1-(3,5-二甲氧基苯基)-3-(取代嘧啶-4-基)脲类化合物及其制备和应用的制作方法

本发明涉及医药化学技术领域，尤其涉及一种1-(3,5-二甲氧基苯基)-3-(6-(取代苯胺基)嘧啶-4-基)脲类egfr/fgfr双重小分子抑制剂及其制备方法与应用。

背景技术

受体酪氨酸激酶(receptortyrosinekinases，rtks)是人体中最大的一类酶联受体，人类基因组中已知的rtks共有58种。rtks在细胞生长、增殖、迁移和分化等活动中起着至关重要的作用，从表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptors，egfrs)、成纤维细胞生长因子受体(fibroblastgrowthfactorreceptors，fgfrs)、肝细胞生长因子受体(hepatocytegrowthfactorreceptors，hgfrs)、以及血小板衍生生长因子受体(platelet-derivedgrowthfactorreceptors，pdgfr)等许多rtks发出的信号，已被药理学证明对表达相关蛋白质突变形式的癌症的生存至关重要。靶向这些失调的rtks的酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitors，tkis)，可以给癌症患者带来明显的临床益处。rtks中的egfr和fgfr都已被充分表征为nsclc的重要致癌驱动因素。在过去的十几年中，已有许多egfr-tkis被直接批准用于特定的nsclc患者的临床治疗，例如第一代的egfr-tkis吉非替尼(gefitinib)和厄洛替尼(erlotinib)；第二代的egfr-tkis阿法替尼(afatinib)；以及第三代的egfr-tkis奥希替尼(osimertinib)。而作为另一重要的抗nsclc的药物作用靶标fgfr，虽说还没有相对应的上市药物，但因为近年来，有大量的体外研究和独立实验表明，在nsclc中存在着fgfr1的基因扩增和fgfr2的过表达。且在一项对59个nsclc患者的定量rt-pcr实验中发现，nsclc患者的肿瘤组织fgfr1的转录活性是癌旁组织的两倍多。因此，越来越多的fgfr-tkis也正被报道用于治疗nsclc的探索研究。

然而，尽管已有多种化学型的小分子抑制剂作为egfr-tkis和fgfr-tkis进行了抗nsclc的广泛研究，但迄今为止，还没有真正可以作为两种激酶受体的双重小分子抑制剂的相关报道。已经证明，临床使用egfr-tkis如吉非替尼或阿法替尼治疗后，会以负反馈的方式增加nsclc细胞株的fgfr1的扩增而产生耐药(原理见图1)，而通过基因沉默方式敲除fgfr1，或是同fgfr-tkis进行联合用药处理，可以有效抑制耐药株的形成。由此可见，对egfr靶向抑制而导致的fgfr负反馈活化，即旁路激活，也是egfr-tkis产生耐药抵抗的重要原因之一；并且，随着进行单细胞测序的能力提高，已有报道同时携带突变型egfr和fgfr的致癌等位基因的肿瘤。考虑到，不同类别的药物联合使用，往往存在患者用药不便、药物相互作用或配伍禁忌，结果出现一些毒副作用或不良反应。所以，egfr与fgfr的双重抑制剂的研发特别是对于nsclc及其耐药治疗，具有迫切的临床需要和发展前景。

技术实现要素：

本发明提供了一种1-(3,5-二甲氧基苯基)-3-(取代嘧啶-4-基)脲类化合物及其制备和应用，这类化合物具有较好的抗肿瘤活性，并可以在一定程度上防止耐药性的产生。

