一种可产新霉素的弗氏链霉菌株的高通量筛选方法与流程

本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种可产新霉素的弗氏链霉菌株的高通量筛选方法。

背景技术：

硫酸新霉素是由弗氏链霉菌经发酵提取产生的一种氨基糖苷类抗生素，可以抑制蛋白质的生物合成，从而起到抑杀细菌的作用。对革兰氏阴性菌和部分革兰氏阳性菌有强效的杀菌作用；对放线菌、钩端螺旋体、阿米巴原虫有抑制作用。常用于治疗和控制对硫酸新霉素敏感菌感染引起的肠炎、下痢、传染性鼻炎、呼吸道感染等疾病。以往用于生产新霉素的弗氏链霉菌菌株大多由传统的筛选方法获得，摇瓶培养，液相或生物法检测效价，存在投资高，筛选周期长，筛选量小，筛选方法单一，筛选效率低等缺点，因此新霉素的生产能力攀升较慢。近年来有紫外分光光度法在快速检测发酵液中庆大霉素浓度的方法中的应用以及酶标法在高通量筛选泰乐菌素中的应用等文章和专利的发表，在庆大霉素和泰乐霉素的产生菌的筛选上有所突破,中国专利cn106244458公开了一种泰乐菌素高产菌株的高通量筛选方法，但应用范围窄且筛选方法粗糙，在新霉素的菌种选育中尚未见有关快速简便的检测方法和高通量筛选的报道。

技术实现要素：

本发明主要是解决现有技术所存在的问题，提供一种操作简单，周期短，筛选效率高的可产新霉素的弗氏链霉菌株的高通量筛选方法。本发明的上述技术问题主要是通过下述技术方案得以解决的：

本发明提供一种可产新霉素的弗氏链霉菌株的高通量筛选方法，包括测试用的酶标板、酶标仪，筛选步骤如下：

（1）将待筛选的新霉素弗氏链霉菌单菌落分别接种于装有斜面培养基和发酵培养基的孔板中培养，发酵培养结束发酵液经硫酸酸化至ph4.5-5.0，离心取上清液，用蒸馏水稀释至新霉素浓度为30～100u/ml（100倍）；

（2）发酵稀释液与0.25%磷钨酸在酶标板上混合反应，生成沉淀物，可用排枪取稀释液150µl到已装有150µl0.25%磷钨酸96孔酶标板中，酶标仪测定od630值，

（3）用酶标仪测定沉淀物的od值，依od对应值对菌株进行复筛；

（4）将待复筛的多孔板中斜面培养基上长出的对应的菌株的孢子同时接种于大试管斜面或茄子瓶斜面和摇瓶发酵培养，发酵摇瓶培养结束后，发酵液用硫酸酸化至ph为4.5-5.0；

（5）酸化液经过滤，将滤液稀释至30～100u/ml（150倍），然后取稀释液150µl到已装有150µl0.25%磷钨酸的96孔酶标板中，酶标仪测定od630值，根据y=712.79×(x-空白)+8.0269（其中y为稀释后样品中新霉素浓度u/ml,x为稀释后样品od630,空白为水加发酵滤液的od630）计算得到样品新霉素浓度。进而根据稀释倍数换算得到发酵滤液中新霉素浓度，通过比较发酵滤液中新霉素浓度的高低即得到对应的产新霉素相对较高的菌株；

（6）选出的菌株由大试管斜面或茄子瓶斜面制备成沙土管，由沙土管传出斜面经摇瓶发酵精筛，测定生物效价。

作为优选，所述单菌落由出发菌单孢子悬液，经诱变和稀释后涂平板而取得，诱变采用紫外线、超声波或亚硝基胍等。

作为优选，所述步骤（1）用无菌竹签挑取单菌落孢子传至装有斜面培养基的多孔板中，多孔板为24孔板或48孔板，培养温度28±1℃，湿度40%±5％，恒温恒湿培养时间10-12天。

作为优选，所述斜面培养基为高氏1号培养基。

作为优选，所述步骤（1）用无菌竹签挑取适量单菌落孢子传至装有发酵培养基的多孔板中，多孔板为24孔，微孔板震荡孵化器震荡培养，培养温度35℃±1℃，培养时间4-6天。

作为优选，所述步骤（1）的发酵培养液中含有：淀粉7.0g/100ml,葡萄糖2.0g/100ml,棉籽蛋白粉2.0g/100ml,玉米浆3.0g/100ml,硫酸铵1.5g/100ml,蛋白胨1.0g/100ml,硫酸镁0.1%g/100ml,磷酸二氢钾0.05%g/100ml,轻质碳酸钙0.3g/100ml。

