一种原位涂层修饰细菌纤维素水凝胶及其制备方法与流程

本发明属于生物材料领域，具体涉及一种原位涂层修饰细菌纤维素水凝胶的方法。

背景技术

细菌纤维素(bc)是指由木醋杆菌等微生物合成的纤维素，其水凝胶具有精细的网络结构、较高的机械强度、高含水率、良好的生物相容性和生物降解性等特点。因此作为一种优良的基体材料广泛应用于构建生物医学、光电等功能性材料与器件，其中，如何对细菌纤维素水凝胶进行功能化修饰是关键。

目前细菌纤维素水凝胶的表面功能化修饰主要有物理掺杂和化学修饰两种方法。例如石志军等通过物理掺杂的方法使聚苯胺渗透进入细菌纤维素水凝胶，获得具有导电性的细菌纤维素复合水凝胶(zhijunshi,etal.rscadvances，2012,2,1040-1046)；胡伟立等则首先将苯胺单体修饰到细菌纤维素水凝胶表面，再通过氧化聚合苯胺制备了表面导电的细菌纤维素水凝胶(胡伟立.细菌纤维素表面修饰及功能化[d].东华大学,2013.)；此外对细菌纤维素水凝胶表面进行乙酰化、酯化、醚化等也是常用的化学修饰手段。尽管通过物理掺杂和化学修饰可以获得多种细菌纤维素功能材料，但往往过程繁琐，需要使用有机溶剂和专业制备设备，或涉及复杂的化学过程，此外，这些修饰必须在细菌纤维素合成、取出、纯化之后进行，效率较低。

技术实现要素：

本发明针对现有细菌纤维素水凝胶功能化修饰方法过程繁琐、耗时耗能、不易控制等问题，提供了一种原位涂层修饰细菌纤维素水凝胶的方法。

本发明提供了一种原位涂层修饰细菌纤维素水凝胶，所述原位涂层修饰细菌纤维素水凝胶含有细菌纤维素层和修饰在该细菌纤维素层至少一个表面的修饰层，所述修饰层为水不溶性生物大分子层；所述水不溶性生物大分子层通过物理吸附和氢键相互作用力与细菌纤维素层连接。

优选地，所述原位涂层修饰细菌纤维素水凝胶的厚度为6mm-10mm；所述修饰层的厚度为1mm-2mm。

按照本发明的另一方面，提供了一种原位涂层单面修饰细菌纤维素水凝胶的方法，含有以下步骤：

(1)向醋酸菌属细菌的培养液中加入水不溶性生物大分子，得到培养液a；或者向土壤杆菌属细菌的培养液中加入水不溶性生物大分子，得到培养液b；或者向根瘤菌属细菌的培养液中加入水不溶性生物大分子，得到培养液c；或者向八叠球菌属细菌的培养液中加入水不溶性生物大分子，得到培养液d；

(2)将醋酸菌属细菌接种于步骤(1)所述的培养液a中，或者将土壤杆菌属细菌接种于步骤(1)所述的培养液b中，或者将根瘤菌属细菌接种于步骤(1)所述的培养液c中，或者将八叠球菌属细菌接种于步骤(1)所述的培养液d中；在有氧的条件下培养5天-15天，得到单面修饰生物大分子的细菌纤维素水凝胶。

优选地，步骤(1)所述水不溶性生物大分子为水不溶性多糖或水不溶性蛋白质。

优选地，所述水不溶性多糖为未经处理的甲壳素、未经处理的壳聚糖、未经处理的纤维素和未经处理的淀粉中的至少一种，或为未经处理的甲壳素、未经处理的壳聚糖、未经处理的纤维素和未经处理的淀粉中的至少一种处理后得到的微球、微纤维或片层结构；所述水不溶性蛋白质为未经处理的胶原、未经处理的角蛋白和未经处理的弹性蛋白中的至少一种，或为未经处理的胶原、未经处理的角蛋白和未经处理的弹性蛋白中的至少一种处理后得到的微球、微纤维或片层结构；

优选地，所述微球或微纤维的直径为0.2μm-2μm，所述片层结构的厚度为0.2μm-1μm。

优选地，步骤(1)所述培养液a、培养液b、培养液c或培养液d中水不溶性生物大分子的浓度为5mg/ml-30mg/ml；步骤(2)所述的醋酸菌属细菌为木醋杆菌。

按照本发明的另一方面，提供了一种原位涂层双面修饰细菌纤维素水凝胶的方法，其特征在于，含有以下步骤：

(1)向醋酸菌属细菌的培养液中加入水不溶于的生物大分子，得到培养液a；或者向土壤杆菌属细菌的培养液中加入水不溶于的生物大分子，得到培养液b；或者向根瘤菌属细菌的培养液中加入水不溶于的生物大分子，得到培养液c；或者向八叠球菌属细菌的培养液中加入水不溶于的生物大分子，得到培养液d；

