本发明属于生物领域，涉及一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞til的方法。
背景技术：
免疫治疗是新兴的一种肿瘤治疗方式，已经被列为继手术、放疗、化疗后的第四种治疗方式，在肿瘤的综合治疗中逐渐发挥重要作用。2010年，美国fda批准世界上第一个细胞免疫治疗产品provenge上市，充分显示出细胞免疫治疗在肿瘤治疗中的价值。
肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltratinglymphocyte，til)是存在于肿瘤间质内的以淋巴细胞为主的异质性淋巴细胞群体，大多聚集在肿瘤周围或其间质呈套状围绕癌巢。其主要成分是存在于肿瘤间质内的t淋巴细胞，小部分为mhc非限制性的nk细胞，其共同特征为表达t细胞受体(tcellreceptor，tcr)。til来自肿瘤组织区域，可特异识别自体肿瘤，具有特异的mhc限制性溶解肿瘤活性。美国nci的rosenberg等首次证实，从实体瘤组织分离的til在体外经il-2激活并大量扩增后，可用于晚期黑色素瘤患者的治疗，其治疗效果远远高于之前发展的lak(lymphokineactivatedkillercells)细胞治疗技术(文献：expansionofhumantumorinfiltratinglymphocytesforuseinimmunotherapytrials.jimmunolmethods1987)。近年发表的多篇临床试验报道显示，til细胞免疫治疗可治愈20％～40％晚期黑色素瘤，充分显示出til作为细胞免疫治疗手段在肿瘤治疗中的潜力(文献：anewapproachtotheadoptiveimmunotherapyofcancerwithtumor-infiltratinglymphocytes.science1986)。
但是，目前体外扩增til的方法存在两点不足：
第一，扩增效率不高，限制了肿瘤患者til的大量回输使用；
第二，对肿瘤细胞的杀伤力还有待提高，回输肿瘤患者体内后对肿瘤的杀伤力不足。
技术实现要素：
本发明旨在克服现有技术不足，提供一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞til的方法，一方面提高til细胞的扩增效率，另一方面提高其对肿瘤细胞的杀伤力。
本发明技术方案如下：
一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞til的方法，正式培养前使用含有抗cd3单抗、抗cd28单抗和呋喃天竺葵酮a或呋喃天竺葵酮b的培养基孵育24h。
优选地，具体步骤为：
步骤s1、til细胞分离
取癌症患者手术切除的新鲜癌旁组织浸泡于pbs中，剔除周围的血块、脂肪及坏死组织，pbs清洗一遍，剪成1mm3大小，浸入0.1μg/ml的iv型胶原酶溶液中，37℃水浴消化2h。消化完毕后用100μm孔径的网筛过滤，用pbs冲洗组织块，收集滤液。细胞滤液在常温下离心，1500r/min×5min。弃上清，加入pbs制成细胞悬液后，用淋巴细胞分离液作不连续密度梯度离心。离心结束后收取下层界面的淋巴细胞，经pbs清洗后，按1×106/ml的浓度悬浮于含10％人ab型血清和il-2的x-vivo-15培养基内，接种于12孔板上，3ml/孔，置于37℃、5％co2培养箱内培养，每3～5d换液一次。
步骤s2、培养和扩增