本发明采用如下技术方案：

本发明的1-(3,5-二甲氧基苯基)-3-(6-(取代苯胺基)嘧啶-4-基)脲类egfr/fgfr双重小分子抑制剂的化学结构如下：

表1-1：y系列化合物的结构

作为优选，所述的化合物1-(3,5-二甲氧基苯基)-3-(6-((5-碘-2-甲氧基苯基)氨基)嘧啶-4-基)脲(y6)，化学结构如下：

作为优选，所述的化合物1-(3,5-二甲氧基苯基)-3-(6-((2-甲氧基-5-(三氟甲基)苯基)氨基)嘧啶-4-基)脲(y13)，化学结构如下：

本发明还通了一种制备1-(3,5-二甲氧基苯基)-3-(6-(取代苯胺基)嘧啶-4-基)脲类egfr/fgfr双重小分子抑制剂，包括

第一步中间产物的合成：

步骤一：取一干燥的三口反应瓶，放入磁石。加入4-氨基-6-氯嘧啶(1eq)，ki(0.5eq)，并用的无水乙醇(35ml)溶解。在磁力搅拌器上，搅拌加热10min后，加入三氟乙酸(200ml)。活化。大约1h后，加入无水乙醇(15ml)溶解的取代苯胺(0.8eq)反应。注意，要以滴加的方式加进去，以达到长时过量反应的效果，滴加时间控制在1h左右。

步骤二：用tlc法，检测反应进程和反应效果。一般是反应36h后，反应几乎完全。反应完全后，先旋干溶剂无水乙醇，然后加入一定量的乙酸乙酯溶解。先用适量的20％的碳酸氢钠溶液除酸，后再加入一定量的50％的氯化钠溶液萃取分层，收集有机层并旋干至剩一定量，加入无水硫酸钠适量，除水过夜。

步骤三：抽滤，制砂，称取原料总和15到20倍的柱层硅胶粉装柱，过柱收集产物点。一般先是用石油醚:乙酸乙酯＝2:1过出第一个点(苯胺类点)，石油醚:乙酸乙酯＝1:1过出第二个点(嘧啶类点)，乙酸乙酯或甲醇冲出产物点。收集旋干产物点，放烘箱干燥，打质谱及核磁，验证。

本发明还提供了一种制备1-(3,5-二甲氧基苯基)-3-(6-(取代苯胺基)嘧啶-4-基)脲类egfr/fgfr双重小分子抑制剂，包括：第二步中间产物的合成：

步骤一：取一干燥的三口反应瓶，加入磁石。称取三光气(0.5eq)，并用二氯甲烷(20ml)溶解，超声使其充分。于0℃下，缓慢滴加二氯甲烷(10ml)溶解的3,5-二甲氧基苯胺(1eq)，每一分钟一滴，滴加时间控制在0.5h左右。滴毕，记得加2～3滴的三乙胺。加热回流反应3～6h,反应一般会完全。减压浓缩至干，剩余物用乙酸乙酯溶解，依次用10％的硫酸氢钾溶液除碱、20％的碳酸氢钠溶液除酸和50％的氯化钠溶液洗涤除无机相，收集有机相并旋干，经无水硫酸钠除水干燥过夜后，抽滤，制砂。

步骤二：制砂，装柱，过出3,5-二甲氧基苯胺后，分离提纯异氰酸酯。送去打质谱和核磁，验证。

本发明还提供了一种制备1-(3,5-二甲氧基苯基)-3-(6-(取代苯胺基)嘧啶-4-基)脲类egfr/fgfr双重小分子抑制剂，其特征在于：第三步目标产物的合成：

步骤一：取一干燥的三口反应瓶，加入磁石。称取的嘧啶苯胺(1eq)，异氰酸酯(1.2eq)，并用甲苯(10ml)溶解，于70～80℃加热回流反应8～10h，基本反应完全，tlc检测。冷却至室温，滤饼用甲苯洗涤2～3次，刮下后用乙酸乙酯溶解，20％的碳酸氢钠溶液洗涤除酸，再加入50％的氯化钠溶液萃取分层。收集并旋干有机层。

