一种解淀粉芽孢杆菌CPLK1314及其在饲料储存中的应用的制作方法

本发明属于生物技术应用领域，涉及一株具有拮抗霉菌和降解呕吐毒素作用的解淀粉芽孢杆菌cplk1314，及其作为生物防腐剂在饲料储存中的应用。
背景技术：
：中国饲料业的发展始于20世纪70年代，改革开放后，我国饲料业进入快速发展期，由于我国地域辽阔，我国饲料业的经济体量已然位于世界前列。然而，饲料运输储存中的霉变问题仍是世界饲料业一直未能有效解决的重点难题之一，每年由于呕吐毒素或其他霉菌毒素等侵染而造成的饲料损失高达数十亿美元。并且由于饲料业与畜牧业联系密切，饲料谷物的污染问题直接或间接威胁到人们的食品安全与人身安全。呕吐毒素(vomitoxin)又名脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,don)，是b型单端孢霉烯族化合物，是一种全球性的谷物污染毒素，主要污染大麦、小麦、玉米及燕麦等谷类农作物，同时也污染各类粮食制品例如动物奶制品、粮食制品及蛋类。don毒素可以影响核糖体肽基转移酶的酶活性，并阻碍核糖体循环，进而抑制启动反应和终止反应，最终抑制蛋白质的合成，降低动物的生长性能，对人和动物健康带来不可估计的危害。don毒性作用主要分为影响消化系统、免疫毒性、细胞毒性、神经毒性以及“三致”毒性(致癌、致畸、致突变)。近年来，人们致力于寻找各种方法应用于降解呕吐毒素，但是收效甚微。目前人们常用的呕吐毒素脱毒处理分为物理、化学、及生物方法等三种方式。物理方法有漂洗研磨法、热处理法、无机吸附法、离子辐射法。化学方法有臭氧法、化学试剂处理法。生物方法有微生物菌体吸附、微生物菌体降解、酶解法。由于生物降解法能在温和的条件下降低或去除呕吐毒素的毒性，而且对饲料的感官性状和适口性等影响极小而被认为是降解呕吐毒素的最佳方法。其中微生物降解呕吐毒素的机理目前已发现的有破坏呕吐毒素分子结构中c12、c13的环氧结构、破坏其致毒基团——c3-oh基团和水合作用等，但由于国内外有关利用酶降解呕吐毒素的研究报告并不多，因此微生物酶解法的具体降解机理还尚待研究。解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefaciens)属于芽孢杆菌属(bacillus)，是一种具有广谱抑菌活性的革兰氏阳性菌，解淀粉芽孢杆菌最初是由priest发现鉴定的，模式菌株为atcc23350。1980年之前少有研究解淀粉芽孢杆菌的报道。解淀粉芽孢杆菌是典型的植物促生菌，具有较强的次生代谢产物产生能力，能够分泌多种抗菌蛋白、抗生素、酶或多肽等活性物质，促进植物生长，防治植物真菌病害。由于解淀粉芽孢杆菌优异的抗菌特性，近年来不断的有各地学者分离鉴定出新的解淀粉芽孢杆菌用于人们的生产生活中。目前解淀粉芽孢杆菌已发掘的应用主要有以下几点：1)作为水果蔬菜的保鲜剂，粮食饲料的防腐剂，具有良好的防腐作用；2)净化水质，解淀粉芽孢杆菌能够分泌多种抗菌物质对藻类抑制效果明显，可防治水体富营养化；3)防治多种植物病害，降低植物的染病概率；4)作为生物肥料促进植物的生长发育，提高植物品质。技术实现要素：技术问题：本发明的目的是克服现有技术所存在的不足，而提供一株解淀粉芽孢杆菌cplk1314，其具有以下几点功效：1)能够产生杆菌霉素l与泛革素两种脂肽类抗生素并在其协同作用下可以有效拮抗镰刀菌的生长；2)能够产生胞外酶降解呕吐毒素，可制成脱毒剂对霉菌毒素有脱毒作用；3)提供优化的工业培养基方案使其能以较低成本制成生物防腐剂。技术方案：本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌cplk1314，分类命名为解淀粉芽孢杆菌cplk1314(bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarumcplk1314)，保藏编号为cctccno：m2017658。本发明提供了一种提高所述解淀粉芽孢杆菌cplk1314脂肽类抗生素产量的培养基，所述的培养基配方为：黄豆饼粉1-1.5％、小米面2-3％、葡萄糖2-3％、(nh4)2so40.8-1％、kcl0.3-0.5％、凹土1-2％。本发明提供了所述的解淀粉芽孢杆菌cplk1314在生产脂肽类抗生素中的应用。其中，脂肽类抗生素为泛革素或/和杆菌霉素l。本发明提供了一种脂肽类抗生素的制备方法，包括：将所述的解淀粉芽孢杆菌cplk1314接种于培养基中进行发酵，从发酵液中分离得到所述的脂肽类抗生素。其中，所述发酵的温度为28-30℃，发酵时间为40-48h；接种量为2-4％，发酵时的搅拌速度150-200rpm，通入空气量100-120ml/250ml。