一种条件性neuritinknockin小鼠模型的构建方法与流程
本申请属于生物工程领域，更确切地说是提供条件性neuritinknockin小鼠模型的构建方法。
背景技术：
neuritin，也称作可塑性相关候选基因15(cpg15，candidateplasticity-relatedgene15)，是一种与神经可塑性密切相关的神经营养因子。已有研究表明neuritin可抑制神经细胞凋亡，维持神经元的存活，保护运动神经元；促进神经突起的生长及其分支，调节突触回路的形成，介导突触可塑性，因此在神经系统的发育及损伤修复中发挥了重要作用。
近年研究显示，过表达的neuritin与神经生长因子(nervegrowthfactor，ngf)具有协同作用，体外实验表明神经生长因子驱使pc12细胞分化为类神经元细胞，使其长出更长的突起，关于neuritin的功能国内外的研究均表明neuritin能够促进pc12细胞、鸡胚背根神经节和神经元的突起生长和存活，并减少骨髓间充质干细胞和神经祖细胞的凋亡。此外，大鼠脊髓损伤后、小鼠短暂性全脑缺血后、大鼠全脑短暂性缺血后，均出现相应区域neuritin的表达上调，且表达水平的变化趋势与损伤后的功能恢复呈正相关，提示了neuritin与中枢神经损伤后的功能修复密切相关，若是改变小鼠体内neuritin的表达量，可能会对组织结构及功能有所影响。
遗憾的是目前在神经系统受损后neuritin发挥的功能有些受限，通过体外细胞培养研究发现的功能也很少在体内得到进一步的证实，也并不知晓neuritin在耳蜗组织中的表达具有何种生物学功能。
为了进一步在体内研究neuritin基因的功能，并基于重组人神经突起生长因子在神经损伤中的重要修复作用及转基因小鼠的独特优势，构建一个在耳蜗组织特异性过表达neuritin基因小鼠的动物模型，可以更好的从整体动物水平评价neuritin基因的系统生物学功能，以便研究神经退行性疾病中neuritin基因发挥作用的机制。
然而截至目前，国内外文献也未见有条件性neuritinknockin小鼠模型的报道。为了针对现有缺乏条件性neuritinknockin小鼠的不足，而提供一种可以和任何带有基因特异性启动子的cre鼠杂交的条件性neuritinknockin小鼠模型及其构建方法，为研究与人类相关疾病提供模型及奠定实验基础。
因此，为了更好的从整体动物水平评价neuritin基因的系统生物学功能，运用cre/loxp系统，通过位点特异性重组迅速而有效的实现neuritin基因的定点插入，从而建立条件性neuritinknockin小鼠模型，可将该目的基因敲入小鼠与带有组织特异性启动子的cre鼠杂交，而带有组织特异性的启动子的cre鼠的选择是构建组织特异性过表达neuritin基因小鼠模型的关键，只要选择合适的启动子，通过cre/loxp位点依赖的特异性重组，可调控cre重组酶的表达，使neuritin基因只会在表达组织特异性启动子的细胞内发生表达，可实现个体特定的组织和特定的时间选择性的调控neuritin基因的功能，从而更加透彻的在生物体内研究该基因的功能。
关于载体构建，与现有的构建技术相比，本发明可有效减少整个构建的周期。近年来，载体构建的实验中目的片段与载体的连接多采用的是t4连接酶进行连接，很大程度因连接效率低下，造成构建的周期较长。因其平末端的连接效率比粘性末端低，由于平端连接的末端没有特异性，目的片段可能会出现多个插入，并且不能定向连接，所以产生多个插入时不同方向插入的可能性也比较高。在这里推荐使用一种
技术实现要素：
有鉴于此，本申请为了针对现有缺乏条件性neuritinknockin小鼠模型的不足，而提供一种可以和任何带有基因特异性启动子的cre鼠杂交的条件性neuritinknockin小鼠模型及其构建方法，为以后人们研究与人类疾病相关neuritin基因的功能提供了可靠的手段以及奠定了良好的实验基础。
本发明采用以下技术方案：
条件性neuritinknockin小鼠模型的构建方法，利用基因打靶技术，将外源构建的条件性基因打靶载体，定点整合入胚胎干细胞基因组上，从而构建出neuritin基因打靶小鼠。具体包括以下步骤：
pcr扩增neuritin目的基因片段；
制备ctv线性化载体；
in-fusion无缝克隆连接；