步骤二：点板检测纯度，送去打质谱及核磁，验证。

本发明的1-(3,5-二甲氧基苯基)-3-(6-(取代苯胺基)嘧啶-4-基)脲类衍生物可以用于肿瘤的治疗。

本发明的1-(3,5-二甲氧基苯基)-3-(6-(取代苯胺基)嘧啶-4-基)脲类衍生物表现出一定的抗肿瘤活性。根据抗肿瘤活性测试结果，化合物y6和y13对五个非小细胞肺癌细胞系，都表现出了一定的抑制活性；其中，相对较好的是化合物y13。化合物y13作用于5个癌细胞的ic50值分别为15.06±1.75μm，6.22±0.91μm，4.45±0.63μm，7.35±1.01μm，14.57±1.65μm。结果显示，化合物y13是一个比较有效的egfr/fgfr抑制剂。

附图说明

图1为fgfr1的激活介导egfr-tkis获得性耐药的产生原理示意图。

图2为实施例2得到的抗肿瘤细胞试验的结果。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步详细描述。

实施例1化合物的合成

1.1化合物的具体合成路线如下所示：

1.2合成步骤

a.第一步中间产物的合成：

步骤一：取一干燥的三口反应瓶，放入磁石。加入4-氨基-6-氯嘧啶(1eq)，ki(0.5eq)，并用的无水乙醇(35ml)溶解。在磁力搅拌器上，搅拌加热10min后，加入三氟乙酸(200ml)。活化。大约1h后，加入无水乙醇(15ml)溶解的取代苯胺(0.8eq)反应。注意，要以滴加的方式加进去，以达到长时过量反应的效果，滴加时间控制在1h左右。

步骤二：用tlc法，检测反应进程和反应效果。一般是反应36h后，反应几乎完全。反应完全后，先旋干溶剂无水乙醇，然后加入一定量的乙酸乙酯溶解。先用适量的20％的碳酸氢钠溶液除酸，后再加入一定量的50％的氯化钠溶液萃取分层，收集有机层并旋干至剩一定量，加入无水硫酸钠适量，除水过夜。

步骤三：抽滤，制砂，称取原料总和15到20倍的柱层硅胶粉装柱，过柱收集产物点。一般先是用石油醚:乙酸乙酯＝2:1过出第一个点(苯胺类点)，石油醚:乙酸乙酯＝1:1过出第二个点(嘧啶类点)，乙酸乙酯或甲醇冲出产物点。收集旋干产物点，放烘箱干燥，打质谱及核磁，验证。

b.第二步中间产物的合成：

步骤一：取一干燥的三口反应瓶，加入磁石。称取三光气(0.5eq)，并用二氯甲烷(20ml)溶解，超声使其充分。于0℃下，缓慢滴加二氯甲烷(10ml)溶解的3,5-二甲氧基苯胺(1eq)，每一分钟一滴，滴加时间控制在0.5h左右。滴毕，记得加2～3滴的三乙胺。加热回流反应3～6h,反应一般会完全。减压浓缩至干，剩余物用乙酸乙酯溶解，依次用10％的硫酸氢钾溶液除碱、20％的碳酸氢钠溶液除酸和50％的氯化钠溶液洗涤除无机相，收集有机相并旋干，经无水硫酸钠除水干燥过夜后，抽滤，制砂。

步骤二：制砂，装柱，过出3,5-二甲氧基苯胺后，分离提纯异氰酸酯。送去打质谱和核磁，验证。

c.第三步目标产物的合成：

步骤一：取一干燥的三口反应瓶，加入磁石。称取的嘧啶苯胺(1eq)，异氰酸酯(1.2eq)，并用甲苯(10ml)溶解，于70～80℃加热回流反应8～10h，基本反应完全，tlc检测。冷却至室温，滤饼用甲苯洗涤2～3次，刮下后用乙酸乙酯溶解，20％的碳酸氢钠溶液洗涤除酸，再加入50％的氯化钠溶液萃取分层。收集并旋干有机层。

步骤二：点板检测纯度，送去打质谱及核磁，验证。

1.3实验结果

合成的所有目标化合物结构如上表1-1所示；合成的包括活性化合物在内的部分目标化合物的ms、¹hnmr和¹³cnmr等理化数据如下：

1-(3,5-dimethoxyphenyl)-3-(6-((3,5-dimethoxyphenyl)amino)pyrimidin-4-yl)urea(y1).