(2)将醋酸菌属细菌接种于步骤(1)所述的培养液a中，或者将土壤杆菌属细菌接种于步骤(1)所述的培养液b中，或者将根瘤菌属细菌接种于步骤(1)所述的培养液c中，或者将八叠球菌属细菌接种于步骤(1)所述的培养液d中；在有氧的条件下培养5天-15天，得到单面修饰生物大分子的细菌纤维素水凝胶；

(3)将步骤(2)所述单面修饰生物大分子的细菌纤维素水凝胶从培养液中取出，将修饰有生物大分子的一面由朝下翻转为朝上，重新置于所述单面修饰生物大分子的细菌纤维素水凝胶所在的培养液的气液界面上，将培养的细菌继续培养5天-10天，得到双面修饰生物大分子的细菌纤维素水凝胶。

优选地，步骤(1)所述水不溶性生物大分子为水不溶性多糖或水不溶性蛋白质。

优选地，所述水不溶性多糖为未经处理的甲壳素、未经处理的壳聚糖、未经处理的纤维素和未经处理的淀粉中的至少一种，或为未经处理的甲壳素、未经处理的壳聚糖、未经处理的纤维素和未经处理的淀粉中的至少一种处理后得到的微球、微纤维或片层结构；所述水不溶性蛋白质为未经处理的胶原、未经处理的角蛋白和未经处理的弹性蛋白中的至少一种，或为未经处理的胶原、未经处理的角蛋白和未经处理的弹性蛋白中的至少一种处理后得到的微球、微纤维或片层结构；

优选地，所述微球的直径为0.2mm-2mm，所述片层结构的厚度为0.2mm-1mm。

优选地，步骤(1)所述培养液a、培养液b、培养液c或培养液d中水不溶性生物大分子的浓度为5mg/ml-30mg/ml；步骤(2)所述的醋酸菌属细菌为木醋杆菌。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明公开一种简便有效的细菌纤维素水凝胶表面修饰方法，可在细菌纤维素水凝胶合成过程中原位对其表面进行修饰，一步实现细菌纤维素水凝胶的合成与表面修饰，无需使用有机溶剂和其他试剂，也无需专业制备设备，整个过程节能环保，简便高效。

(2)本发明通过在培养液中加入水不溶性的生物大分子即可实现细菌纤维素水凝胶的表面涂层修饰，其机理是产细菌纤维素的细菌的趋氧运动引起的液流将水不溶性生物大分子推送至细菌纤维素水凝胶的下表面，并通过物理吸附和氢键作用涂层于表面。这一过程不需要使用有机溶剂和其他试剂，也不涉及复杂化学过程和专业制备设备，整个过程简便，高效，节能，环保。

(3)本发明可根据应用需要选择不同性质和功能的修饰成分，构建具有不同表面性质和功能的细菌纤维素水凝胶材料。

附图说明

图1为壳聚糖原位涂层修饰的细菌纤维素水凝胶的照片；其中图1(a)为壳聚糖层朝上的壳聚糖单面修饰的细菌纤维素水凝胶，图1(b)为细菌纤维素层朝上的壳聚糖单面修饰的细菌纤维素水凝胶，图1(c)为壳聚糖双面修饰的细菌纤维素水凝胶。

图2为壳聚糖原位涂层修饰的细菌纤维素水凝胶的x射线衍射图谱。

图3为本发明制备高分子原位涂层修饰细菌纤维素水凝胶的流程图。

图4为淀粉单面涂层修饰的细菌纤维素水凝胶的扫描电镜图；其中图4(a)为未修饰的细菌纤维素表面，图4(b)所示为淀粉涂层修饰的细菌纤维素表面。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1：壳聚糖原位涂层修饰细菌纤维素水凝胶的制备

制备过程如图3所示，含有以下步骤：

(1)配制标准hs培养液：分别称取4g葡糖糖、1g酵母粉，0.54g磷酸氢二钠、0.23g柠檬酸溶于超纯水，配制成200ml标准hs培养液；

(2)往标准hs培养液中加入2g壳聚糖(分子量约10万)，充分搅拌，待分散混匀后，采用高压灭菌法灭菌，壳聚糖变成棕褐色。

(3)将5ml木醋杆菌(美国标准菌库atcc53582)菌液接种于步骤(1)所述含有壳聚糖的标准hs培养液，于30℃恒温培养箱中培养10天，得到壳聚糖涂层修饰的细菌纤维素水凝胶，显示为两层结构，其中上层(即气液界面)为白色细菌纤维素，下层为棕褐色壳聚糖。所述木醋杆菌的培养可以在各种型号的三角瓶、孔板、培养皿以及自制的培养器皿中进行。

