本发明涉及一种恢复抑癌基因表达的方法，具体讲，是一种使用dna甲基化酶抑制剂恢复抑癌基因pten表达的方法。
背景技术：
：mir-200c家族成员在多种肿瘤中已经被证明能够调节emt。而先前已经有研究表明，mir-200c可以促进pten的表达。而最近有研究表明cpg岛的高甲基化可以介导mir-200家族的表观遗传的调控，从而调节emt及肿瘤的转移。我们通过methprimer-designmsp/bspprimersandpredictcpgisland网站上的methprimer软件预测了mir-200cpromoter可能的cpg岛的位点(fig6c)，并从给出的5对甲基化和非甲基化的引物，通过methl-specificpcr(msp)成功的找到了一对甲基化引物和非甲基化引物进行后续实验。并且从图中可以看出，正常raw264.7细胞和原代巨噬细胞及4t1上清驯化后的raw264.7细胞或是原代巨噬细胞的gdna的mir-200cpromoter处cpg岛的甲基化程度都高，而经过5-aza处理后，mir-200cpromoter甲基化的程度明显降低。mir-21a可以触发甲基化依赖的mir-200c的沉默。cpg岛的高甲基化介导的mir-200家族表观遗传学的沉默与下调pten的表达，促进了m2及转移。我们用甲基化特异性pcr(msp)来分析mir-200的promoter，发现当mir-21a过表达时，mir-200的promoter是高甲基化的。当用dna-去甲基化试剂5’-aza处理，这样就与mir-21a的作用相反并能修复mir-200的转录。这表明，mir-21a可能在动态控制dna甲基化的过程中起着重要的作用。mir-21amimicl间接下调了pten对pi3k/akt信号通路的抑制，变相地助长了肿瘤细胞的生长。换言之，我们认为mir-21a确实是通过调节pten，从而调节pi3k/akt信号通路来发挥作用的。因此，如何发现mir-21a抑制pten表达的机制，并利用这种机制，实现恢复pten表达，从而抑制癌症的发生和发展具有重要的价值。技术实现要素：本发明的目的：本发明旨在探索一种使用dna甲基化酶抑制剂恢复抑癌基因pten表达的方法。本发明的技术原理：mir-21a一方面可以直接靶向pten的3’utr区域，从而下调pten的表达，进而影响了pi3k/akt信号通路，从而影响巨噬细胞极性的转化，从而更加利于肿瘤细胞的迁移和增殖；另一方面，mir-21a还可以触发mir-200cpromoter的cpg岛高甲基化，从而抑制mir-200c的表达，进而间接抑制了pten的表达。依据上述原理，我们使用dna甲基化酶抑制剂5’-aza恢复mir-200家族的表达，进而恢复pten的表达，从而实现控制肿瘤发生发展的目的。本发明是通过以下技术方案实现的：使用5’-aza处理的正常raw264.7细胞和原代巨噬细胞，比较处理后该细胞的mir-200cpromoter处cpg岛的甲基化程度和抑癌基因pten的表达水平，评估使用dna甲基化酶抑制剂5’-aza恢复抑癌基因pten表达的方法。附图说明图1methl-specificpcr检测raw264.7细胞系和原代巨噬细胞中mir-200c的启动子甲基化情况。可见正常raw264.7细胞和原代巨噬细胞mir-200cpromoter处cpg岛的甲基化程度都高，而经过5-aza处理后，mir-200cpromoter甲基化的程度明显降低。图2通过细胞毒性确定dna甲基化酶抑制剂5’-aza作用浓度。可见在2微摩尔每升的浓度下，细胞能够保持60％的活性，本着尽可能提高5’-aza的作用浓度以及节约试剂的原则，确定2微摩尔每升作为作用浓度。图3通过realtimepcr方法确定dna甲基化酶抑制剂5’-aza的作用时间使用2摩尔每升的5’-aza作用细胞，处理不同的时间(即0h，24h，48h，72h，84h和96h)，检测使用realtimepcr的方法检测pri-200c的表达。