连接产物转化至stellar感受态细胞；
菌落pcr鉴定阳性克隆；
小量提取质粒；
质粒酶切鉴定及测序鉴定；
endofreeplasmidmaxikit大量提取测序正确的质粒并进行酶切鉴定；
单酶切使之线性化；
酚氯仿纯化；
电转导入胚胎干细胞；
pcr鉴定胚胎干细胞dna；
将同源重组胚胎干细胞注射入囊胚；
将胚胎移植到代孕母鼠体内；
生产出嵌合体小鼠与野生型小鼠回交；
获得杂合子neuritinknockin小鼠。
与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：
一方面，本发明构建的neuritinknockin小鼠模型是条件性的，可以和任何带有组织特异性启动子的cre鼠杂交，在没有外源给予tamoxifen的情况下neuritin是不表达的，只有在外源性给予tamoxifen的情况下neuritin才会过表达，可实现个体特定的组织和特定的时间选择性的调控neuritin基因的功能，从而更加透彻的在生物体内研究该基因的功能。
另一方面，本发明在knockin载体构建的过程中，使用infusion无缝克隆连接，可以大大加快基因打靶载体的构建进程。使用kodfx高成功率酶可提高同源重组胚胎干细胞的鉴定效率，从而大大减少了整个构建模型的周期。
当然，实施本申请的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1是本发明的pcr扩增目的片段的胶回收图；
图2是本发明的in-fusion无缝克隆连接的示意图。
图3是本发明的两对引物分别鉴定出的阳性克隆为连接成功的克隆的示意图。
图4是本发明的质粒酶切鉴定及测序鉴定的酶切质粒的示意图。其中m：100bpmarker，1-7、9：酶切鉴定正确的ctv-nrn1质粒，m1：1kpplusdnamarker。
图5是本发明的构建的neuritin基因打靶载体图。
图6是本发明的酶切鉴定后用单酶切线性化的示意图。
图7是本发明的pcr鉴定胚胎干细胞dna扩增rosa5’arm片段pcr反应结束后1％的琼脂糖凝胶电泳检测示意图。
图8是本发明的pcr鉴定胚胎干细胞dna扩增rosa3’arm片段pcr反应结束后1％的琼脂糖凝胶电泳检测示意图。
图9是本发明的嵌合体小鼠的示意图。
图10是本发明的获得杂合子neuritinknockin小鼠的示意图。
图11是本发明的流程示意图。
具体实施方式
以下将配合附图及实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明公开了一种条件性neuritinknockin小鼠模型及其构建的方法，利用基因打靶技术，将外源构建的条件性基因打靶载体，定点整合入胚胎干细胞基因组上，从而构建出neuritin基因打靶小鼠。具体包括以下步骤：
pcr扩增neuritin目的基因片段；
制备线性化载体；
in-fusion无缝克隆连接；
连接产物转化至stellar感受态细胞；
菌落pcr鉴定阳性克隆；
小量提质取粒；
质粒酶切鉴定及测序鉴定；
endofreeplasmidmaxikit大量提取测序正确的质粒并进行酶切鉴定；
单酶切使之线性化；
酚氯仿纯化；
电转导入胚胎干细胞；
pcr鉴定胚胎干细胞dna；
将同源重组胚胎干细胞注射入囊胚；
将胚胎移植到代孕母鼠体内；
生产出嵌合体小鼠与野生型小鼠回交；
获得杂合子neuritinknockin小鼠。
与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：
一方面，本发明构建的knockin小鼠模型是条件性的，可以和任何带有组织特异性启动子的cre鼠杂交在没有外源给予tamoxifen的情况下neuritin是不表达的，只有在外源性给予tamoxifen的情况下neuritin才会过表达，可实现个体特定的组织和特定的时间选择性的调控neuritin基因的功能，从而更加透彻的在生物体内研究该基因的功能。本发明在knockin载体构建的过程中，使用in-fusion无缝克隆连接，可以大大加快基因打靶载体的构建进程。使用kodfx高成功率酶可提高同源重组胚胎干细胞的鉴定效率，从而大大减少了整个构建模型的周期。
实施例1
1.pcr扩增neuritin目的片段
