一种高效形貌无损的外泌体分离方法与流程

本发明涉及生物技术领域，特别是一种高效形貌无损的外泌体分离方法。

背景技术：

外泌体是由活细胞分泌的，直径为30nm～150nm的囊泡。研究表明，外泌体携带有丰富的生物学信息，包括蛋白质、mrna和microrna等物质，在细胞交流中起着至关重要的作用。此外外泌体还参与调控机体生理病理过程，越来越多的研究表明，外泌体参与形成肿瘤的前病灶，在肿瘤的发生发展和转移过程直接相关。因此外泌体对于癌症的临床检测与治疗具有重大意义。当前外泌体研究仍处于初级阶段，面临的首要问题仍是如何高效无损地分离外泌体。

目前的外泌体提取方法如超高速离心法、试剂盒沉淀法、免疫共沉淀法等有着不容忽视的缺点，如耗时、成本高、稳定性差、不能保证获得外泌体的纯度等，一些方法更是面临如何将捕获的外泌体释放的难题。因此，现有的外泌体分离技术不能满足该领域研究需求，开拓新的外泌体分离方法势在必行。

技术实现要素：

针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种高效形貌无损的外泌体分离方法，可有效解决现有技术耗时、成本高、稳定性差、不能保证获得外泌体的纯度的问题。

本发明解决的技术方案是，具体包括以下步骤：

a、制备核酸适配体修饰的用于识别捕获外泌体的磁珠：方法是，利用末端修饰有生物素的核酸适配体与表面修饰有链霉亲和素的磁珠为反应体系共孵育，在反应体系中，磁珠浓度为1×10⁸-1×10⁹个/ml，核酸适配体浓度20-500nm，在37℃水浴中共孵育10-30min，孵育完成后利用圆环磁铁进行磁分离，用ph值为7.4的pbs缓冲液洗涤沉淀磁珠2-3次，以除去非特异性吸附的核酸适配体，得到修饰有核酸适配体的用于识别捕获外泌体的磁珠；

b、样品的选择和前处理：样品来源为人体液的血液、唾液、乳液、尿液或细胞培养液，其中，细胞培养液前处理：将细胞培养液以1000r/min速度离心8-10min除去死细胞，将所得上清液过0.22μm滤膜，除去细胞碎片后待用；血液、唾液、乳液、尿液样品的处理均为：将收集的样品于3-5℃、3000r/min离心8-10min，取上清液过0.22μm滤膜后待用；

c、利用修饰有核酸适配体的磁珠识别并捕获外泌体样本：将步骤a中得到的修饰有核酸适配体的用于识别捕获外泌体的磁珠与步骤b中处理后的血液、唾液、乳液、尿液或细胞培养液样品的其中一种置于样品管中，37℃共孵育0.5-1h，孵育完成后，将样品管置于圆环磁铁上静止3-5min沉淀，弃去上清液，用ph为7.4的pbs缓冲液洗涤沉淀两次，得外泌体样本；

d、利用核酸适配体的互补链替换释放外泌体：将c步骤中得到的外泌体样本重新分散于ph值为7.4的pbs缓冲液中，加入核酸适配体的完全互补链，使得核酸适配体完全互补链终浓度为1-1.5μm，于37℃共孵育0.5-1h，将孵育后的样品管置于磁力架上静止3-5min沉淀，吸取上清液，即得高效形貌无损的外泌体。

本发明外泌体分离方法有效解决了现有技术耗时、成本高、稳定性差、不能保证获得外泌体的纯度的问题，可高效得到形貌无损的外泌体，是外泌体分离方法上的创新。

附图说明

图1为本发明表面修饰有核酸适配体的磁珠识别捕获外泌体，并通过核酸适配体完全互补链替换释放出捕获的外泌体示意图。

图2为本发明实施例1以mcf-7细胞培养液为样品、以cd63蛋白为特异标志物，用本发明方法得到的外泌体的透射电镜图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

由图1-2给出，本发明在具体实施时，具体包括以下步骤：

a、制备核酸适配体修饰的用于识别捕获外泌体特异标志物的磁珠：方法是，利用末端修饰有生物素的核酸适配体与表面修饰有链霉亲和素的磁珠为反应体系共孵育，在反应体系中，磁珠浓度为1×10⁸-1×10⁹个/ml，核酸适配体浓度20-500nm，在37℃水浴中共孵育10-30min，孵育完成后利用圆环磁铁进行磁分离，用ph值为7.4的pbs缓冲液洗涤沉淀磁珠2-3次，以除去非特异性吸附的核酸适配体，得到修饰有核酸适配体的用于识别捕获外泌体特异标志物的磁珠；

b、样品的选择和前处理：样品来源为人体液的血液、唾液、乳液、尿液或细胞培养液，其中，细胞培养液前处理：将细胞培养液以1000r/min速度离心8-10min除去死细胞，将所得上清液过0.22μm滤膜，除去细胞碎片后待用；血液、唾液、乳液、尿液样品的处理均为：将收集的样品于3-5℃、3000r/min离心8-10min，取上清液过0.22μm滤膜后待用；

c、利用修饰有核酸适配体的磁珠识别并捕获外泌体样本：将步骤a中得到的修饰有核酸适配体的用于识别捕获外泌体的磁珠与步骤b中处理后的血液、唾液、乳液、尿液或细胞培养液样品的其中一种置于样品管中，37℃共孵育0.5-1h，孵育完成后，将样品管置于圆环磁铁上静止3-5min沉淀，弃去上清液，用ph为7.4的pbs缓冲液洗涤沉淀两次，得外泌体样本；

d、利用核酸适配体的互补链替换释放外泌体：将c步骤中得到的外泌体样本重新分散于ph值为7.4的pbs缓冲液中，加入核酸适配体的完全互补链，使得核酸适配体完全互补链终浓度为1-1.5μm，于37℃共孵育0.5-1h，将孵育后的样品管置于磁力架上静止3-5min沉淀，吸取上清液，即得高效形貌无损的外泌体。

