一种基于植物病毒载体的高效、快速诱导单子叶植物开花的方法与流程

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于植物病毒载体的高效、快速诱导单子叶植物开花的方法。

背景技术：

病毒诱导开花以rna或dna病毒为载体表达开花时间基因，如ft，可诱导植物开花。近年来，这种方法在加速双子叶作物和木本果树育种中的实际应用引起了广泛的兴趣。第一个vif是通过葫芦西黄花叶病毒（zymv）在中国南瓜（cucurbitamoschata）中表达拟南芥ft（atft）蛋白从而导致早期开花。随后，马铃薯x病毒（pvx）为基础的vif也被开发，通过表达拟南芥ft（atft）蛋白或mrna，诱导短日（sd）烟草（marylandmammoth，mm）在非开花条件长日（ld）条件下开花。后来，苹果潜球状病毒（alsv）、柑桔叶枯病病毒（clbv）和棉花叶皱缩病毒（clcrv）已成功地在大豆、苹果、梨、龙胆、荔枝、棉花和柑橘等植物上诱导开花。最近，我们进一步开发了基于pvx病毒载体的vif方法来评估ft蛋白功能的方法，包括研究单个氨基酸突变对atft蛋白的花诱导功能的影响，各种多肽标签对atft活性的影响，以及单子叶和双子叶ft和ft同源基因在非诱导条件下诱导mm烟草开花的功能。这些工作表明，植物病毒为基础的vif能有效的研究开花蛋白的功能，加快农业上的分子育种。

迄今为止，已经在双子叶植物中开发了几个vif系统。与此相反，相关的vif在单子叶植物中还没有任何报道，包括经济上重要的谷类作物等。然而，大麦条纹花叶病毒（bsmv）已有报道能在大麦和小麦中诱导基于病毒诱导的基因沉默（vigs）从而研究基因功能。bmv在水稻、大麦和玉米，bamboomosaicvirus在短柄草中，ricetungrobacilliformvirus在水稻中和cucumbermosaicvirus在玉米中均有报道能引起病毒诱导的基因沉默。最近，fomv也能在大麦、小麦、高粱、狗尾草、绿狐尾和甜玉米中引起vigs。此外，也有研究表明，bsmv和fomv能在双子叶植物和单子叶植物中成功过表达内源和外源蛋白，表明这些病毒具有在单子叶植物中诱导植物开花的前景。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种基于植物病毒载体的高效、快速诱导单子叶植物开花的方法的技术方案，通过该方法能够将原本需要3-4个月的开花的单子叶植物的开花、抽穗时间缩短至5-7周内。

本发明具体采用以下技术方案实现：

所述的一种基于植物病毒载体的高效、快速诱导单子叶植物开花的方法，其特征在于包括以下步骤：

1）将目标基因拟南芥atft基因、水稻hd3a基因、番茄sft基因或烟草ntft4基因克隆至fomv载体，构建fomv-目标基因载体；

2）将上述fomv-目标基因载体转化农杆菌菌株gv3101，经农杆菌渗滤后，使目标基因在受体单子叶植物中表达，促使单子叶植物在渗滤后5-7周内开花。

所述的方法，其特征在于所述的单子叶植物为糜子和小麦。

所述的拟南芥atft基因、水稻hd3a基因、番茄sft基因或烟草ntft4基因在调节单子叶植物开花中的应用，其特征在于含有拟南芥atft基因、水稻hd3a基因、番茄sft基因或烟草ntft4基因的fomv表达载体侵染单子叶植物后，能够诱导单子叶植物早花。

所述的应用，其特征在于所述的单子叶植物为糜子和小麦。

所述的含有拟南芥atft基因、水稻hd3a基因、番茄sft基因或烟草ntft4基因的fomv表达载体在诱导单子叶植物早花中的应用。

本发明一方面通过建立了基于植物病毒载体的高效、快速诱导单子叶植物开花的方法，通过该方法能够将原本需要3-4个月的开花的单子叶植物的开花、抽穗时间缩短至5-7周内；本发明另一方面，开发了拟南芥atft基因、水稻hd3a基因、番茄sft基因或烟草ntft4基因在调节单子叶植物开花中的新用途。

附图说明

图1为本发明载体构建模式图；

图2为fomv侵染糜子pm；

图3为fomv/atft接种糜子pm在长光照条件下的开花表型；

图4为fomv/hd3a接种糜子pm在长光照条件下的开花表型；

图5为fomv/sft接种糜子pm在长光照条件下的开花表型；

图6为fomv/ntft4接种糜子pm在长光照条件下的开花表型；

图7为fomv侵染小麦；

图8为fomv/hd3a接种小麦在长光照条件下的开花表型。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

任何在本发明基本精神上地改进或替代，仍属于本发明权利要求书所要求保护地范围。

下述实施例中地实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用到地试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂。

实施例1：利用fomv病毒载体高效、快速诱导糜子开花和抽穗

1、以本实验室保存的pvx/atft,pvx/hd3a,pvx/sft,andpvx/ntft4质粒为模板，根据ncbi数据库上登录的这些基因的序列设计引物，并委托上海英俊公司合成，引物序列信息见表1：