根据in-fusion引物15bp同源序列的添加原理引物设计的一般原则，应用onlinetoolsforin-fusioncloning引物设计软件设计引物，并由上海生物工程股份有限公司合成。pcr扩增片段插入线性化的载体，是通过画线部分与载体末端同源的15个碱基序列。以pcdna3.1-nrn1质粒为模板，nrn1-f和nrn1-r为引物进行pcr扩增neuritin片段，同源序列通过pcr扩增引物添加。pcr产物使用omegagelextractionkit进行切胶回收，即插入基因片段，胶回收产物送上海生物工程股份有限公司进行测序，并用blast在线程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)与ncbigenbank文库中发表的neuritinorf序列进行比对。
nm1引物序列为：
上游引物
nm1-f：5’-gaagttatgggcgcgatgggacttaagttgaacggcag-3’
下游引物
nm1-r：5’-cgcggccgcggcgcgtcaatgatgatgatgatgatggaag-3’
扩增neuritin片段，pcr反应体系如下：
循环参数：94℃预变性2min，98℃变性10s、58℃退火30s、72℃延伸30s，进行35个循环，72℃延伸10min。
反应结束后，将pcr产物进行胶回收如图1所示。
2.ctv载体线性化
将ctv载体使用asc1酶37℃水浴14h，反应体系如下：
反应结束后，将酶切产物进行胶回收。
3.连接
将目的基因胶回收产物与ctv载体进行连接。反应体系如下：
反应条件：50℃，15min。连接的过程如图2所示
4.连接产物转化至stellar感受态细胞
1)取2.5μl的连接片段加入盛有50μlsteller感受态细胞的1.5ml离心管中，用移液枪将其轻柔地吹吸混匀，冰上放置30min。
2)把离心管从冰上转移至42℃水浴锅中，静置45s，从水浴锅中取出后直接放置冰上2min。
3)向离心管中加入800μl提前在37℃水浴锅中加热的soc培养基。
4)将离心管固定至37℃摇床，200rpm培养约1h。
5)培养好的菌液离心，移液枪吸弃上清至剩余约300μl时，吹吸混匀菌体，吸100ul用涂布棒均匀涂布于含有100μg/mlamp的lb固体培养基平板上。
6)涂有菌液的平板倒置放入37℃培养箱中，过夜培养。
5.菌落pcr鉴定阳性克隆
1)用10ul无菌枪头挑取一定数量的白色菌落，接种于新lb平板上，倒置放于培养箱中，37℃培养12h；
2)无菌牙签挑取单个菌落为模板至装有24μlpcr反应体系的0.2ml离心管中，使用两对引物分别进行pcr反应，反应引物为：
junluo-f1：5’-caccacaaaggaaaaagctgc-3’
junluo-r1：5’-caatccgtaagggctgtgac-3’
junluo-f2：5’-acctcaacatccaaggcagc-3’
junluo-r2：5’-tgaacttcagggtcagcttgc-3’
反应体系为：
pcr反应，反应体系为：
循环参数：94℃预变性3min，94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸1min进行35个循环，72℃延伸10min。
两对引物分别鉴定出的阳性克隆为连接成功的克隆，如图3所示
6.小量提取质粒
将上述连接成功的菌落，进行小量提取质粒，一部分菌液用于测序。
7.质粒酶切鉴定及测序鉴定
酶切正确的质粒如图4所示。成功构建的neuritin基因打靶载体图谱如图5所示。
8.endofreeplasmidmaxikit大量提取测序正确的质粒并进行酶切鉴定
酶切鉴定后用单酶切使之线性化，如图6所示。
9.单酶切使之线性化
37℃水浴18h，反应体系如下：
10.酚氯仿纯化
1)酚氯仿1∶1和酶切产物等体积混匀，静置，初步分层后离心，12000rpm，15min，4℃；
2)吸取上清，加等体积氯仿，混匀，静置，离心，12000rpm，15min，4℃；
3)吸上清，加1/10体积3m醋酸钠，2.5倍无水乙醇，混匀-20℃，放置2h，14000rpm，10min，4℃；
4)去上清，沉淀用1ml乙醇洗一遍，14000rpm，3min，4℃；