可见在84h时得到了最高的表达量。因此选择2微摩尔每升的5’-aza作用84h作为dna甲基化酶抑制剂的作用时间。图4使用realtimepcr评估raw264.7细胞系中5’-aza恢复抑癌基因pten表达的结果。realtimepcr的结果表明，用5-aza处理经4t1上清驯化后的raw264.7中mir-21a的表达基本没有变化，而mir-200c，mir-200a，pten的表达明显上调。图5使用realtimepcr评估原代巨噬细胞中5’-aza恢复抑癌基因pten表达的结果。realtimepcr的结果表明，用5-aza处理经4t1上清驯化后的原代巨噬细胞中mir-21a的表达基本没有变化，而mir-200c，mir-200a，pten的表达明显上调。具体实施方式一、确定甲基化程度变化研究表明cpg岛的高甲基化可以介导mir-200家族的表观遗传的调控，从而调节emt及肿瘤的转移。在本发明中我们通过methprimer-designmsp/bspprimersandpredictcpgisland网站上的methprimer软件预测了mir-200cpromoter可能的cpg岛的位点，并从给出的5对甲基化和非甲基化的引物，通过methl-specificpcr(msp)成功的找到了一对甲基化引物和非甲基化引物进行后续实验。从该研究结果显示，正常raw264.7细胞和原代巨噬细胞mir-200cpromoter处cpg岛的甲基化程度都高，而经过5-aza处理后，mir-200cpromoter甲基化的程度明显降低。(如图1所示)二、确定dna甲基化酶抑制剂5’-aza的作用浓度本发明通过细胞毒实验确定dna甲基化酶抑制剂5’-aza的作用浓度，使用的细胞系为cck8。分别选取0.1微摩尔每升，0.5微摩尔每升，1微摩尔每升，2微摩尔每升，4微摩尔每升，8微摩尔每升和16微摩尔每升进行比较评估细胞毒性。得到的结果如图2所示，本着尽可能提高5’-aza的作用浓度以及节约试剂的原则，我们选择了2微摩尔每升作为作用浓度。三、确定dna甲基化酶抑制剂5’-aza的作用时间本发明通过pri-200c的表达量评估dna甲基化酶抑制剂5’-aza的作用时间。具体方法如下，使用2微摩尔每升的5’-aza作用细胞，处理不同的时间(即0h，24h，48h，72h，84h和96h)，检测使用realtimepcr的方法检测pri-200c的表达。得到的结果如图3所示，可以确定在84h时，pri-200c的表达量最大。因此选择2微摩尔每升的5’-aza作用84h作为dna甲基化酶抑制剂的作用时间。实施例1使用本发明确定的dna甲基化酶抑制剂5’-aza的作用浓度2微摩尔每升和作用时间84小时，处理经过驯化的raw264.7细胞系样品1。处理结束后，提取细胞系样品的总rna，使用逆转录试剂盒进行逆转录得到总cdna，而后使用特异性的引物分别扩增mir-21a，mir-200c，pten，p53，ccl2，vegfa等六个基因，以ct值作为表达量的依据，进行记录。同时使用同样的方法提取对照组没有经过dna甲基化酶抑制剂5’-aza处理的raw264.7细胞系样品1的总rna。使用逆转录试剂盒进行逆转录得到总cdna，而后使用特异性的引物分别扩增mir-21a，mir-200c，pten，p53，ccl2，vegfa等六个基因，以ct值作为表达量的依据，也进行记录。而后将实验组的表达量与对照组的表达量进行比较得到实验组的相对表达量，该相对表达量为对照组表达量作为1时的相对值。得到结果为：基因mir-21amir-200cptenp53ccl2vegfa表达量1.181.801.773.820.310.30结果显示raw264.7细胞系样品1中mir-21a，mir-200c，pten，p53高表达，ccl2，vegfa低表达。