whitepowder,yield:58.3％；mp/℃:192.6～194.1；esi-ms[m+na]⁺:425.92；¹hnmr(600mhz,cdcl3-d6)δ(ppm):8.360(s,1h,-nh-),7.049(s,1h,2-pyrimidine-h),6.757(s,1h,ar-h),6.597(m,3h,ar-h),6.240(s,2h,ar-h),6.222(s,1h,5-pyrimidine-h),3.809(s,6h,-och3),3.788(s,6h,-och3).¹³cnmr(150mhz,dmso-d6)δ(ppm):162.528,161.995,161.788,159.417,158.654,155.302,154.253,144.014,143.067,112.977,111.051,109.206,91.311,56.700,55.987.

1-(6-((5-bromo-2-methoxyphenyl)amino)pyrimidin-4-yl)-3-(3,5-dimethoxyphenyl)urea(y3).

yellowpowder,yield:45.2％；mp/℃:203.8～205.7；esi-ms[m+na]+:474.13；¹hnmr(600mhz,dmso-d6)δ(ppm):9.857(s,1h,-nh-),9.202(s,1h,-nh-),8.856(s,1h,-nh-),8.319(s,1h,2-pyrimidine-h),8.124(s,1h,ar-h),7.172(s,1h,ar-h),7.118(s,1h,ar-h),6.978(d,j＝6hz,1h,ar-h),6.963(d,j＝6hz,1h,ar-h),6.665(s,1h,ar-h),6.160(s,1h,5-pyrimidine-h),3.782(s,3h,-och3),3.686(s,6h,-och3).¹³cnmr(150mhz,dmso-d6)δ(ppm):161.245,160.681,156.998,151.588,140.516,130.022,125.806,124.627,113.239,1111.424,96.963,94.778,91.146,55.957,55.093.

1-(3,5-dimethoxyphenyl)-3-(6-((5-iodo-2-methoxyphenyl)amino)pyrimidin-4-yl)urea(y6).

whitepowder,yield:38.4％；mp/℃:198.3～199.4；esi-ms[m+na]+:522.14；¹hnmr(600mhz,cdcl3-d6)δ(ppm):8.451(s,1h,-nh-),8.362(s,1h,2-pyrimidine-h),7.449(d,j＝7.8hz,1h,ar-h),7.436(d,j＝7.8hz,1h,ar-h),6.769(d,j＝1.8hz,1h,ar-h),6.766(d,j＝1.8hz,1h,ar-h),6.714(s,1h,ar-h),6.519(s,1h,ar-h),6.242(s,1h,5-pyrimidine-h),3.888(s,3h,-och3),3.791(s,6h,-och3).¹³cnmr(150mhz,dmso-d6)δ(ppm):161.033,160.663,157.295,151.683,140.501,130.582,111.586,96.935,94.741,85.607,56.569,55.088,55.032.

1-(3,5-dimethoxyphenyl)-3-(6-((3-fluoro-5-methylphenyl)amino)pyrimidin-4-yl)urea(y10).

whitepowder,yield:50.4％；mp/℃:225.6～226.2；esi-ms[m+na]+:397.88；¹hnmr(600mhz,cdcl3-d6)δ(ppm):8.188(s,1h,-nh-),7.177(s,2h,2-pyrimidine-h+ar-h),7.083(s,1h,ar-h),7.014(s,1h,ar-h),6.929(s,1h,ar-h),6.594(s,1h,ar-h),6.231(s,1h,ar-h),5.830(s,1h,5-pyrimidine-h),3.776(s,6h,-och3),2.276(s,3h,-ch3).¹³cnmr(150mhz,dmso-d6)δ(ppm):160.933,160.668,157.365,157.259,151.650,140.463,115.521,96.900,94.801,91.090,55.074,55.023,21.137.

