响应面法优化的马齿苋多糖酶法提取工艺的制作方法

本发明涉及一种植物多糖提取工艺，特别涉及一种响应面法优化的马齿苋多糖酶法提取工艺，属于食品科学与工程技术领域。

背景技术：

马齿苋(PortulacaoleraceaL.)为马齿苋科1年生肉质草本植物，在我国分布广泛,资源丰富,是常见的中草药和野生蔬菜，为我国卫生部划定的药食同源的野生植物之一。马齿苋中的生物活性物质主要是黄酮类和多糖类,其中马齿苋多糖具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗氧化等作用。因此，有效提取马齿苋多糖对开发利用马齿苋资源具有重要意义。

酶法提取马齿苋多糖的工艺已有一些报道，酶法提取具有快速、高效、反应温度温和、易于控制等诸多优点，目前已广泛应用在植物多糖的提取上，但用新鲜马齿苋酶解提取多糖的研究还少见报道。因此研究用果胶酶提取新鲜马齿苋多糖的工艺条件，旨在为开发马齿苋多糖提供技术支撑。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种响应面法优化的马齿苋多糖酶法提取工艺，该工艺通过对果胶酶提取马齿苋鲜榨汁中的多糖工艺进行响应面法的优化，建立了酶解法提取多糖的回归模型，从而确定最佳的马齿苋多糖酶方法，该方法具有多糖得率高的优点。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种响应面法优化的马齿苋多糖酶法提取工艺，该工艺包括如下步骤：

(1)原料预处理：选择无腐烂、无病虫、无损伤的新鲜马齿苋，用水清洗干净，沥干水分备用；

(2)杀青：蒸汽杀青5-6min；

(3)压榨：用螺旋榨汁机压榨，得到榨浆；

(4)酶解：将榨浆搅拌均匀，加入超纯水按固定的浆液比在不同温度、酶解时间、果胶酶的添加量下进行酶解浸提，通过单因素试验以及响应面法确定最佳配比；

①在单因素实验的基础上，由Design-Expert 8.0.6统计分析软件中的Box-Benhken试验设计，以马齿苋多糖提取率(Y2)为响应值，以加酶量(A)、酶解时间(B)、酶解温度(C)为自变量，建立三因素三水平的中心组合设计，利用实验设计软件进行非线性回归的二次多项式模型拟合，预测的模型如下：

Y2＝0.87+0.038A-0.033B+0.012C-0.075AB+0.001AC-0.094BC+0.16A²+0.15B²-0.12C²

②根据回归方程得到响应面分析图，考察拟合之后的响应曲面形状，分析所选定的三个变量对考察的响应值的影响；通过对响应面等值线的分析寻求最优工艺参数，并且通过对3D曲面图的分析，直观地评价各因素间的交互作用，最后得到最优工艺参数。

响应面法是一种在科学领域被广泛应用的数学统计方法，通过对实验数据的数学规划分析，拟合出数据的普遍规律，得到最优数值结果。试验表明，经过响应回归方程拟合出的理论值与实际值相吻合，证明本发明建立的二次多项回归方程模型能准确预测各因素与效应面之间的关系。

作为优选，所述步骤(4)酶解具体过程为：将榨浆搅拌均匀，加入超纯水使浆水比为1:18-22，在酶解温度30-50℃、pH 5-6的条件下加入果胶酶进行酶解浸提，酶解时间1-2h，果胶酶用量为0.2-0.3g/kg，得到酶解液。

作为优选，该工艺还包括步骤(5)过滤：用四层纱布过滤酶解液，将滤液加热至90℃5-6min使酶失活，冷却后装瓶密封保存。

作为优选，步骤(4)酶解中，浆水比为1:20，果胶酶用量0.246g/kg、酶解温度44.2℃、pH 5.4、酶解时间1.5h。

作为优选，所述的统计分析软件为Design-Expert 8.0.6。

本发明的有益效果是：本发明在单因素实验基础上，采用Box-Behnken响应面实验设计，根据Design-Expert 8.0.6软件进行分析，对果胶酶提取马齿苋鲜榨汁中的多糖工艺进行优化，建立了酶解法提取多糖的回归模型，得到的酶法提取马齿苋多糖，提取工艺简洁，提取条件温和，是一种合适的提取马齿苋多糖的方法。