实施例2使用本发明确定的dna甲基化酶抑制剂5’-aza的作用浓度2微摩尔每升和作用时间84小时，处理经过驯化的raw264.7细胞系样品2。处理结束后，提取细胞系样品的总rna，使用逆转录试剂盒进行逆转录得到总cdna，而后使用特异性的引物分别扩增mir-21a，mir-200c，pten，p53，ccl2，vegfa等六个基因，以ct值作为表达量的依据，进行记录。同时使用同样的方法提取对照组没有经过dna甲基化酶抑制剂5’-aza处理的raw264.7细胞系样品2的总rna。使用逆转录试剂盒进行逆转录得到总cdna，而后使用特异性的引物分别扩增mir-21a，mir-200c，pten，p53，ccl2，vegfa等六个基因，以ct值作为表达量的依据，也进行记录。而后将实验组的表达量与对照组的表达量进行比较得到实验组的相对表达量，该相对表达量为对照组表达量作为1时的相对值。得到结果为：基因mir-21amir-200cptenp53ccl2vegfa表达量1.191.831.793.800.330.31结果显示raw264.7细胞系样品2中mir-21a，mir-200c，pten，p53高表达，ccl2，vegfa低表达。实施例3使用本发明确定的dna甲基化酶抑制剂5’-aza的作用浓度2微摩尔每升和作用时间84小时，处理经过驯化的raw264.7细胞系样品3。处理结束后，提取细胞系样品的总rna，使用逆转录试剂盒进行逆转录得到总cdna，而后使用特异性的引物分别扩增mir-21a，mir-200c，pten，p53，ccl2，vegfa等六个基因，以ct值作为表达量的依据，进行记录。同时使用同样的方法提取对照组没有经过dna甲基化酶抑制剂5’-aza处理的raw264.7细胞系样品3的总rna。使用逆转录试剂盒进行逆转录得到总cdna，而后使用特异性的引物分别扩增mir-21a，mir-200c，pten，p53，ccl2，vegfa等六个基因，以ct值作为表达量的依据，也进行记录。而后将实验组的表达量与对照组的表达量进行比较得到实验组的相对表达量，该相对表达量为对照组表达量作为1时的相对值。得到结果为：基因mir-21amir-200cptenp53ccl2vegfa表达量1.191.801.803.850.330.31结果显示raw264.7细胞系样品3中mir-21a，mir-200c，pten，p53高表达，ccl2，vegfa低表达。实施例4使用本发明确定的dna甲基化酶抑制剂5’-aza的作用浓度2微摩尔每升和作用时间84小时，处理经过驯化的raw264.7细胞系样品4。处理结束后，提取细胞系样品的总rna，使用逆转录试剂盒进行逆转录得到总cdna，而后使用特异性的引物分别扩增mir-21a，mir-200c，pten，p53，ccl2，vegfa等六个基因，以ct值作为表达量的依据，进行记录。同时使用同样的方法提取对照组没有经过dna甲基化酶抑制剂5’-aza处理的raw264.7细胞系样品4的总rna。使用逆转录试剂盒进行逆转录得到总cdna，而后使用特异性的引物分别扩增mir-21a，mir-200c，pten，p53，ccl2，vegfa等六个基因，以ct值作为表达量的依据，也进行记录。而后将实验组的表达量与对照细的表达量进行比较得到实验组的相对表达量，该相对表达量为对照组表达量作为1时的相对值。得到结果为：基因mir-21amir-200cptenp53ccl2vegfa表达量1.191.851.863.800.340.33结果显示raw264.7细胞系样品4中mir-21a，mir-200c，pten，p53高表达，ccl2，vegfa低表达。实施例5使用本发明确定的dna甲基化酶抑制剂5’-aza的作用浓度2微摩尔每升和作用时间84小时，处理经过驯化的raw264.7细胞系样品5。