1-(3,5-dimethoxyphenyl)-3-(6-((2-methoxy-5-(trifluoromethyl)phenyl)amino)pyrimidin-4-yl)urea(y13).

whitepowder,yield:39.3％；mp/℃:231.7～232.6；esi-ms[m+na]+:464.20；¹hnmr(600mhz,cdcl3-d6)δ(ppm):8.502(s,1h,-nh-),7.373(s,1h,2-pyrimidine-h),7.224(s,1h,ar-h),7.005(d,j＝8.4hz,1h,ar-h),6.991(d,j＝8.4hz,1h,ar-h),6.857(s,1h,ar-h),6.793(s,1h,ar-h),6.584(s,1h,ar-h),6.248(s,1h,5-pyrimidine-h),3.975(s,3h,-och3),3.860(s,6h,-och3).¹³cnmr(150mhz,dmso-d6)δ(ppm):160.854,160.670,160.605,159.993,157.317,151.645,142.364,141.283,140.436,108.320,96.904,96.560,94.818,93.982,91.401,55.500,55.066,55.018.

1-(3,5-dimethoxyphenyl)-3-(6-((3-ethylphenyl)amino)pyrimidin-4-yl)urea(y15).

whitepowder,yield:51.0％；mp/℃:209.2～209.9；esi-ms[m+na]+:393.79；¹hnmr(600mhz,cdcl3-d6)δ(ppm):8.383(s,1h,-nh-),7.937(s,1h,2-pyrimidine-h),7.855(d,j＝2.4hz,1h,ar-h),7.851(d,j＝2.4hz,1h,ar-h),6.818(m,3h,ar-h),6.557(m,3h,5-pyrimidine-h+ar-h),3.845(s,6h,-och3),2.671(m,2h,-ch2ch3),1.254(t,j＝7.2hz,3h,-ch3).¹³cnmr(150mhz,dmso-d6)δ(ppm):161.205,160.674,157.325,157.233,151.684,144.261,140.503,139.953,128.582,121.843,119.373,117.534,96.948,96.593,94.785,90.083,55.077,55.030,28.262,15.473.

1-(6-((4-(tert-butyl)phenyl)amino)pyrimidin-4-yl)-3-(3,5-dimethoxyphenyl)urea(y18).

whitepowder,yield:50.7％；mp/℃:212.3～213.1；esi-ms[m+na]+:422.21；¹hnmr(600mhz,cdcl3-d6)δ(ppm):8.335(s,1h,-nh-),7.364(s,1h,2-pyrimidine-h),7.311(s,1h,ar-h),7.185(s,1h,ar-h),7.006(s,1h,ar-h),6.764(d,j＝1.8hz,1h,ar-h),6.761(d,j＝1.8hz,1h,ar-h),6.604(d,j＝1.8hz,1h,ar-h),6.601(d,j＝1.8hz,1h,ar-h),6.231(s,1h,5-pyrimidine-h),3.771(s,6h,-och3),1.351(s,9h,-ch3).¹³cnmr(150mhz,dmso-d6)δ(ppm):160.615,152.238,141.290,96.602,94.948,94.001,56.252,55.026,31.206.

本发明所合成目标化合物的性状及其溶解性如下：

目标化合物产率普遍较高。化合物y1-2，y6-7，y9-11，y13-15，y17-19，均为白色固体；化合物y3为黄色固体；化合物y4，y8和y16，为灰褐色固体；化合物y5，y12和y20，则均为黑色固体。化合物易溶于乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷、dmso、dmf；微溶于石油醚、甲醇、乙醇；不溶于甲苯。

本发明合成的目标化合物，在ms谱图中均显示了[m+1]⁺峰，且信号较强，部分化合物存在着同位素峰。¹h-nmr谱图结果显示，所有目标化合物的氢信号，以及其化学位移，在图谱上都能清晰的看出。以dmso-d6为溶剂时，核磁氢谱数据显示完全，即化合物氢的理论个数，与核磁氢谱图上氢的个数相吻合；而以cdcl3-d6为溶剂时，大多数的目标化合物的核磁氢谱数据显示不完全，核磁氢谱图上通常没有脲基胺上的两个氢。¹³c-nmr谱图结果显示，目标化合物碳峰位移及数目基本上与理论数据相符。