附图说明

图1是酶用量对多糖得率及DPPH清除率的变化曲线；

图2是酶解时间对马齿苋多糖得率及DPPH清除率的变化曲线；

图3是酶解温度对马齿苋多糖得率及DPPH清除率的变化曲线；

图4加酶量与酶解时间交互作用对DPPH清除率的响应面；

图5是加酶量与酶解温度交互作用对DPPH清除率的响应面；

图6是酶解温度与酶解时间交互作用对DPPH清除率的响应面；

图7是加酶量与酶解时间交互作用对多糖提取率的响应面；

图8是加酶量与酶解温度交互作用对多糖提取率的响应面；

图9是酶解温度与酶解时间交互作用对多糖提取率的响应面。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

材料与试剂

DPPH即1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(东京化成工业株式会社)，

无水酒精、葡萄糖、浓硫酸、苯酚均为分析纯(上海联试化工试剂有限公司)，

果胶酶(酶活力≥50.0u/g，国药集团化学试剂有限公司)。

实施例1：

1、马齿苋酶解液的制备方法

新鲜马齿苋→挑选→清洗→杀青→压榨→酶解→过滤→酶解液，

具体过程为：

(1)原料预处理：选择无腐烂、无病虫、无损伤的新鲜马齿苋，并用自来水清洗干净，用纯净水过一遍，沥干水分备用。

(2)杀青：蒸汽杀青5min。

(3)压榨：用螺旋榨汁机压榨，防止或减轻在压榨过程中空气混入而氧化原料。

(4)酶解：将榨浆搅拌均匀，用超纯水按一定的浆液比在不同温度、酶解时间、果胶酶的添加量下进行酶解浸提，通过单因素试验以及响应面法确定最佳配比。

(5)过滤：用四层纱布过滤酶解液，将滤液加热至90℃5min使酶失活，冷却后装入试剂瓶，密封，-4℃保存备用。

2、马齿苋酶解液对DPPH自由基清除率的测定

准确称取51.6mg DPPH·，用70％乙醇溶解后定容于200mL容量瓶，作为储备液(6.5×10^-4mol·L^-1)储藏在棕色瓶于-4℃的冰箱中保存，用时取出。利用DPPH·溶液的紫红色，在加入抗氧化剂后颜色变淡来表示其对自由基的清除能力。取0.50mL马齿苋酶解液加入10.00mL DPPH·乙醇溶液，摇匀，30℃避光反应15min后，在522nm波长处测定其吸光度(以70％乙醇为空白调零)，试验加样方法见表1，重复测定3次，取平均值。根据下列公式计算榨汁对DPPH·自由基的清除率：

DPPH·清除率(％)＝[1－(Ai－Aj)/A0]×100％

表1试验加样方法

3、马齿苋酶解液中多糖含量的测定

标准曲线的制作精密称取105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品0.2g,用超纯水溶解，定容于100mL容量瓶中，吸取此溶液5.00mL稀释到100.00mL,得到浓度为0.1mg/mL的葡萄糖标准溶液。吸取标准溶液0.00(空白)、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70mL分别置于比色管中,加超纯水至2.00mL,再加入体积分数6％的苯酚溶液1.00mL,摇匀,迅速加入浓硫酸5.00mL，振摇5min，置沸水浴中加热15min，再置冷水中冷却至室温，于490nm波长处测定吸光度(A)。绘制标准曲线，求回归方程和相关系数。

马齿苋酶解液中多糖含量的测定取马齿苋酶解液并稀释到一定浓度,按标准曲线项下方法操作,测定吸光度,代入回归方程求出榨汁中多糖的浓度。

马齿苋酶解液中多糖的浓度(mg/mL)＝n C，C为吸光度对应的葡萄糖标准曲线上质量浓度(mg/mL)；n为稀释倍数。

根据上述方法进行单因素试验

①果胶酶加入量对马齿苋多糖得率及对DPPH的清除率的影响

以超纯水为溶剂提取马齿苋鲜榨浆中的多糖，固定浆液比为1∶20(g/mL)，酶解温度为30℃，提取时间为90min，提取次数为1，考察加酶量对马齿苋多糖提取率及对DPPH清除率的影响，结果见图1。

由图1可见，在果胶酶的用量小于0.2g/kg时，随着酶用量的增大，多糖得率增加；但当酶用量超过0.2g/kg时，增加酶用量，多糖得率反而下降，这和邹雪等^[5]的研究相吻合。邹雪等研究了不同浓度果胶酶对蓝莓半甜红酒风味成分的影响，结果表明，添加果胶酶处理后蓝莓半甜红酒的总酸、甲醇、杂醇油比未添加果胶酶时均有所提升，其原因可能使多糖转化为酸和醇。对DPPH的清除率呈波浪状，其原因有待今后进一步研究。综合果胶酶对两者的影响，果胶酶的最佳用量为0.2g/kg。