本发明提供了一种生防制剂，含有所述的解淀粉芽孢杆菌cplk1314的菌体、芽孢或发酵产物。本发明提供了所述的解淀粉芽孢杆菌cplk1314在抑制霉菌如镰刀菌进一步为禾谷镰刀菌中的应用。所述解淀粉芽孢杆菌cplk1314对禾谷镰刀菌的抑菌率可达60％，其对禾谷镰刀菌孢子具有致畸性，对对禾谷镰刀菌菌丝具有破坏作用。本发明提供了所述的解淀粉芽孢杆菌cplk1314在降解呕吐毒素中的应用。本发明提供了所述的解淀粉芽孢杆菌cplk1314在饲料运输保存或脱毒中的应用。有益效果：本发明所述解淀粉芽孢杆菌cplk1314同时具有拮抗禾谷镰刀菌的功效和高效降解呕吐毒素的能力，拮抗镰刀菌指的是抑制其菌丝生长与孢子萌发，降解呕吐毒素依靠的是cplk1314分泌的胞外酶。其防霉机理与该菌种能发酵产生2中脂肽类抗生素的分泌量与种类有关，而其降解呕吐毒素的能力，与其分泌的胞外酶有关，目前国内外作为生物降解呕吐毒素生防菌的发现发明并不多，所以本发明在饲料储藏与农作物脱毒方面具有优质并且更加广阔的应用潜力。附图说明图1为解淀粉芽孢杆菌cplk1314在lb培养基28℃培养24h的菌落照片；图2为解淀粉芽孢杆菌cplk1314发酵产物中脂肽类抗生素-杆菌霉素的质谱图；图3为解淀粉芽孢杆菌cplk1314发酵产物中脂肽类抗生素-泛革素的质谱图；图4为解淀粉芽孢杆菌cplk1314对禾谷镰刀菌孢子致畸影响效果图；图5为解淀粉芽孢杆菌cplk1314对禾谷镰刀菌菌丝破坏效果图；图6为呕吐毒素(vomitoxin)标准品高效液相色谱图；图7为解淀粉芽孢杆菌cplk1314对呕吐毒素降解效果(培养3天)的高效液相色谱图；图8为解淀粉芽孢杆菌cplk1314对呕吐毒素降解效果(培养7天)的高效液相色谱图；图9为解淀粉芽孢杆菌cplk1314对呕吐毒素降解效果(培养14天)的高效液相色谱图；图10为解淀粉芽孢杆菌cplk1314对禾谷镰刀菌孢子萌发和菌丝生长影响效果图；代表面对相同剂量镰刀菌孢子的侵染，左一加入等量无菌水的对照组，在较短的时间内孢子萌发，菌丝侵染完全整个三角瓶瓶底，剩下由左二到左四代表加入由高浓度到低浓度不同浓度的cplk1314发酵液，即含有不同浓度的cplk1314菌体，面对同等剂量的镰刀菌孢子侵染，加入较高浓度的cplk1314的实验组表现出较为明显的对孢子萌发的抑制，以及抑制镰刀菌菌丝扩展的能力。具体实施方式下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。实施例1本实施例主要涉及解淀粉芽孢杆菌cplk1314的分离、鉴定及保藏。分离过程如下：用lb培养基从淮安市小麦田土壤中分离芽孢杆菌，用平板对峙法从分离的芽孢杆菌中初步筛选出抗禾谷镰刀菌的芽孢杆菌菌株，对得到的芽孢杆菌的发酵液进行呕吐毒素降解活性的测定(方法参照实施例6)，进一步筛选出降解呕吐毒素效果最好的芽孢杆菌菌株。对筛选出的芽孢杆菌菌株进行鉴定。对筛选的菌株cplk1314进行形态学鉴定和生理生化鉴定：cplk1314菌体细胞在400倍光学显微镜下呈短杆状，具有运动性；在lb培养基上形成的菌落呈圆形，边缘整齐，中间形成褶皱，淡黄色，不透明(图1)。革兰氏染色阳性，水解淀粉，甲基红实验阳性，接触酶阳性。16srdna的序列如seqidno.1所示。经形态学、生理生化和分子生物学鉴定，筛选出的目标菌株为解淀粉芽孢杆菌，分类命名为解淀粉芽孢杆菌cplk1314(bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarumcplk1314)，分类地位为：枯草芽孢杆菌属，枯草芽孢杆菌种，解淀粉芽孢杆菌亚种，该菌株已于2017年11月6日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctccno：m2017658，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏时间为30年。实施例2本实施例涉及上述解淀粉芽孢杆菌cplk1314的性能研究，具体涉及解淀粉芽孢杆菌cplk1314产脂肽类抗生素检测。将解淀粉芽孢杆菌cplk1314接种在1000mllb培养基中培养72h后离心除去菌体，上清液用浓盐酸(质量分数为37％)调至ph2.0沉淀过夜，8000r离心25min得到沉淀，沉淀用1/10体积甲醇分2次抽提，每次抽提2h，合并甲醇抽提物。甲醇抽提物减压浓缩后过0.22μm微孔滤膜即可进行质谱检测。质谱分析的仪器为agilent6410三重串联四级杆质谱仪，购自美国安捷伦科技股份有限公司。