当孔里的淋巴细胞生长至1×107时，将其转入含有抗cd3单抗、抗cd28单抗和呋喃天竺葵酮a或呋喃天竺葵酮b的培养瓶内孵育，孵育24h后加入il-2，置于37℃、5％co2培养箱内连续培养，培养过程中每隔2～3d半量更换含同等浓度il-2的新鲜x-vivo-15培养基，培养22～25d后收获体外扩增的til。
优选地，步骤s1中il-2的浓度为2000iu/ml。
优选地，抗cd3单抗浓度为20ng/ml。
优选地，抗cd28单抗浓度为20ng/ml。
优选地，呋喃天竺葵酮a或呋喃天竺葵酮b的浓度为20μg/ml。
优选地，步骤s2中il-2的浓度为4000iu/ml。
一种用于体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞til的培养基，通过在x-vivo-15培养基中添加20μg/ml的呋喃天竺葵酮a或呋喃天竺葵酮b配制而成。
优选地，还含有20ng/ml的抗cd3单抗。
优选地，还含有20ng/ml的抗cd28单抗。
一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞til的方法，正式培养前使用含有抗cd3单抗、抗cd28单抗和益智仁萜二醇a或益智仁萜二醇b的培养基孵育24h。
优选地，具体步骤为：
步骤s1、til细胞分离
取癌症患者手术切除的新鲜癌旁组织浸泡于pbs中，剔除周围的血块、脂肪及坏死组织，pbs清洗一遍，剪成1mm3大小，浸入0.1μg/ml的iv型胶原酶溶液中，37℃水浴消化2h。消化完毕后用100μm孔径的网筛过滤，用pbs冲洗组织块，收集滤液。细胞滤液在常温下离心，1500r/min×5min。弃上清，加入pbs制成细胞悬液后，用淋巴细胞分离液作不连续密度梯度离心。离心结束后收取下层界面的淋巴细胞，经pbs清洗后，按1×106/ml的浓度悬浮于含10％人ab型血清和il-2的x-vivo-15培养基内，接种于12孔板上，3ml/孔，置于37℃、5％co2培养箱内培养，每3～5d换液一次。
步骤s2、培养和扩增
当孔里的淋巴细胞生长至1×107时，将其转入含有抗cd3单抗、抗cd28单抗和益智仁萜二醇a或益智仁萜二醇b的培养瓶内孵育，孵育24h后加入il-2，置于37℃、5％co2培养箱内连续培养，培养过程中每隔2～3d半量更换含同等浓度il-2的新鲜x-vivo-15培养基，培养22～25d后收获体外扩增的til。
优选地，步骤s1中il-2的浓度为2000iu/ml。
优选地，抗cd3单抗浓度为20ng/ml。
优选地，抗cd28单抗浓度为20ng/ml。
优选地，益智仁萜二醇a或益智仁萜二醇b的浓度为20μg/ml。
优选地，步骤s2中il-2的浓度为4000iu/ml。
一种用于体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞til的培养基，通过在x-vivo-15培养基中添加20μg/ml的益智仁萜二醇a或益智仁萜二醇b配制而成。
优选地，还含有20ng/ml的抗cd3单抗。
优选地，还含有20ng/ml的抗cd28单抗。
一种体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞til的方法，正式培养前使用含有抗cd3单抗、抗cd28单抗和曼宋酮c或曼宋酮g的培养基孵育24h。
优选地，具体步骤为：
步骤s1、til细胞分离
取癌症患者手术切除的新鲜癌旁组织浸泡于pbs中，剔除周围的血块、脂肪及坏死组织，pbs清洗一遍，剪成1mm3大小，浸入0.1μg/ml的iv型胶原酶溶液中，37℃水浴消化2h。消化完毕后用100μm孔径的网筛过滤，用pbs冲洗组织块，收集滤液。细胞滤液在常温下离心，1500r/min×5min。弃上清，加入pbs制成细胞悬液后，用淋巴细胞分离液作不连续密度梯度离心。离心结束后收取下层界面的淋巴细胞，经pbs清洗后，按1×106/ml的浓度悬浮于含10％人ab型血清和il-2的x-vivo-15培养基内，接种于12孔板上，3ml/孔，置于37℃、5％co2培养箱内培养，每3～5d换液一次。
