本发明属于化学合成技术领域，具体涉及一种生物素马来酰亚胺的制备方法。
背景技术：
生物素-马来酰亚胺是一种巯基特异性的生物素探针性试剂，通过与蛋白质中的巯基反应而将蛋白质用生物素标记，这些巯基可以是人工合成的，也可以是蛋白质中天然存在的。该探针具有巯基特异性，应用范围广泛，并且不与伯胺基团反应，即可以避免伯胺的干扰。生物素-马来酰亚胺也可用于斑点印迹实验检测蛋白质上的sh基团。尽管，该探针在多领域具有广泛的应用，但是其制备方法一直没有公开。
因此，本领域迫切需要一种生物素马来酰亚胺的制备方法来解决上述技术问题。
技术实现要素：
本发明的示例旨在克服以上技术问题，提出一种能够适合放大生产，原料易得，制备工艺简单，对环境友好的生物素马来酰亚胺的制备方法。
为解决上述技术问题，本发明提供一种生物素马来酰亚胺的制备方法，其中，包括如下步骤：
其中，x选自氯、溴或碘；
步骤一、6-马来酰亚胺基己酸化合物(1)与n-羟基琥珀酰亚胺在缩合剂的作用下制备得到6-马来酰亚胺基己酸n-羟基琥珀酰亚胺酯化合物(2)；
步骤二、用水合肼处理6-马来酰亚胺基己酸n-羟基琥珀酰亚胺酯化合物(2)，制备得到6-马来酰亚胺基己酰肼化合物(3)；
步骤三、生物素化合物(4)与酰卤化试剂反应，制备得到生物素酰卤化合物(5)；
步骤四、6-马来酰亚胺基己酰肼化合物(3)和生物素酰卤化合物(5)发生反应，得到生物素马来酰亚胺化合物(6)。
优选地，所述步骤一包括将6-马来酰亚胺基己酸化合物(1)、n-羟基琥珀酰亚胺和dcc加入到烧瓶中，室温下反应8小时，反应结束后，通过重结晶的方式得到6-马来酰亚胺基己酸n-羟基琥珀酰亚胺酯化合物(2)。
优选地，所述步骤二包括将6-马来酰亚胺基己酸n-羟基琥珀酰亚胺酯化合物(2)溶解在thf中，滴加水合肼反应2小时，反应结束后，通过重结晶得到6-马来酰亚胺基己酰肼化合物(3)。
优选地，所述步骤三包括将生物素化合物(4)与酰卤化试剂反应，反应后蒸馏去除过量的酰卤化试剂，得到生物素酰卤化合物(5)。
优选地，所述酰卤化试剂选自草酰氯或二氯亚砜。
优选地，所述步骤四包括将6-马来酰亚胺基己酰肼化合物(3)、生物素酰卤化合物(5)和碱性物质溶解在溶剂中，反应完毕后，处理得到生物素马来酰亚胺化合物(6)。
优选地，所述碱性物质选自三乙胺、二异丙基乙基胺、碳酸钾或碳酸铯。
优选地，所述溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、乙腈。
优选地，所述步骤一中的缩合剂选自二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或二异丙基碳二亚胺。
本发明的上述技术方案与现有技术相比具有以下有益效果：
1、本发明适合放大生产，原料易得，制备工艺简单，对环境友好，避免了产物在后处理过程中变质分解的技术问题。
2、本发明解决了生物素马来酰亚胺的供应问题，使得生物素马来酰亚胺能够自给自足。
具体实施方式
在此记载的实施例为本发明的特定的具体实施方式，用于说明本发明的构思，均是解释性和示例性的，不应解释为对本发明实施方式及本发明范围的限制。除在此记载的实施例外，本领域技术人员还能够基于本申请权利要求书和说明书所公开的内容采用显而易见的其它技术方案，这些技术方案包括对在此记载的实施例做出任何显而易见的替换和修改的技术方案。
本发明提供了一种生物素马来酰亚胺的制备方法，其中，包括如下步骤：
其中，x选自氯、溴或碘；
步骤一、6-马来酰亚胺基己酸化合物1与n-羟基琥珀酰亚胺在缩合剂的作用下制备得到6-马来酰亚胺基己酸n-羟基琥珀酰亚胺酯化合物2；
步骤二、用水合肼处理6-马来酰亚胺基己酸n-羟基琥珀酰亚胺酯化合物2，制备得到6-马来酰亚胺基己酰肼化合物3；
步骤三、生物素化合物4与酰卤化试剂反应，制备得到生物素酰卤化合物5；
步骤四、6-马来酰亚胺基己酰肼化合物3和生物素酰卤化合物5发生反应，得到生物素马来酰亚胺化合物6。
优选地，所述步骤一包括将6-马来酰亚胺基己酸化合物1、n-羟基琥珀酰亚胺和dcc加入到烧瓶中，室温下反应8小时，反应结束后，通过重结晶的方式得到6-马来酰亚胺基己酸n-羟基琥珀酰亚胺酯化合物2。
优选地，所述步骤二包括将6-马来酰亚胺基己酸n-羟基琥珀酰亚胺酯化合物2溶解在thf中，滴加水合肼反应2小时，反应结束后，通过重结晶得到6-马来酰亚胺基己酰肼化合物3。
优选地，所述步骤三包括将生物素化合物4与酰卤化试剂反应，反应后蒸馏去除过量的酰卤化试剂，得到生物素酰卤化合物5。
优选地，所述酰卤化试剂选自草酰氯或二氯亚砜。
优选地，所述步骤四包括将6-马来酰亚胺基己酰肼化合物3、生物素酰卤化合物5和碱性物质溶解在溶剂中，反应完毕后，处理得到生物素马来酰亚胺化合物6。
优选地，所述碱性物质选自三乙胺、二异丙基乙基胺、碳酸钾或碳酸铯。