处理结束后，提取细胞系样品的总rna，使用逆转录试剂盒进行逆转录得到总cdna，而后使用特异性的引物分别扩增mir-21a，mir-200c，pten，p53，ccl2，vegfa等六个基因，以ct值作为表达量的依据，进行记录。同时使用同样的方法提取对照组没有经过dna甲基化酶抑制剂5’-aza处理的raw264.7细胞系样品5的总rna。使用逆转录试剂盒进行逆转录得到总cdna，而后使用特异性的引物分别扩增mir-21a，mir-200c，pten，p53，ccl2，vegfa等六个基因，以ct值作为表达量的依据，也进行记录。而后将实验细的表达量与对照组的表达量进行比较得到实验组的相对表达量，该相对表达量为对照组表达量作为1时的相对值。得到结果为：基因mir-21amir-200cptenp53ccl2vegfa表达量1.191.861.823.800.330.30结果显示raw264.7细胞系样品5中mir-21a，mir-200c，pten，p53高表达，ccl2，vegfa低表达。实施例6使用本发明确定的dna甲基化酶抑制剂5’-aza的作用浓度2微摩尔每升和作用时间84小时，处理经过驯化的原代巨噬细胞系样品1。处理结束后，提取细胞系样品的总rna，使用逆转录试剂盒进行逆转录得到总cdna，而后使用特异性的引物分别扩增mir-21a，mir-200c，pten，p53，ccl2，vegfa等六个基因，以ct值作为表达量的依据，进行记录。同时使用同样的方法提取对照组没有经过dna甲基化酶抑制剂5’-aza处理的原代巨噬细胞系样品1的总rna。使用逆转录试剂盒进行逆转录得到总cdna，而后使用特异性的引物分别扩增mir-21a，mir-200c，pten，p53，ccl2，vegfa等六个基因，以ct值作为表达量的依据，也进行记录。而后将实验组的表达量与对照组的表达量进行比较得到实验组的相对表达量，该相对表达量为对照组表达量作为1时的相对值。得到结果为：基因mir-21amir-200cptenp53ccl2vegfa表达量1.191.651.781.780.211.00结果显示原代巨噬细胞系样品1中mir-21a，mir-200c，pten，p53高表达，ccl2，vegfa低表达。实施例7使用本发明确定的dna甲基化酶抑制剂5’-aza的作用浓度2微摩尔每升和作用时间84小时，处理经过驯化的原代巨噬细胞系样品2。处理结束后，提取细胞系样品的总rna，使用逆转录试剂盒进行逆转录得到总cdna，而后使用特异性的引物分别扩增mir-21a，mir-200c，pten，p53，ccl2，vegfa等六个基因，以ct值作为表达量的依据，进行记录。同时使用同样的方法提取对照组没有经过dna甲基化酶抑制剂5’-aza处理的原代巨噬细胞系样品2的总rna。使用逆转录试剂盒进行逆转录得到总cdna，而后使用特异性的引物分别扩增mir-21a，mir-200c，pten，p53，ccl2，vegfa等六个基因，以ct值作为表达量的依据，也进行记录。而后将实验组的表达量与对照组的表达量进行比较得到实验组的相对表达量，该相对表达量为对照组表达量作为1时的相对值。得到结果为：基因mir-21amir-200cptenp53ccl2vegfa表达量1.221.681.811.810.221.01结果显示原代巨噬细胞系样品2中mir-21a，mir-200c，pten，p53高表达，ccl2，vegfa低表达。实施例8使用本发明确定的dna甲基化酶抑制剂5’-aza的作用浓度2微摩尔每升和作用时间84小时，处理经过驯化的原代巨噬细胞系样品3。处理结束后，提取细胞系样品的总rna，使用逆转录试剂盒进行逆转录得到总cdna，而后使用特异性的引物分别扩增mir-21a，mir-200c，pten，p53，ccl2，vegfa等六个基因，以ct值作为表达量的依据，进行记录。