实施例2化合物抗肿瘤细胞活性

2.1mtt法测试化合物抗肿瘤活性

本实验采用mtt法。所选的正常肺细胞为beas-2b细胞；所选的五个非小细胞肺癌细胞则包括肺腺癌细胞a549(wtegfr)、肺腺癌细胞pc-9(egfrd746-750)、肺鳞癌细胞h520(fgframplification)、大细胞肺癌h1581(fgframplification)和肺鳞癌细胞h226(fgframplification/overexpressedegfr)。选取对数生长的上述细胞，将这些细胞消化，收集，并用细胞计数板进行计数。接着，将记过数的细胞，稀释至合适的浓度(5*10^4个/ml～8*10^4个/ml)，按每孔100μl将稀释的细胞悬液用排枪加入到96孔板中进行培养，并记得在同一块孔板上设置只含培养基的空白对照孔；铺板过夜培养后，更换为新鲜培养基，每孔加入一系列浓度梯度稀释的受试目标化合物和阳性药物bgj398和g，等药物作用72小时后，检测细胞的存活率；将20μl的mtt检测液，加入到96孔板的每个孔中，后将96孔板放置在37℃培养箱中，孵育四小时。去上清，并加入150μl的dmso，溶解mtt甲臢沉淀。最后以酶标仪检测紫外吸收波长在490nm处的每孔的吸光值，并进行换算，计算出相应的细胞存活率，抑制率或ic50值等。本实验需进行至少三次重复实验，减小实验误差。

2.2实验结果

得到的试验结果如图2所示，如图2a所示，在10μm的浓度下，所有受试目标化合物，对应的细胞存活率均在95％以上；而两药联用的阳性对照组，对应的细胞存活率较低，为75％。图2b显示的是受试化合物对a549细胞的抑制效果，其中抑制率超过50％的化合物为y3～y11、y13～y14、y16～y17、y19；图2c所示为受试化合物对pc-9细胞的抑制效果，其中抑制率超过50％的为化合物y1～y4、y6～y20；受试化合物对h520细胞的抑制效果，如图2d所示，化合物y6和y13的抑制率都超过50％；受试化合物对h1581细胞的抑制效果，如图2e所示，化合物y6～y7、y13～y14、y19的抑制率都超过50％；而对h226细胞的抑制效果，则如图2f所示，化合物y6、y13、y14、y16、y19的抑制率都超过50％。

实施例3化合物y6和y13对五种肿瘤细胞的ic50实验

3.1mtt法测试化合物的ic50值

根据所有目标化合物对正常肺细胞的毒性作用结果，以及对五种nsclc细胞系的抑制作用结果，我们得到了对五种nsclc细胞系都起抑制效果的化合物y6和y13。我们选择这两个化合物，进一步地去做ic50实验。先为这两个化合物都设定六种浓度(20μm，10μm，1.0μm，0.50μm，0.10μm和0.01μm)。然后，分别用不同浓度的这两个化合物处理五种非小细胞肺癌细胞系，包括a549细胞、pc-9细胞、h520细胞、h1581细胞和h226细胞。获得光密度(od)值，计算抑制率，并通过graphpadprism5软件计算不同化合物的ic50值。

3.2实验结果

对a549细胞、pc-9细胞、h520细胞、h1581细胞和h226细胞这五个癌细胞的ic50值，化合物y6测得的结果分别为>20μm、3.54±0.85μm、9.87±1.26μm、8.86±1.14μm和19.43±2.23μm；而化合物y13所测得结果则分别为15.06±1.75μm、6.22±0.91μm、4.45±0.63μm、7.35±1.01μm和14.57±1.65μm。y13是该系列中活性最好的化合物。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。