(4)将步骤(2)所述壳聚糖修饰的细菌纤维素水凝胶膜取出，翻转上下表面，使白色细菌纤维素层朝下，置于培养液气液界面继续培养5天，可见在白色细菌纤维素层表面逐渐形成一层壳聚糖，获得双面均被壳聚糖涂层修饰的细菌纤维素水凝胶，该水凝胶显示为三层结构，中间层为白色细菌纤维素层，上下层均为棕褐色壳聚糖。

(5)将步骤(2)与步骤(3)分别得到的壳聚糖单面修饰与双面修饰的细菌纤维素水凝胶膜取出，洗净，用滤纸吸去表面多余水分。

如图1所示，图1为壳聚糖原位涂层修饰的细菌纤维素水凝胶的照片；其中图1(a)为壳聚糖层朝上的壳聚糖单面修饰的细菌纤维素水凝胶，图1(b)为细菌纤维素层朝上的壳聚糖单面修饰的细菌纤维素水凝胶，图1(c)为壳聚糖双面修饰的细菌纤维素水凝胶，中间为细菌纤维素层，两侧为壳聚糖层。该原位涂层修饰细菌纤维素水凝胶含有细菌纤维素层和修饰在该细菌纤维素层至少一个表面的修饰层，所述修饰层为水不溶性生物大分子层；所述水不溶性生物大分子层通过物理吸附和氢键相互作用力与细菌纤维素层连接。所述原位涂层修饰的细菌纤维素水凝胶的厚度为6mm-10mm；所述修饰层的厚度为1mm-2mm。

图2为壳聚糖原位涂层修饰的细菌纤维素水凝胶的x射线衍射图谱。其中bc为细菌纤维素；cs为壳聚糖；bc/1％cs，bc/2％cs，bc/3％cs分别表示壳聚糖加入量与培养液的质量体积比分别为0.01g/ml、0.02g/ml、0.03g/ml时，壳聚糖原位涂层修饰的细菌纤维素水凝胶。从x射线衍射图谱中可见明显的壳聚糖结晶峰信号，而细菌纤维素的结晶峰信号减弱，反映了壳聚糖成功修饰到细菌纤维素水凝胶表面。

实施例2：壳聚糖原位涂层修饰细菌纤维素水凝胶的制备

以实施例1为基础，不同点为：将步骤(2)中壳聚糖的量改为4g，将步骤(3)中的培养时间改为15天，其余均与实施例1相同。

实施例3：壳聚糖原位涂层修饰细菌纤维素水凝胶的制备

以实施例1为基础，不同点为：将步骤(2)中壳聚糖的量改为6g，将步骤(3)中的培养时间改为5天，其余均与实施例1相同。

实施例4：壳聚糖微球原位涂层修饰细菌纤维素水凝胶的制备

以实施例1为基础，不同点为：将步骤(2)中壳聚糖改为壳聚糖微球，其余均与实施例1相同。

壳聚糖微球的制备方法为：将壳聚糖(分子量约10万)溶解于10mg/ml醋酸溶液，利用微量注射泵通过4.5号针头将壳聚糖溶液逐滴加入到10mg/ml氢氧化钠溶液中，得到直径0.8～1.5mm的壳聚糖微球。

实施例5：胶原原位涂层修饰细菌纤维素水凝胶的制备

以实施例1为基础，不同点为：将步骤(2)中壳聚糖改为胶原，其余均与实施例1相同。

实施例6：淀粉原位涂层修饰细菌纤维素水凝胶的制备

以实施例1为基础，不同点为：将步骤(2)中壳聚糖改为淀粉，其余均与实施例1相同。

通过扫描电镜观察淀粉单面涂层修饰的细菌纤维素水凝胶，如图4所示：图4(a)为未修饰的细菌纤维素表面，可见细菌纤维素纳米纤维组成3d多孔的网络结构；图4(b)为淀粉涂层修饰的细菌纤维素表面，可见细菌纤维素的纳米纤维包埋于另一层材料中，3d多孔网络结构消失。由此可知，通过上述方法淀粉成功涂层修饰于细菌纤维素水凝胶表面。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。