步骤s2、培养和扩增
当孔里的淋巴细胞生长至1×107时，将其转入含有抗cd3单抗、抗cd28单抗和曼宋酮c或曼宋酮g的培养瓶内孵育，孵育24h后加入il-2，置于37℃、5％co2培养箱内连续培养，培养过程中每隔2～3d半量更换含同等浓度il-2的新鲜x-vivo-15培养基，培养22～25d后收获体外扩增的til。
优选地，步骤s1中il-2的浓度为2000iu/ml。
优选地，抗cd3单抗浓度为20ng/ml。
优选地，抗cd28单抗浓度为20ng/ml。
优选地，曼宋酮c或曼宋酮g的浓度为20μg/ml。
优选地，步骤s2中il-2的浓度为4000iu/ml。
一种用于体外扩增肿瘤浸润淋巴细胞til的培养基，通过在x-vivo-15培养基中添加20μg/ml的曼宋酮c或曼宋酮g配制而成。
优选地，还含有20ng/ml的抗cd3单抗。
优选地，还含有20ng/ml的抗cd28单抗。
有益效果：
本发明提供的方法通过在培养基中添加少量呋喃天竺葵酮a、呋喃天竺葵酮b、益智仁萜二醇a、益智仁萜二醇b、曼宋酮c或曼宋酮g，不仅可以显著促进til细胞的体外增殖，还可以显著提高til细胞对肿瘤细胞的杀伤力。呋喃天竺葵酮a、呋喃天竺葵酮b、益智仁萜二醇a、益智仁萜二醇b、曼宋酮c或曼宋酮g可以用于制备til细胞培养液。
附图说明
图1为呋喃天竺葵酮类化合物孵育的til细胞对肝癌细胞的杀伤力；
图2为益智仁萜二醇类化合物孵育的til细胞对肝癌细胞的杀伤力；
图3为曼宋酮类化合物孵育的til细胞对肝癌细胞的杀伤力。
具体实施方式
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。
实施例1：
一、实验材料
x-vivo-15培养基购自lonza公司；磷酸缓冲液(pbs)、rpmi1640培养基、cd3单抗、cd28单抗购自gibco公司；人ab型血清由淮安市血液中心提供；il-2购自北京四环生物制药公司；胶原酶iv型购自sigma公司；淋巴细胞分离液购自天津美德太平洋公司。
人肝癌细胞株hepg2为本公司冻存，复苏后采用含10％胎牛血清的rpmi1640培养基置于37℃、5％co2培养箱内传代培养。
呋喃天竺葵酮a(cas号：1143-45-9)、呋喃天竺葵酮b(cas号：1143-46-0)、益智仁萜二醇a(cas号：363610-30-4)、益智仁萜二醇b(cas号：363610-32-6)、曼宋酮c(cas号：5574-34-5)、曼宋酮f(cas号：5090-88-0)、曼宋酮g(cas号：7715-96-0)纯度不低于98％，化学结构式如下。
二、实验方法
1、til细胞的分离
取肝癌患者手术切除的新鲜肝癌癌旁组织浸泡于pbs中，剔除周围的血块、脂肪及坏死组织，pbs清洗一遍，剪成1mm3大小，浸入0.1μg/ml的iv型胶原酶(sigma-aldrich)溶液中，37℃水浴消化2h。消化完毕后用100μm孔径的网筛过滤，用pbs冲洗组织块，收集滤液。细胞滤液在常温下离心，1500r/min×5min。弃上清，加入pbs制成细胞悬液后，用淋巴细胞分离液作不连续密度梯度离心。离心结束后收取下层界面的淋巴细胞，经pbs清洗后，按1×106/ml的浓度悬浮于含10％人ab型血清和il-2(2000iu/ml)的x-vivo-15培养基内，接种于12孔板上，3ml/孔，置于37℃、5％co2培养箱内培养，每3～5d换液一次。