表1

2、在pcr反应中，以pvx/atft，pvx/hd3a，pvx/sft和pvx/ntft4质粒为模板，以表1为引物。取一个0.5ml的pcr薄壁管，逐一加入下列试剂：模板dna2μl，10mmol/ldntp混合物0.5μl，20μmol/l上下游引物各0.5μl，5×反应缓冲液4μl,2.5u/μlprimerstarhsdna聚合酶0.1μl，加双蒸水至最终体积20μl；pcr扩增反应参数设置：94℃预变性5min后开始以下循环反应：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延40s，进行25次循环；循环结束后72℃继续延伸10min，再16℃将反应液温度下降；反应完毕后，将pcr产物进行电泳检查，并对正确的片段切胶保留。

3、利用pcr产物纯化回收试剂盒，根据制造商提供的方法，回收得到atft,hd3a,sft和ntft4的pcr产物。并使用bspeⅰ与salⅰ进行双酶切，然后连接到同样使用bspeⅰ与salⅰ双酶切的fomv载体中，随后通过转化，阳性克隆鉴定以及测序，得到fomv/atft,fomv/hd3a,fomv/sftandfomv/ntft4载体，如图1所示。

4、农杆菌转化

1)取出农杆菌gv3101的感受态细胞置于冰上解冻至融融状态备用；

2)吸取1.5μlfomv/atft,fomv/hd3a,fomv/sft或fomv/ntft4质粒加入到75μl的感受态细胞中混合，放在冰上15min；

3)在等待的过程中，将点击仪的参数设置为电压240v，电容25μf，电阻200ω。再将加好质粒的感受态细胞转移到事先已预冷的电击杯中，将电击杯放入电击仪中，按下点击按钮后，过3s后，屏幕显示条曲线后即表明电击完成；

4)在电击结束后，吸取混合液转移至1.5mlep管中，再加250-300μl液体培养基（不含抗生素），28℃条件下250rpm培养3-4h；

5)取出ep管后，4800rpm离心2min，吸取100-200μl的上清液丢弃；

6)用移液枪将菌体吸打混匀后，取80-100μl菌液涂布在含有相应抗性的固体培养基上，最后倒置在28℃培养箱中培养48h；

7)挑取3-5个单克隆加入抗性lb液体培养基摇菌，进行双酶切和测序验证，若正确，将fomv/atft、fomv/hd3a、fomv/sft或fomv/ntft4的大肠杆菌和gv3101农杆菌保菌备用。

5、本氏烟的病毒接种

1）在每个转基因株系中，挑取大小适中、生长状态良好的6叶期植物，对其上端的2片舒展的系统嫩叶进行浸润。每个株系浸润8棵植物，每棵的接种量为300μl；

2）使用注射器的针头，在叶片的背面扎2个孔隙（分布在叶脉的两边），双手戴上橡胶手套，一个食指托住叶片，另一手轻轻推动注射器，使得fomv/atft、fomv/hd3a、fomv/sft或fomv/ntft4农杆菌菌液被注射到叶片中；

3）注射完成后，关灯过夜，防止叶片水分蒸发。

6、糜子pm的病毒接种

1)糜子pm在23℃、长日照（光照16h/d）的温室环境下生长，同样选取2-3叶期的糜子，一般选择2片正在扩大生长的新生叶进行接种；

2)在选好的叶片上均匀撒上薄薄的一层石英砂；

3)取一片接种成功的相应nb叶片，加入适量eb研磨，研磨均匀成液态；

4)用戴橡胶手套的双手食指进行接种，一个托着接种叶，一个在叶面上轻轻磨擦约5下，使病汁（含有fomv病毒的本氏烟病汁液）液渗透到烟草表皮中；

5)最后向整个植株上喷水雾让其自我修复。

7、接种后的pm在长光照条件下的开花表型观察

在接种7-14天，pm接种叶及部分新生叶出现褪绿病斑，如图2a-f所示。图2中：a，模拟接种的健康的糜子叶片；b-f，感染fomv（b）、fomv/atft（c）、fomv/hd3a（d）、fomv/sft（e）或fomv/ntft4（f）的糜子的病毒症状，照片分别在播种后4周（wass；a-f）。

在接种5-6周后，接种fomv/hd3a的植株开始接穗，在接种7周后，接种fomv/atft、fomv/sft和fomv/ntft4的植株也都开始接穗。基本接种后每7天详细观测记录1次植株病毒侵染症状，观察植株生长状况等。开花表型参见图3-6。其中图3中a-c、早花和早抽穗的表型，对照（a）或接种fomv（b）的糜子植株保持营养生长；在感染fomv/atft(c)的植物中，糜子出现早花和早抽穗的表型；照片在播种后11周（wass；a-c）拍摄，bar=3cm。图4中在感染fomv/hd3a的植物中，糜子出现早花和早抽穗的表型；照片在播种后11周（wass）拍摄，bar=3cm。图5中在感染fomv/sft的植物中，糜子出现早花和早抽穗的表型；照片在播种后11周拍摄，bar=3cm。图6中在感染fomv/ntft4的植物中，糜子出现早花和早抽穗的表型；照片在播种后11周（wass）拍摄，bar=3cm。

