌：把装有培养基的三角瓶放入灭菌锅中，120～125℃，灭菌25～35min；

4)接菌：在无菌室内，把活化后的淡紫拟青霉接种到已灭菌的三角瓶中，放入25～30℃培养箱中培养；

2.淡紫拟青霉二级菌种制备

1)培养基原料：玉米粉10g～20g，玉米浆20～30g，脲0.5～1g，酵母粉2～5g，葡萄糖10～20g，水800g～1000g；

2)配制培养基：取30～50g玉米粉熬成浆，再将其他原料加入，搅拌，加水补至1000ml，装入2个1000ml的三角瓶；

3)灭菌：把装有培养基的三角瓶放入灭菌锅中，120～125℃灭菌25～35min；

4)接菌：在无菌室内，把一级菌种接种到已灭菌的三角瓶中，放入25～30℃培养箱中；

淡紫拟青霉固体发酵方法，具体包括以下步骤：

1.淡紫拟青霉固体发酵培养基制备

将淡紫拟青霉固体发酵培养基陈大米200g～300g倒入盆中，向其注入清水，使大米完全没在清水中,浸泡4～8h，使大米完全吸饱水，同时加入蔗糖0.5～1g，控制蒸汽压力0.12～0.15mpa，温度120～125℃，蒸煮30～35min，降温到25～30℃得淡紫拟青霉固体发酵培养基；

2.淡紫拟青霉固体发酵培养基接种

在无菌室内，用无菌量杯接取淡紫拟青霉二级菌种液体，均匀地淋在固体发酵培养基上，混拌，使淡紫拟青霉菌种液体与固体发酵培养基充分混合均匀，放入25～30℃培养箱中里进行发酵培养7～9天，得淡紫拟青霉菌体。

淡紫拟青霉菌体孢子数可达8×10⁹cfu/g，纯种率达90％-95％。

与现有的技术相比，本发明的有益效果是：

1.废弃的陈大米作为发酵培养基原料，适合淡紫拟青霉大量生长繁殖，获得的菌体纯种率高，纯种率达90％-95％，菌体生长能力旺盛，扩大了菌体产量，提高了菌体抗病能力。

2.本发明通过调整培养基组成、控制发酵生产各参数及操作要点，对发酵生产各单元操作的细分，严格控制反应条件，寻求发酵生产最优化。

3.培养基成本低廉，生产可靠，适合于大规模发酵生产。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明：

以下实施例对本发明进行详细描述。这些实施例仅是对本发明的最佳实施方案进行描述，并不对本发明的范围进行限制。

实施例1

一种淡紫拟青霉固体培养基制备，具体包括以下步骤：

1.淡紫拟青霉一级菌种制备

1)培养基原料：玉米粉10g，玉米浆12g，脲0.4g，葡萄糖3g，硫酸铵2g，磷酸氢二铵2g，酵母粉2.5g，水500g；

2)配制培养基：取18g玉米粉熬成浆，再将其他原料加入，搅拌，加水，装入1个1000ml的三角瓶；

3)灭菌：把装有培养基的三角瓶放入灭菌锅中，121℃，灭菌30min；

4)接菌：在无菌室内，把活化后的淡紫拟青霉接种到已灭菌的三角瓶中，放入28℃培养箱中培养；

2.淡紫拟青霉二级菌种制备

1)培养基原料：玉米粉15g，玉米浆25g，脲0.6g，酵母粉3g，葡萄糖18g，水900g；

2)配制培养基：取40g玉米粉熬成浆，再将其他原料加入，搅拌，加水补至1000ml，装入2个1000ml的三角瓶；

3)灭菌：把装有培养基的三角瓶放入灭菌锅中，123℃灭菌25min；

4)接菌：在无菌室内，把一级菌种接种到已灭菌的三角瓶中，放入28℃培养箱中；

淡紫拟青霉固体发酵方法

1.淡紫拟青霉固体发酵培养基制备

将淡紫拟青霉固体发酵培养基陈大米300g倒入盆中，向其注入清水，使大米完全没在清水中,浸泡6h，使大米完全吸饱水，同时加入蔗糖1g，控制蒸汽压力0.13mpa，温度121℃，蒸煮35min，降温到30℃淡紫拟青霉固体发酵培养基；

2.淡紫拟青霉固体发酵培养基接种

在无菌室内，用无菌量杯接取淡紫拟青霉二级菌种液体，均匀地淋在固体发酵培养基上，混拌，使淡紫拟青霉菌种液体与固体发酵培养基充分混合均匀，放入28℃培养箱中里进行发酵培养7～9天，得淡紫拟青霉菌体。。