同时使用同样的方法提取对照组没有经过dna甲基化酶抑制剂5’-aza处理的原代巨噬细胞系样品3的总rna。使用逆转录试剂盒进行逆转录得到总cdna，而后使用特异性的引物分别扩增mir-21a，mir-200c，pten，p53，ccl2，vegfa等六个基因，以ct值作为表达量的依据，也进行记录。而后将实验组的表达量与对照组的表达量进行比较得到实验组的相对表达量，该相对表达量为对照组表达量作为1时的相对值。得到结果为：基因mir-21amir-200cptenp53ccl2vegfa表达量1.231.681.851.800.201.03结果显示原代巨噬细胞系样品3中mir-21a，mir-200c，pten，p53高表达，ccl2，vegfa低表达。实施例9使用本发明确定的dna甲基化酶抑制剂5’-aza的作用浓度2微摩尔每升和作用时间84小时，处理经过驯化的原代巨噬细胞系样品4。处理结束后，提取细胞系样品的总rna，使用逆转录试剂盒进行逆转录得到总cdna，而后使用特异性的引物分别扩增mir-21a，mir-200c，pten，p53，ccl2，vegfa等六个基因，以ct值作为表达量的依据，进行记录。同时使用同样的方法提取对照组没有经过dna甲基化酶抑制剂5’-aza处理的原代巨噬细胞系样品4的总rna。使用逆转录试剂盒进行逆转录得到总cdna，而后使用特异性的引物分别扩增mir-21a，mir-200c，pten，p53，ccl2，vegfa等六个基因，以ct值作为表达量的依据，也进行记录。而后将实验组的表达量与对照组的表达量进行比较得到实验组的相对表达量，该相对表达量为对照组表达量作为1时的相对值。得到结果为：基因mir-21amir-200cptenp53ccl2vegfa表达量1.211.711.831.830.201.05结果显示原代巨噬细胞系样品4中mir-21a，mir-200c，pten，p53高表达，ccl2，vegfa低表达。实施例10使用本发明确定的dna甲基化酶抑制剂5’-aza的作用浓度2微摩尔每升和作用时间84小时，处理经过驯化的原代巨噬细胞系样品5。处理结束后，提取细胞系样品的总rna，使用逆转录试剂盒进行逆转录得到总cdna，而后使用特异性的引物分别扩增mir-21a，mir-200c，pten，p53，ccl2，vegfa等六个基因，以ct值作为表达量的依据，进行记录。同时使用同样的方法提取对照组没有经过dna甲基化酶抑制剂5’-aza处理的原代巨噬细胞系样品5的总rna。使用逆转录试剂盒进行逆转录得到总cdna，而后使用特异性的引物分别扩增mir-21a，mir-200c，pten，p53，ccl2，vegfa等六个基因，以ct值作为表达量的依据，也进行记录。而后将实验组的表达量与对照组的表达量进行比较得到实验组的相对表达量，该相对表达量为对照组表达量作为1时的相对值。得到结果为：基因mir-21amir-200cptenp53ccl2vegfa表达量1.211.681.801.850.231.05结果显示原代巨噬细胞系样品5中mir-21a，mir-200c，pten，p53高表达，ccl2，vegfa低表达。汇总实施例1-5得到使用realtimepcr评估raw264.7细胞系中5’-aza恢复抑癌基因pten表达的结果，如图4所示。可见用5-aza处理经4t1上清驯化后的raw264.7中mir-21a的表达基本没有变化，而mir-200c，mir-200a，pten的表达明显上调。汇总实施例6-10得到使用realtimepcr评估原代巨噬细胞中5’-aza恢复抑癌基因pten表达的结果，如图5所示。可见用5-aza处理经4t1上清驯化后的原代巨噬细胞中mir-21a的表达基本没有变化，而mir-200c，mir-200a，pten的表达明显上调。当前第1页12