采用(色谱纯)饱和α-氰基-4-羟基桂皮酸，0.1％三氟乙酸，乙腈和水(体积比3﹕1)溶液稀释样品1000倍后，通过注射器直接进样粗制备脂肽类抗生素。采用质谱法测定粗提脂肽类化合物的分子质量，电喷雾条件为：毛细管电压32v、喷雾电压20kv、毛细管温度320℃。检测方式：正离子。采用高效液相色谱和质谱联用的方法检测到解淀粉芽孢杆菌的培养液中含有两种脂肽类抗生素(图2、图3)，经对比为杆菌霉素l与泛革素。实施例3本实施例涉及一种优化的工业培养基对解淀粉芽孢菌cplk1314产脂肽类抗生素产量的影响。所述的工业培养基配方为(质量分数，溶剂为水)：黄豆饼粉1.5％、小米面3％、葡萄糖3％、(nh4)2so40.8％、kcl0.5％、凹土2％。取解淀粉芽胞杆菌cplk1314划线培养于lb平板培养基上。在28℃下培养24h后转接于lb培养液中，28℃，200r/min，培养24h成种子液。以接种量2％(是体积分数)将种子液接种到lb液体培养基于30℃进行发酵，搅拌速度150rpm，通入空气量100ml/250ml。经该配方发酵48h后解淀粉芽孢杆菌发酵产物含量如表1，以lb培养基作为对照。表1名称lb培养基工业培养基解淀粉芽孢菌cplk1314发酵72h菌体量10×109个/ml5×1010个/ml杆菌霉素l2.2g/l5.3g/l泛革素3.5g/l6.6g/l实施例4本实施例涉及解淀粉芽孢杆菌cplk1314对禾谷镰刀菌孢子致畸性检测。取禾谷镰刀菌斜面[禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)由本实验室保存，培养基为pda(g/l)(马铃薯200、蔗糖20、ph7.0、28℃培养)，将斜面菌种接于pda平板上28℃活化14天，然后用无菌水将菌种配成1×103cfu/ml的孢子悬浮液(血球计数板计数)，随配随用。取200μl孢子悬浮液涂布在水琼脂平板(琼脂20g、去离子水1000ml、121℃灭菌20min)定时于显微镜下观察记录禾谷镰刀菌孢子萌发形态。取保存于-70℃超低温冰箱中的解淀粉芽胞杆菌cplk1314划线培养于lb平板培养基上，在28℃下培养24h后转接于lb培养液中，28℃，200r/min，培养24h成种子液。以1:100的比率在lb培养液中扩繁。28℃，200r/min，扩繁72h后所得菌液在5000r/min，4℃下离心10min，取上清。将1ml上清液与1ml孢子悬浮液充分混合后取200μl涂布于水琼脂平板镜检观察禾谷镰刀菌孢子致畸形态。图4为解淀粉芽孢杆菌cplk1314对禾谷镰刀菌孢子致畸影响效果图，经对比发现，经解淀粉芽孢杆菌cplk1314处理后的真菌孢子相较于正常孢子，两端膨大，产生分歧，形状不规则，表明解淀粉芽孢杆菌cplk1314对禾谷镰刀菌孢子具有明显致畸效果。实施例5本实施例涉及解淀粉芽孢杆菌拮抗禾谷镰刀菌能力的测定与解淀粉芽孢杆菌cplk1314对禾谷镰刀菌菌丝影响测定。将解淀粉芽孢杆菌cplk1314接种于lb液体培养基(g/l)(胰蛋白胨10、酵母提取物5、氯化钠10、ph7.0，28℃)。禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)由本实验室保存，培养基为pda(g/l)(马铃薯200、蔗糖20、ph7.0，28℃培养)。解淀粉芽孢杆菌在培养基中培养72h后得发酵液，采用平板对峙实验测定解淀粉芽孢杆菌发酵液对禾谷镰刀菌的拮抗作用。具体的，将禾谷镰刀菌菌块(直径5mm)接种在含有lb平板(直径9cm)中央，在距离菌块2.5cm处放置牛津杯并滴加100μl发酵液，于28℃培养，待菌丝长至合适位置，观察发酵液对禾谷镰刀菌的抑制活性，测定抑菌带宽。在菌块另一侧以未接种芽孢杆菌的培养基上清液作为空白对照组，每组处理三个重复，处理结果如表2所示。抑菌率(％)＝(空白对照组菌落直径-处理组菌落直径)/空白对照组菌落直径×100％。表2解淀粉芽孢杆菌cplk1314拮抗禾谷镰刀菌能力于光学显微镜下观察解淀粉芽孢杆菌cplk1314对禾谷镰刀菌菌丝生长影响。图5为解淀粉芽孢杆菌cplk1314对禾谷镰刀菌菌丝破坏效果图；经对比发现，经解淀粉芽孢杆菌cplk1314影响的菌丝相较于正常菌丝表现为，菌丝杂乱，菌丝部分膨大，部分菌丝甚至出现消融现象，表明解淀粉芽孢杆菌cplk1314对禾谷镰刀菌菌丝具有明显的破坏效果。实施例6本实施例涉及解淀粉芽孢杆菌cplk1314降解呕吐毒素能力测定。