②酶解时间对马齿苋多糖得率及对DPPH的清除率的影响

浆液比为1∶20(g/mL)，提取温度为30℃，加酶量为0.2g/kg，提取次数为1次,考察提取时间对马齿苋多糖提取率及对DPPH的清除率的影响，结果见图2。

由图2可知，提取时间低于90min时，马齿苋多糖提取率随酶解时间而增加，超过90min之后随时间的增加而下降。表明，提取时间对多糖提取率有着比较明显的影响，时间过短，多糖提取不充分,时间过长,可能引起多糖的分解，进而导致多糖提取率的下降。对DPPH的清除率在180min时达到最高，这可能与其他抗氧化成分(如黄酮)的提取有关，从效率及两者综合考虑选择酶解时间为90min。

③酶解温度对马齿苋多糖得率及对DPPH的清除率的影响

固定浆液比为1∶20(g/mL)，加酶量为0.2g/kg，提取时间为90min,提取次数为1次，考察提取温度对马齿苋多糖提取率及对DPPH的清除率的影响，结果见图3。

由图3可知，酶解温度对马齿苋多糖提取率有着较为显著的影响，在30℃～60℃时随着提取温度的升高马齿苋多糖提取率不断减少，这和温度对酶的活性影响有关，70℃时多糖提取率升高，这时酶已经失活，是温度的升高使多糖的提取率增加。对DPPH的清除率出现2个高点，70℃达到最高(是由温度的升高引起的活性成分的提取率增加)，40℃为次高点。因此选择酶解温度为40℃。

根据单因素实验确定因素和水平见表2。

表2响应面的因素与水平(多糖)

4、响应面实验设计

在单因素实验的基础上，选择对多糖提取率影响较为显著的3个因素作为考察对象，即加酶量(X1)、酶解时间(X2)、酶解温度(X3)为自变量，以DPPH的清除率(Y1)和多糖浓度(Y2)为因变量(响应值)进行Box-Behnken中心组合设计，建立数学模型优化工艺条件。响应面试验设计及结果如下所示：

4.1 Box-Benhken实验设计及实验结果

由Design-Expert 8.0.6统计分析软件中的Box-Benhken试验设计，以对DPPH的清除率(Y1)及马齿苋多糖提取率(Y2)，以加酶量(A)、酶解时间(B)、酶解温度(C)为自变量，建立三因素三水平的中心组合设计，设计15个试验方案，每个试验方案进行3次平行试验取平均值，具体的试验方案及试验结果如表3所示。

表3 Box-Behnken设计方案及试验结果

4.2 Y1回归方程方差分析

以加酶量、酶解时间、酶解温度为自变量，对DPPH的清除率作为响应值，利用Design Expert 8.0.6软件进行非线性回归的二次多项式模型拟合，预测的模型如下：Y1＝+22.53-3.73A+0.60B++0.60C-0.55AB+1.10AC+0.85BC+5.51A²+9.26B²-1.54C²

根据表4，对方差分析进行显著性检验显示，该模型回归不显著(p>0.05)，失拟项显著，计算结果表明该模型R²＝0.8666，说明该模型与实际生产结果拟合性不是很好，这可能与酶解液中其它抗氧化成分的存在有关。

表4 DPPH清除率实验结果方差分析表

注：***差异极显著p＜0.0001；**差异高度显著p＜0.01；*差异显著p＜0.054.3Y2回归方程方差分析

以加酶量、酶解时间、酶解温度为自变量，多糖提取率作为响应值，利用实验设计软件进行非线性回归的二次多项式模型拟合，预测的模型如下：

Y2＝0.87+0.038A-0.033B+0.012C-0.075AB+0.001AC-0.094BC+0.16A²+0.15B²-0.12C²

回归模型系数显著性检验结果见表5。由表5可知,模型的F＝25.86，P<0.01,表明回归模型极显著；失拟项F＝0.55,P>0.05,不显著；复相关系数R²＝0.979,说明该模型能解释97.9％响应值的变化，因而该模型的拟合程度比较好,试验误差小，可以用此模型来分析和预测马齿苋多糖提取工艺结果。

表5多糖提取率实验结果方差分析表

4.4响应曲面分析

根据回归方程得到响应面分析图，考察拟合之后的响应曲面形状，分析所选定的三个变量对考察的二个响应值的影响。通过对响应面等值线的分析寻求最优工艺参数，并且可以通过对3D曲面图的分析，直观地评价各因素间的交互作用。在响应面图中，曲面的倾斜度表明该试验因素对响应值的影响程度，倾斜度越高，即坡度越陡峭，表明该试验因素对响应值的影响越显著。响应面等高线图可以直观地反映出两个因素间交互效应的强弱，等高线的形状越接近椭圆形，表示两个因素交互效应越强，而圆形则反之。如图4～9所示，图5～7响应曲面坡度较陡峭，说明AD、BC和CD之间交互作用较强。