为了保证使用效果，所述的步骤a中，表面修饰有链霉亲和素的磁珠粒径为100-1000nm。

所述的步骤a中，得到的修饰有核酸适配体的用于识别捕获外泌体特异标志物的磁珠在使用前先用0.01%的bsa溶液封闭30min，从而降低对外泌体的非特异性吸附。

所述的步骤d中，利用核酸适配体的完全互补链释放外泌体时，ph值为7.4的pbs缓冲液中含有5mm的mg^2＋，有利于碱基互补配对形成dna双链，从而竞争释放出被捕获的外泌体。

所述的末端修饰有生物素的核酸适配体与与表面修饰有链霉亲和素的磁珠的比例为5:1~20:1。

所述的外泌体样本与核酸适配体的完全互补链的比例为1:20~1:100。

所述的外泌体特异标志物为表面蛋白或多糖，即一般蛋白标志物（cd63，cd9，cd81等）或食管癌，肺癌，胃癌，黑色素瘤等肿瘤外泌体的特异标志物。

实施例1

以mcf-7细胞培养液（nta定量外泌体浓度1×10¹⁰个/ml）、以cd63蛋白为特异标志物，具体包括以下步骤：

a、制备核酸适配体修饰的用于识别捕获外泌体特异标志物的磁珠：方法是，利用3’-末端修饰生物素的anti-cd63核酸适配体5’-caccccacctcgctcccgtgacactaatgctatttttttttttttttt-3’-biotin与表面修饰有链霉亲和素的磁珠为反应体系共孵育，在500μl反应体系中，磁珠浓度为1×10⁸个/ml，核酸适配体浓度200nm，在37℃水浴中共孵育15min，孵育完成后利用圆环磁铁进行磁分离，用ph值为7.4的pbs缓冲液洗涤沉淀磁珠3次，每次500μl，以除去非特异性吸附的核酸适配体，得到修饰有anti-cd63核酸适配体的磁珠；

b、样品的选择和前处理：将mcf-7细胞培养液以1000r/min速度离心10min除去死细胞，将所得上清液过0.22μm滤膜，除去细胞碎片后待用，上清中nta定量外泌体浓度为1×10¹⁰个/ml；

c、利用修饰有anti-cd63核酸适配体的磁珠识别并捕获外泌体样本：将步骤a中得到的修饰有anti-cd63核酸适配体的磁珠与步骤b中处理后的500μlmcf-7上清液置于样品管中，37℃共孵育0.5h，孵育完成后，将样品管置于圆环磁铁上静止4min沉淀，弃去上清液，用500μlph为7.4的pbs缓冲液洗涤沉淀两次，得外泌体样本；

d、利用核酸适配体的互补链替换释放外泌体：将c步骤中得到的外泌体样本重新分散于500μlph值为7.4的pbs缓冲液中，加入anti-cd63核酸适配体的完全互补链3’-gtggggtggagcgagggcactgtgattacgataaaaaaaaaaaaaaaa-5’，使得核酸适配体完全互补链终浓度为1μm，于37℃共孵育0.5h，将孵育后的样品管置于磁力架上静止3min沉淀，吸取上清液，即得高效形貌无损的mcf-7外泌体。

本发明的使用情况是，本发明具体实施例中，以mcf-7细胞培养上清（nta定量外泌体浓度1×10¹⁰个/ml）为例，以anti-cd63为目标蛋白，合成末端修饰有生物素的识别anti-cd63核酸适配体（序列为5’-caccccacctcgctcccgtgacactaatgctatttttttttttttttt-3’-biotin）。首先，生物素修饰的anti-cd63核酸适配体与链霉亲和素修饰的磁珠共孵育，孵育完成后磁珠用ph值为7.4的pbs缓冲液洗涤3次除去非特异性吸附的核酸适配体从而得到用于捕获外泌体的磁珠。该磁珠在使用前用0.01%的bsa封闭非特异性吸附位点，然后与500μl预处理的细胞培养液共孵育，通过磁分离与洗涤过程得到捕获有外泌体的磁珠，将捕获有外泌体样本的磁珠与过量核酸适配体完全互补链共孵育，通过核酸链替换释放出捕获的外泌体，透射电镜图表征显示释放出的外泌体形貌无损、纯度高（如图2所示）。

本发明与现有技术相比，具有以下有益的技术效果：

1、与现有的外泌体分离方法相比，本发明纯化方法耗时短，获得的外泌体纯度高且保证其生物学形态不受破坏；

2、本发明分离方法可直接用于血浆外泌体的分离提取，操作简便，无需大型仪器，有利于临床样本的处理；

3、加热可破坏核酸适配体与其互补链之间的碱基互补配对作用，磁分离可实现磁珠与核酸适配体互补链相互分离，从而达到磁珠回收循环利用，降低成本的目的；

4、本发明中，通过在磁珠表面修饰合适的核酸适配体实现对外泌体的特异或非特异捕获，通过核酸适配体互补链的替换释放出被磁珠捕获的外泌体，通过加热破坏碱基互补配对作用实现磁珠的回收循环利用，从而发展出一种高效形貌无损的外泌体分离方法，具有良好的推广和应用价值。