呕吐毒素标准曲线的制定，将呕吐毒素标准瓶(购于北京贝纳创联生物技术研究院)用色谱纯甲醇配置成浓度为5μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml浓度标准品用高效液相色谱法检测呕吐毒素在不同浓度下的峰面积(检测条件：色谱柱：agilentzorbaxsb-aqc18(规格：4.6×250mm，粒径：5μm)；柱温：29℃；进样量：20μl；流动相：乙腈：水(15:85，v/v)；流速：0.8ml/min；检测波长：218nm)，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。得线性回归方程为y＝13.950x+30.566，r2＝0.9986。将解淀粉芽孢菌cplk1314接种于将菌株接种于工业培养基液体培养基(g/l)中30℃活化培养48h，取100ml发酵上清液，放入冰水浴中预冷10min，将硫酸铵研磨成粉末在搅拌、冰浴条件下缓慢加入，分别加至终浓度为75％(质量分数)。加完后继续搅拌15～20min。4℃冰箱静置过夜，12500rpm低温离心15min，得到的沉淀用10mlnah2po4-nah2po4缓冲液(ph＝6.60)溶解即为胞外酶粗提液。取1ml胞外酶粗提液加入don配置成浓度为25μgdon/ml的实验组。分别用不加胞外酶粗提液只加don和不加胞外酶粗提液不添加don的nah2po4-nah2po4缓冲液(ph＝6.60)作阳性对照和阴性对照，32℃，180r/min摇床培养3d、7d、14d，然后用高效液相色谱法根据峰面积检测计算培养基中剩余don含量。(检测条件：色谱柱：agilentzorbaxsb-aqc18(规格：4.6×250mm，粒径：5μm)；柱温：29℃；进样量：20μl；流动相：乙腈：水(15:85，v/v)；流速：0.8ml/min；检测波长：218nm)结果如图6～9、表3所示。表3解淀粉芽孢杆菌cplk1314降解呕吐毒素能力结果表明解淀粉芽孢杆菌cplk1314对呕吐毒素处理14d后，降解转化率高达92.44％，具有高效良好的呕吐毒素降解能力。实施例7本实施例涉及解淀粉芽孢杆菌cplk1314在饲料储藏中拮抗霉菌的应用。取禾谷镰刀菌斜面-禾谷镰刀菌(fusariumgraminearum)由本实验室保存，培养基为pda(g/l)(马铃薯200、蔗糖20、ph7.0，28℃培养)，将斜面菌种接于pda平板上28℃活化14天，然后用无菌水将菌种配成1×106cfu/ml的孢子悬浮液(血球计数板计数)，随配随用。取保存于-70℃超低温冰箱中的解淀粉芽胞杆菌cplk1314划线培养于lb平板培养基上。在28℃下培养24h后转接于lb培养液中，28℃，200r/min，培养24h成种子液。以1:100的体积比率在lb培养液中扩繁。28℃，200r/min，扩繁72h后所得菌液在5000r/min，4℃下离心10min，离心所得菌体用lb培养液重悬浮并调至所需浓度即得解淀粉芽胞杆菌悬液。取200ul禾谷镰刀菌孢子液与200ul解淀粉芽孢杆菌悬液混合于2mlep管中，漩涡振荡1min混匀后用移液枪加入麦麸培养基(麦麸10g，去离子水10ml，121℃灭菌后备用)中，观察孢子萌发与菌丝生长状况，结果如图10、表4所示。表4解淀粉芽孢杆菌cplk1314对镰刀菌生长影响经三组平行试验证明，在人为添加不同相同的禾谷镰刀菌孢子的条件下，无菌水对照组的饲料代表——麦麸表面在较短时间内孢子萌发并迅速侵染整个三角瓶底部，而加入不同浓度梯度的解淀粉芽孢杆菌cplk1314发酵液的实验组均表现出对外来孢子的萌发抑制能力，并且对后续的禾谷镰刀菌菌丝生长具有不同程度拮抗效果，解淀粉芽孢杆菌cplk1314浓度越高其效果越明显。而在实验设置最高浓度组106cfu/g浓度下，至三角瓶中水分自然消失至干竭状态时，瓶中菌丝依旧未完全铺满，甚至部分干瘪消失，表现出优异的禾谷镰刀菌拮抗能力。该实验的实践意义在于，在传统饲料储藏中加入以解淀粉芽孢杆菌cplk1314为主要成分的防腐剂，可有效抑制禾谷镰刀菌的孢子萌发与菌丝生长。实施例8本实施例涉及解淀粉芽孢杆菌cplk1314对饲料脱毒能力测定。于淮安农田收集霉化玉米、小麦、黄豆各2.5kg，分别取500g样品粉碎后浸泡于1000ml去离子水中过夜放置48h，以四层纱布过滤后取少量样品液再经0.22μm滤膜过滤，对过滤之后的样品液用高效液相色谱仪进行呕吐毒素含量的检测。(检测条件：色谱柱：agilentzorbaxsb-aqc18(规格：4.6×250mm，粒径：5μm)；柱温：29℃；进样量：20μl；流动相：乙腈：水(15:85，v/v)；流速：0.8ml/min；检测波长：218nm)再分别吸取200μl样品液与实施例6中72h培养的解淀粉芽孢杆菌cplk1314发酵上清液200μl混合置于ep管中静置培养48h后，再用高效液相色谱仪检测呕吐毒素残余量。结果如下表5。表5解淀粉芽孢杆菌cplk1314对农业作物脱毒的影响经试验证明，解淀粉芽孢杆菌cplk的脱毒效率在48h内均达到50％以上，呈现出优异的脱毒效果。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见的得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。序列表<110>淮阴工学院<120>一种解淀粉芽孢杆菌cplk1314及其应用<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1472<212>dna<213>解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliquefacienssubsp.plantarum)<400>1gacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctc60cctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggat120aactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacataa180aaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggt240aacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactggga300ctgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacga360aagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttg420ttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaag480ccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaa540ttattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctc600aaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattcc660acgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctct720ggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctgg780tagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgc840agctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaa900ttgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaac960cttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcag1020agtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccg1080caacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactg1140ccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctg1200ggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaa1260tcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaa1320tcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacacc1380gcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttaggagcc1440agccgccgaaggtgggacagatgattggggtg1472当前第1页12