8、植物总rna的提取

利用tiangen公司的植物总rna提取试剂盒（rnapreppureplantkit）进行提取病毒的接种叶，操作步骤如下：

1）匀浆处理:取50-100mg的植物叶片，在液氮中速冻，放置于研钵中迅速研磨成粉末，加入450μlbufferrl（使用前请先检查是否已加入β-巯基乙醇，1mlbufferrl中加入10μlβ-巯基乙醇，现用现配），涡旋震荡混匀；

2）将所有的溶液转移至过滤柱cs上(过滤柱cs放在收集管中)，14000rpm离心5min，小心吸取收集管中的上清液至rnase-free的离心管中，吸头尽量避免接触收集管中的细胞碎片沉淀（由于裂解液较粘稠，所以将溶液转移至过滤柱时，可以剪去部分吸头末端）；

3）缓慢加入0.5倍上清体积的无水乙醇（通常为225μl），混匀，将得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱cr3中，14000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中（如果上清液体积有损失，调整乙醇的用量）；

4）向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，14000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；

5）dnasei工作液的配制：取10μldnasei储存液放入新的rnase-free离心管中，加入70μlrdd溶液，轻柔混匀；

6）向吸附柱cr3中央加入80μl的dnasei工作液，室温静置15min；

7）向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，14000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中；

8）向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw（使用前请先检查是否已加入乙醇），室温静置2min，14000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱cr3放回收集管中，重复该步骤一次；

9）14000rpm离心2min，倒掉废液，将吸附柱cr3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；

10）将吸附柱cr3放入一个新的rnase-free离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加60μlrnase-freeddh2o，室温放置2min，14000rpm离心2min，得到rna溶液；

11）nanodrop2000检测rna浓度。

9、逆转录反应

利用tiangen公司的fastquantcdna第一链合成试剂盒（fastquantrtkitwithgdnase）进行反应，操作步骤如下：

gdna去除反应体系：

42℃温育3min，然后置于冰上放置；

反转录反应体系:

将反转录反应中的mix，加到gdna去除步骤的反应液中，充分混匀；

42℃，温育15min；95℃，温育3min之后放于冰上，得到的cdna可用于后续实验，或低温保存。

10、pcr检测

根据fomv载体的序列设计引物，并委托上海英俊公司合成，引物序列信息见下表2：

表2

检测植物中病毒的表达量，pcr反应体系如下：

pcr反应程序：

预变性阶段：95℃，5min;

反应阶段：95℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸45s；

反应阶段进行35个循环，

终延伸阶段：72℃，10min；

琼脂糖凝胶电泳检测：

1%琼脂糖凝胶，1×tae电泳缓冲液，150v电压，15min。结果参见图2g。图2g中为rt-pcr检测病毒表达的ftmrna，结果表明，其大小和2000bp的dna标记以及ftmrna和fomvrna的位置。

实施例2：利用fomv病毒载体高效、快速诱导小麦开花和抽穗

1、按照实施例1方法所述，构建得到fomv/hd3a载体，如图1所示。

2、按照实施例1方法步骤4进行农杆菌转化。

3、按照实施例1方法步骤5进行本氏烟的病毒接种。

4、小麦的病毒接种

1)小麦在23℃、长日照（光照16h/d）的温室环境下生长，同样选取2-3叶期的小麦，一般选择2片正在扩大生长的新生叶进行接种；

2)在选好的叶片上均匀撒上薄薄的一层石英砂；

3)取一片接种成功的fomv/hd3a的nb叶片，加入适量eb研磨，研磨均匀成液态；

4)用戴橡胶手套的双手食指进行接种，一个托着接种叶，一个在叶面上轻轻磨擦约5下，使病汁（含有fomv病毒的本氏烟病汁液）液渗透到小麦表皮中；

5)最后向整个植株上喷水雾让其自我修复。

5、接种后的小麦在长光照条件下的开花表型观察

在接种后，小麦接种叶及新生叶没有明显的褪绿病斑（图7，图7中a和b，小麦病毒感染的发展。模拟接种的小麦无症状（a），而fomv/hd3a侵染导致小麦叶片变黄和黄化（b）。照片在4wass（a和b）时拍摄。bar=3cm。）。在接种8周后，接种fomv/hd3a的植株开始接穗。未接种的小麦在17周后还未开始接穗。基本接种后每7天详细观测记录1次植株病毒侵染症状，观察植株生长状况等。开花表型参见图8。图8中水稻hd3a的表达促进了小麦的早花和早抽穗；模拟接种的小麦植株保持营养生长，没有表现出生殖生长的迹象（a和c）；用fomv/hd3a处理的植株在播种后11周产生早期抽穗/开花，随后（b和d)）产生更多的抽穗/开花；照片分别在12wass（a和b）或17wass（c和d）时拍摄，bar=3cm。

序列表

<110>杭州师范大学

<120>一种基于植物病毒载体的高效、快速诱导单子叶植物开花的方法

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