2、实验分组
组别包括：呋喃天竺葵酮a、呋喃天竺葵酮b、益智仁萜二醇a、益智仁萜二醇b、曼宋酮c、曼宋酮f或曼宋酮g孵育组；不添加这些药物的对照组。
3、til细胞的培养和扩增方法
当孔里的淋巴细胞生长至1×107时，将其转入含有20ng/ml的抗cd3单抗、20ng/ml的抗cd28单抗和20μg/ml的呋喃天竺葵酮a、呋喃天竺葵酮b、益智仁萜二醇a、益智仁萜二醇b、曼宋酮c、曼宋酮f或曼宋酮g的培养瓶内孵育，孵育24h后加入4000iu/ml的il-2，置于37℃、5％co2培养箱内连续培养，培养过程中每隔2～3d半量更换含同等浓度il-2的新鲜x-vivo-15培养基，培养22～25d后收获体外扩增的til并对各组til细胞进行计数。
4、对肿瘤细胞杀伤力检测
人肝癌细胞株hepg2为本公司冻存，复苏后采用含10％胎牛血清的rpmi1640培养基置于37℃、5％co2培养箱内传代培养，取对数期进行后续实验。
取各组培养23d的til细胞作为效应细胞，以hepg2肝癌细胞为靶细胞，按20:1效靶比分别把效应细胞和靶细胞加入96孔板，另设单独靶细胞和单独效应细胞组，每组设3个复孔，放置37℃、5％co2孵箱中培养24h后，每孔加mtt(5mg/ml)10μl，继续培养4h，离心弃上清，每孔加二甲基亚砜150μl，振荡溶解10min后，用酶标仪570nm测吸光值a，按如下公式计算各组til细胞对肝癌细胞的杀伤活性。
杀伤率(％)＝[1-(实验组a值-单独效应细胞a值)/单独靶细胞a值]×100％
5、统计学处理
数据采用均值±标准偏差表示，用spss17.0统计软件行t检验，p<0.05具有统计学意义。
三、实验结果
1、各组til细胞的体外扩增
结果如表1所示。培养23d时，呋喃天竺葵酮a、呋喃天竺葵酮b、益智仁萜二醇a、益智仁萜二醇b、曼宋酮c或曼宋酮g孵育组的til细胞总数显著高于对照组(p<0.05)，曼宋酮f孵育组的til细胞总数与对照组的差异不明显(p＞0.05)。
表1各组til细胞总数
可见，呋喃天竺葵酮a、呋喃天竺葵酮b、益智仁萜二醇a、益智仁萜二醇b、曼宋酮c或曼宋酮g可以显著促进til细胞的体外增殖。
2、各组til细胞对肿瘤细胞的杀伤活性
培养23d时，呋喃天竺葵酮a、呋喃天竺葵酮b、益智仁萜二醇a、益智仁萜二醇b、曼宋酮c或曼宋酮g孵育组的til细胞对肝癌细胞的杀伤活性显著优于对照组(p<0.05)，曼宋酮f孵育组的til细胞对肝癌细胞的杀伤活性与对照组的差异不明显(p＞0.05)。
结果如表2和图1-3所示。
表2各组til细胞对肿瘤细胞的杀伤活性
可见，呋喃天竺葵酮a、呋喃天竺葵酮b、益智仁萜二醇a、益智仁萜二醇b、曼宋酮c或曼宋酮g可以显著提高til细胞对肝癌细胞的杀伤力。
实施例2：
一种til细胞培养基，通过在x-vivo-15培养基中添加20μg/ml的呋喃天竺葵酮a、呋喃天竺葵酮b、益智仁萜二醇a、益智仁萜二醇b、曼宋酮c或曼宋酮g配制而成。在用于培养til细胞时，仅需要再添加适量抗cd3单抗和抗cd28单抗即可，使用便捷。
本发明提供的方法通过在培养基中添加少量呋喃天竺葵酮a、呋喃天竺葵酮b、益智仁萜二醇a、益智仁萜二醇b、曼宋酮c或曼宋酮g，不仅可以显著促进til细胞的体外增殖，还可以显著提高til细胞对肿瘤细胞的杀伤力。呋喃天竺葵酮a、呋喃天竺葵酮b、益智仁萜二醇a、益智仁萜二醇b、曼宋酮c或曼宋酮g可以用于制备til细胞培养液。
上述实施例旨在具体介绍本发明实质性内容，但本发明的保护范围局限于该具体实施例。