5、验证实验

本实验以马齿苋多糖的提取率为最终考察指标，根据Design-Expert 8.0.6软件对所得回归方程的最优预测值求解，可得果胶酶对马齿苋多糖提取的最佳工艺条件为：在浆液比1:20，果胶酶用量0.246g/kg，酶解温度44.22℃，酶解时间1.516h，酶解液pH5.4，马齿苋多糖提取浓度的理论预测值为2.55％。考虑实际条件，调整为果胶酶用量0.246g/kg，酶解温度44.2℃，酶解时间1.5h，pH5.4。在上述最优条件下进行重复3次平行试验，验证实验所得平均浓度为2.53％，RSD为2.50％。结果表明，经过响应回归方程拟合出的理论值与实际值相吻合，证明本实验建立的二次多项回归方程模型能准确预测各因素与效应面之间的关系。

综上，在单因素实验基础上，采用Box-Behnken响应面实验设计，根据Design-Expert8.0.6软件进行分析，对果胶酶提取马齿苋鲜榨汁中的多糖工艺进行优化，建立了酶解法提取多糖的回归模型，由该模型优化的马齿苋多糖提取的最佳工艺条件为：果胶酶用量0.246g/kg、酶解温度44.2℃、pH 5.4、酶解时间1.5h，多糖得率达到8.13g/kg鲜榨汁。酶法提取马齿苋多糖，提取工艺简洁，提取条件温和，是一种合适的提取马齿苋多糖的方法。

实施例2：

一种马齿苋多糖酶法提取工艺，工艺过程是新鲜马齿苋→挑选→清洗→杀青→压榨→酶解→过滤→酶解液，具体过程如下：

(1)原料预处理：选择无腐烂、无病虫、无损伤的新鲜马齿苋，并用自来水清洗干净，用纯净水过一遍，沥干水分备用。

(2)杀青：蒸汽杀青5min。

(3)压榨：用螺旋榨汁机压榨，得到榨浆，注意在压榨过程中防止或减轻在压榨过程中空气混入而氧化原料。

(4)酶解：将榨浆搅拌均匀，加入超纯水使浆水比为1:20，在酶解温度44.2℃、pH 5.4的条件下加入果胶酶进行酶解浸提，酶解时间1.5h，果胶酶用量为0.246g/kg。

(5)过滤：用四层纱布过滤酶解液，将滤液加热至90℃5min使酶失活，冷却后装入试剂瓶，密封，-4℃保存。

经检测，多糖得率达到8.13g/kg鲜榨浆。

实施例3：

一种马齿苋多糖酶法提取工艺，工艺过程是新鲜马齿苋→挑选→清洗→杀青→压榨→酶解→过滤→酶解液，具体过程如下：

(1)原料预处理：选择无腐烂、无病虫、无损伤的新鲜马齿苋，并用自来水清洗干净，用纯净水过一遍，沥干水分备用。

(2)杀青：蒸汽杀青5min。

(3)压榨：用螺旋榨汁机压榨，得到榨浆，注意在压榨过程中防止或减轻在压榨过程中空气混入而氧化原料。

(4)酶解：将榨浆搅拌均匀，加入超纯水使浆水比为1:18，在酶解温度45℃、pH5.0的条件下加入果胶酶进行酶解浸提，酶解时间1.6h，果胶酶用量为0.25g/kg。

(5)过滤：用四层纱布过滤酶解液，将滤液加热至90℃5min使酶失活，冷却后装入试剂瓶，密封，-4℃保存。

经检测，多糖得率达到8.0g/kg鲜榨汁。

实施例4：

一种马齿苋多糖酶法提取工艺，工艺过程是新鲜马齿苋→挑选→清洗→杀青→压榨→酶解→过滤→酶解液，具体过程如下：

(1)原料预处理：选择无腐烂、无病虫、无损伤的新鲜马齿苋，并用自来水清洗干净，用纯净水过一遍，沥干水分备用。

(2)杀青：蒸汽杀青5min。

(3)压榨：用螺旋榨汁机压榨，得到榨浆，注意在压榨过程中防止或减轻在压榨过程中空气混入而氧化原料。

(4)酶解：将榨浆搅拌均匀，加入超纯水使浆水比为1:22，在酶解温度44℃、pH6.0的条件下加入果胶酶进行酶解浸提，酶解时间1.4h，果胶酶用量为0.3g/kg。

(5)过滤：用四层纱布过滤酶解液，将滤液加热至90℃5min使酶失活，冷却后装入试剂瓶，密封，-4℃保存。

经检测，多糖得率达到7.9g/kg鲜榨汁。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。