优选地，所述溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、四氢呋喃、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、乙腈。
优选地，所述步骤一中的缩合剂选自二环己基碳二亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或二异丙基碳二亚胺。
以下结合具体示例对本发明做进一步说明，当然具体示例是用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。
示例1
本示例所述制备生物素马来酰亚胺的方法，包括如下步骤：
向50ml单口瓶中依次加入6-马来酰亚胺基己酸化合物1(1.28g，6mmol，1eq)，和n-羟基琥珀酰亚胺(0.7g，6mmol，1eq)和10ml二氯甲烷，溶解澄清，室温下加入二环己基碳二亚胺dcc(1.25g，6mmol，1eq)，室温搅拌4小时，产生大量二环己基脲dcu，tlc监测原料反应完全。冷却至室温，过滤，滤液加硅胶拌样，柱层析，pe：etoac＝1:1洗脱产品，减压蒸缩，得1.7g油状液体为6-马来酰亚胺基己酸n-羟基琥珀酰亚胺酯化合物2，ms+1：309.10，收率91.9％。
将6-马来酰亚胺基己酸n-羟基琥珀酰亚胺酯化合物2(1.7g)溶解在thf中，滴加过量的水合肼溶液(1.70g，28.86mmol，含量85％)，磁力搅拌下，室温反应4h，tlc监测原料反应完全。用乙酸乙酯萃取三次，浓缩得到6-马来酰亚胺基己酰肼化合物3(0.78g)，ms+1:226.11。
将生物素化合物4(5.0g，20mmol，1eq)加入到装有二氯亚砜的烧瓶中，回流反应1小时，然后将过量的二氯亚砜蒸除，剩余物生物素酰卤化合物5直接用于下一步反应。
将6-马来酰亚胺基己酰肼化合物3(0.78g，3.5mmol，1eq)与生物素酰卤化合物5(1.44g，5.5mmol，1.57eq)、三乙胺和四氢呋喃加入到圆底烧瓶中，室温下搅拌8小时，产生大量白色沉淀。过滤，滤液浓缩，柱层析得到产品生物素马来酰亚胺化合物6，0.8g，类白色固体(1h-nmr，9.583s2h，6.968s2h,6.358s2h,4.272s1h,4.102s1h,3.342m2h,3.067m1h,2.786m1h,2.510m1h,2.047m4h,1.452m8h,1.184m4h)。
示例2
本示例所述制备生物素马来酰亚胺的方法，包括如下步骤：
向50ml单口瓶中依次加入6-马来酰亚胺基己酸化合物1(12.8g，60mmol，1eq)，和n-羟基琥珀酰亚胺(7.0g，60mmol，1eq)和150ml二氯甲烷，溶解澄清，室温下加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐edc(12.61g，66mmol，1eq)，室温搅拌8小时，tlc监测原料反应完全。冷却至室温，过滤，滤液加硅胶拌样，柱层析，pe：etoac＝1:1洗脱产品，减压蒸缩，得16.1g油状液体为6-马来酰亚胺基己酸n-羟基琥珀酰亚胺酯化合物2，ms+1：309.10，收率87％。
将6-马来酰亚胺基己酸n-羟基琥珀酰亚胺酯化合物2(16.1g)溶解在thf中，滴加过量的水合肼溶液(18g，290mmol，含量85％)，磁力搅拌下，室温反应4h，tlc监测原料反应完全。用乙酸乙酯萃取三次，浓缩得到6-马来酰亚胺基己酰肼化合物3(9.1g)，ms+1:226.11。
将生物素化合物4(50.0g，200mmol，1eq)加入到烧瓶中，再加入2l二氯甲烷，滴加草酰氯(200g)，回流反应1小时，然后将溶剂二氯甲烷和剩余的草酰氯蒸除。剩余物生物素酰卤化合物5直接用于下一步反应。
将6-马来酰亚胺基己酰肼化合物3(9.1g，35mmol，1eq)与生物素酰卤化合物5(15g，57mmol，1.6eq)、三乙胺和四氢呋喃加入到圆底烧瓶中，室温下搅拌8小时，产生大量白色沉淀。过滤，滤液浓缩，柱层析得到产品生物素马来酰亚胺化合物6，7.8g，类白色固体(1h-nmr，9.583s2h，6.968s2h,6.358s2h,4.272s1h,4.102s1h,3.342m2h,3.067m1h,2.786m1h,2.510m1h,2.047m4h,1.452m8h,1.184m4h)。
应当理解的是，本发明的上述具体实施方式仅仅用于实施例性说明或解释本发明的原理，而不构成对本发明的限制。因此，在不偏离本发明的精神及范围的情况下所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。此外，本发明所附权利要求旨在涵盖落入所附权利要求范围及边界、或者这种范围及边界的等同形式内的全部变化及修改例。