5)去上清，加入1ml70％乙醇置于-20℃
11.载体线性化电转导入胚胎干细胞
1)以丝裂霉素c处理的mef细胞作feeder，培养es细胞。es细胞经过两次传代，生长至指数生长期用于target实验。
2)target实验
1.escell弃medium，dpbs清洗；
2.适量0.05％trypsin-edta，37℃，5％co2培养箱消化6min；
3.medium停止反应，转移至离心管，室温1050rpm，离心3min；
4.dpbs清洗，室温1050rpm，离心3min，弃液体；
5.将已线性化的载体dna与细胞液混合，静置；
6.用滴管将混合液转移至电转杯；
7.伯乐电击仪电击，冰上静置；
8.将电击细胞转移至适量esmedium分装至含有neo.rmef的dish中，混匀，37℃，5％co2培养。
3)g418筛选
从第二天开始，细胞每天换含有g418的新鲜medium。
4)挑克隆、冻板及阳性克隆鉴定
g418筛选的第八天，挑克隆。在解剖镜下选取饱满的、边缘清晰的细胞集落，挑至96-well中。在0.05％trypsin-edta的处理下，每个克隆分装成两份。一般两天后，一份板子可-80℃冻存，用于阳性克隆的复苏；另一份板子一周后可提取dna，用于pcr基因型鉴定。
12.pcr鉴定胚胎干细胞dna
扩增rosa5’arm片段，反应引物如下：
rosa5’arm-f：5’-tcggtgtctcttttctgttggaccctt-3’
rosa5’arm-r：5’-gatgtactgccaagtaggaaagtccca-3’
pcr反应体系如下：
循环参数：94℃预变性2min，98℃变性10s、61℃退火30s、72℃延伸2min30s，进行38个循环，72℃延伸10min。pcr反应结束后1％的琼脂糖凝胶电泳检测，如图7所示。
扩增rosa3’arm片段，反应引物如下：
rosa3’arm-f：5’-agcagaagaacggcatcaaggtgaa-3’
rosa3’arm-r：5’-cagtgttgagggcaatctgggaagg-3’
pcr反应体系如下：
循环参数：94℃预变性1min，98℃变性10s、68℃延伸5min30s，进行38个循环，72℃延伸10min。pcr反应结束后1％的琼脂糖凝胶电泳检测，如图8所示。
13.将同源重组胚胎干细胞注射入囊胚
用嘴控移卵管转移胚胎至显微镜台上的注射操作室，固定住囊胚，将具有icm的胚胎放在6点或12点的位置，瞄准后注射针快速准确的穿过透明带，慢慢地释放es细胞进入囊胚腔，再慢慢抽出注射针。定期的把注射过的胚胎转移到二氧化碳培养箱里，放在m16培养基中。
14.将胚胎移植到代孕母鼠体内
麻醉受体假孕母鼠，暴露受体雌鼠子宫，将注射es细胞的胚胎吸入移卵针，在输卵管子宫结合部几毫米处避开血管处用开孔，将囊胚吹入子宫。术后将小鼠放置于干净的鼠笼里，用50w的灯泡保温，并放在保温台上，直到其苏醒。
15.生产出嵌合体小鼠与野生型小鼠回交
胚胎移植后21天左右小鼠产仔，10天左右可根据毛色显性判断其是否为嵌合体以及嵌合率的情况。用于制备嵌合体的es细胞为近交系129/s1小鼠，毛色表型为棕色；受体胚胎为b6(cg)-tyrc-2j/jb6albino是野生型近交系小鼠，毛色为白色；受体假孕母鼠为封闭群icr(cd-1)，毛色为白色。因此可以根据毛色的不同来判定嵌合体，并且根据嵌合毛色所占的百分比率来估计嵌合率，嵌合体如图9所示。
16.获得杂合子neuritinknockin小鼠
将雄性嵌合体小鼠与b6野生型小鼠交配，后代通过基因型鉴定，含有目的基因片段的杂合子小鼠最终成为成功构建的敲入小鼠f1代，如图10所示。
如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可理解，硬件制造商可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个......”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
上述说明示出并描述了本发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
- 还没有人留言评论。精彩留言会获得点赞！