作为优选，所述步骤（1）和（4）的发酵液用25%硫酸酸化，振荡30分钟左右，ph值调至4.5-5。离心是用高通量孔板自动平衡离心机，转速4000r/min，离心15分钟。大试管斜面的培养是在温度28℃，湿度40%的条件下培养10-12天。发酵摇瓶培养基的培养是在温度35℃，湿度45%的条件下培养6天。

作为优选，所述步骤（3）和（5）酶标仪中设定检测波长为630nm测定od值。y=712.79×(x-空白)+8.0269标准曲线的制备是将新霉素标准品分别配制成10u/ml、20u/ml、30u/ml、40u/ml、50u/ml、60u/ml、70u/ml、80u/ml、90u/ml和100u/ml的硫酸新霉素标准品溶液，吸取150µl蒸馏水及稀释液到装有150µl磷钨酸的酶标板中混匀，用酶标仪测其od630，根据最小二乘法由od630及新霉素浓度即得线性方程。

本发明的带来的有益效果是：

本发明是利用磷钨酸与氨基糖甙类抗生素可反应生成白色沉淀的原理用一定浓度的过量的磷钨酸与适当稀释倍数的新霉素发酵滤液反应，生成白色沉淀，依据新霉素浓度高低产生的白色沉淀多少而在一定波长的可见光处吸收的高低用酶标仪检测法来检测od值，进而判断相应菌株产抗能力的高低，并结合多孔板斜面和多孔板发酵的培养而使新霉素的高通量筛选成为可能，形成了一整套的高通量筛选模型。该模型具有快速、大量、操作便捷、准确等特点，很大程度上提高了新霉素诱变育种的筛选效率，使获得新霉素高产菌株的几率大大提高。

附图说明

附图1是本发明可产新霉素的弗氏链霉菌株的高通量筛选流程示意图；

附图2是新霉素浓度(μ/ml)对od值曲线图。

具体实施方式

下面通过实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步具体的说明。

将已经过紫外复合超声波诱变处理后的单孢子悬液长成的单菌落，用无菌竹签挑取适量孢子传至装有斜面培养基和发酵培养基的多孔板中培养，斜面为24孔板或48孔板，培养温度28±1℃，湿度40%±5％，恒温恒湿培养时间10天；发酵多孔板为24孔，培养温度35℃±1℃，湿度45%±5％，培养时间4天。培养完成后每个多孔板发酵液里滴1滴25%硫酸再次振荡30min使其充分酸化，酸化后在多孔板专用离心机上离心，4000rpm，15min。取上清液先稀释100倍。酶标板中加入150µl0.25%的磷钨酸，再加入150µl稀释100倍的发酵滤液，混匀，使之充分反应30分钟，将酶标板放入酶标仪中设定检测波长为630nm，测其od值。根据测得od值与生物效价的线性对应关系选择od值高的菌株也就是产抗能力强的菌株进行复筛。表1为初筛测得的od值表。

（节选，因高通量筛选每批可达千位数以上）

表1初筛测得的od值表

挑选6、9等号菌株进行复筛。

酶标仪检测新霉素标准品与磷钨酸反应生成沉淀的od值制备新霉素浓度对od值标准曲线：

用磷钨酸比色法制备标准曲线，称取一定量的新霉素标准品，稀释成不同浓度的标准溶液，将各浓度标准溶液150μl在酶标板中与150μl0.25％磷钨酸反应30分钟，生成乳白色沉淀，在630nm处测其od值，将新霉素浓度对应od值生成标准曲线，并回归出方程:y＝712.79×(样品od-空白od)+8.0269，r2＝0.9992。附图2是新霉素浓度(μ/ml)对od值曲线图。

y：新霉素浓度即生物效价u/ml

x：样品od值减空白od值

根据初筛结果对应选择要进行复筛的菌株的多孔板斜面接种到发酵摇瓶培养基和大试管斜面中，发酵摇瓶于恒温恒湿摇床上培养6天，培养完成后用25％硫酸酸化处理发酵液，调ph至4.5左右，然后经滤纸过滤即得发酵滤液，将滤液稀释150倍，吸取150μl滤液稀释液加入到已装有150μl0.25％的磷钨酸的酶标板中混匀，使之充分反应30分钟，将酶标板放入酶标仪中检测od值，根据样品及空白od值及标准回归方程计算出相应摇瓶发酵液的生物效价，进而挑选出初筛和复筛结果一致的菌株进行精筛。表2为复筛测得的od值表。

表2复筛测得的od值表

实测生物效价与计算生物效价误差在±5%之内，方法准确可靠，完全可以在菌种选育中代替生物效价检测方法应用。

x17880与x17932号菌种分别为本批筛选出高于对照发酵水平35.57%和37.93%的菌种，且斜面三代稳定遗传。

上述具体实施方式用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。