实施例2

一种淡紫拟青霉固体培养基制备，具体包括以下步骤：

1.淡紫拟青霉一级菌种制备

1)培养基原料：玉米粉6g，玉米浆10g，脲0.3g，葡萄糖3g，硫酸铵1.5g，磷酸氢二铵2g，酵母粉2g，水400g；

2)配制培养基：取18g玉米粉熬成浆，再将其他原料加入，搅拌，加水，装入1个1000ml的三角瓶；

3)灭菌：把装有培养基的三角瓶放入灭菌锅中，122℃，灭菌25min；

4)接菌：在无菌室内，把活化后的淡紫拟青霉接种到已灭菌的三角瓶中，放入28℃培养箱中培养；

2.淡紫拟青霉二级菌种制备

1)培养基原料：玉米粉10g，玉米浆20g，脲1g，酵母粉4g，葡萄糖15g，水800g；

2)配制培养基：取40g玉米粉熬成浆，再将其他原料加入，搅拌，加水补至1000ml，装入2个1000ml的三角瓶；

3)灭菌：把装有培养基的三角瓶放入灭菌锅中，120℃灭菌35min；

4)接菌：在无菌室内，把一级菌种接种到已灭菌的三角瓶中，放入28℃培养箱中；

淡紫拟青霉固体发酵方法

1.淡紫拟青霉固体发酵培养基制备

将淡紫拟青霉固体发酵培养基陈大米200g倒入盆中，向其注入清水，使大米完全没在清水中,浸泡8h，使大米完全吸饱水，同时加入蔗糖0.8g，控制蒸汽压力0.13mpa，温度125℃，蒸煮30min，降温到25℃得淡紫拟青霉固体发酵培养基；

2.淡紫拟青霉固体发酵培养基接种

在无菌室内，用无菌量杯接取淡紫拟青霉二级菌种液体，均匀地淋在固体发酵培养基上，混拌，使淡紫拟青霉菌种液体与固体发酵培养基充分混合均匀，放入30℃培养箱中里进行发酵培养7～9天，得淡紫拟青霉菌体。

实施例3

一种淡紫拟青霉固体培养基制备，具体包括以下步骤：

1.淡紫拟青霉一级菌种制备

1)培养基原料：玉米粉8g，玉米浆10g，脲0.5g，葡萄糖3g，硫酸铵2g，磷酸氢二铵2.5g，酵母粉2.5g，水300g；

2)配制培养基：取20g玉米粉熬成浆，再将其他原料加入，搅拌，加水，装入1个1000ml的三角瓶；

3)灭菌：把装有培养基的三角瓶放入灭菌锅中，123℃，灭菌35min；

4)接菌：在无菌室内，把活化后的淡紫拟青霉接种到已灭菌的三角瓶中，放入28℃培养箱中培养；

2.淡紫拟青霉二级菌种制备

1)培养基原料：玉米粉15g，玉米浆25g，脲0.8g，酵母粉5g，葡萄糖10g，水800g；

2)配制培养基：取30～50g玉米粉熬成浆，再将其他原料加入，搅拌，加水补至1000ml，装入2个1000ml的三角瓶；

3)灭菌：把装有培养基的三角瓶放入灭菌锅中，120℃灭菌35min；

4)接菌：在无菌室内，把一级菌种接种到已灭菌的三角瓶中，放入28℃培养箱中；

淡紫拟青霉固体发酵方法

1.淡紫拟青霉固体发酵培养基制备

将淡紫拟青霉固体发酵培养基陈大米300g倒入盆中，向其注入清水，使大米完全没在清水中,浸泡6h，使大米完全吸饱水，同时加入蔗糖1g，控制蒸汽压力0.15mpa，温度125℃，蒸煮30min，降温到28℃得淡紫拟青霉固体发酵培养基；

2.淡紫拟青霉固体发酵培养基接种

在无菌室内，用无菌量杯接取淡紫拟青霉二级菌种液体，均匀地淋在固体发酵培养基上，混拌，使淡紫拟青霉菌种液体与固体发酵培养基充分混合均匀，放入28℃培养箱中里进行发酵培养7～9天，得淡紫拟青霉菌体。

实施1～3淡紫拟青霉固体发酵菌落生长状态见表1；

表1：淡紫拟青霉固体发酵菌落生长状态

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