一种适用于谷氨酸棒杆菌的增强型表达载体的制作方法

本发明属于基因工程和生物技术领域，具体涉及一种适用于谷氨酸棒杆菌的增强型表达载体。

背景技术：

谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)是一种兼性厌氧的革兰氏阳性工业微生物，广泛用于一些有机酸的合成^[1]。因具有无内毒素、抗逆性强、蛋白酶水平较低等优势，近年来谷氨酸棒杆菌也正逐渐被开发用于外源重组蛋白的表达^[2]。

目前能够用于谷氨酸棒杆菌重组蛋白表达的载体较少，常用的有pxmj19、pec-xk99e等载体，这些载体大部分仍是基于经典的大肠杆菌ptac或者ptrc启动子来表达外源蛋白。尽管近年来也有一些内源启动子以及合成启动子的筛选及应用研究，但总体来看强度高于ptac启动子的很少，并且基本也都是非诱导型启动子。一些内源诱导型启动子，如对数末期自诱导的pcg3141以及碳代谢诱导的pmale1和pgit1等^[34]，综合本底控制、表达强度以及诱导幅度等方面来看往往无法有效替代ptac启动子。

技术实现要素：

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述的技术缺陷，提出了本发明。

因此，作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供一种适用于谷氨酸棒杆菌的增强型表达载体。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种适用于谷氨酸棒杆菌的增强型表达载体，其包括，蛋白表达载体，其核苷酸序列包括源基因序列和sd序列。

作为本发明所述适用于谷氨酸棒杆菌的增强型表达载体的优选方案：所述源基因序列包括谷氨酸棒杆菌ncgl2319基因编码序列atg下游的碱基及5'utr序列。

作为本发明所述适用于谷氨酸棒杆菌的增强型表达载体的优选方案：所述5'utr序列长度为30bp或91bp，所述atg下游的碱基序列长度为59bp。

作为本发明所述适用于谷氨酸棒杆菌的增强型表达载体的优选方案：所述5'utr序列如seqidno:1或seqidno:2所示，所述atg下游的碱基序列如seqidno:3所示。

作为本发明所述适用于谷氨酸棒杆菌的增强型表达载体的优选方案：所述5'utr序列如seqidno:1，所述atg下游的碱基序列如seqidno:3所示。

作为本发明所述适用于谷氨酸棒杆菌的增强型表达载体的优选方案：所述源基因序列如seqidno:4所示。

作为本发明所述适用于谷氨酸棒杆菌的增强型表达载体的优选方案：所述sd序列如seqidno:5所示。

作为本发明所述适用于谷氨酸棒杆菌的增强型表达载体的优选方案：包括所述序列的互补序列。

作为本发明所述适用于谷氨酸棒杆菌的增强型表达载体的优选方案：所述载体用于谷氨酸棒杆菌外源蛋白的表达。

作为本发明所述适用于谷氨酸棒杆菌的增强型表达载体的优选方案：所述载体用于谷氨酸棒杆菌sumo-nt-probnp、vhh和egfp增强绿色荧光蛋白的表达。

本发明的有益效果：

本专利选择对ptac启动子的5'末端非翻译区进行改造，使得ptac启动子能够以双顺反子模式表达，并获得增强型表达载体pgx19。将发明载体应用于谷氨酸棒杆菌表达系统中外源蛋白的表达，增强型表达载体pgx19表达外源蛋白egfp是原始载体的2.23倍；sumo-nt-probnp能力是原来的2.11倍；外源蛋白vhh的表达能力是原来的1.70倍。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为pgx19载体简单示意图。

图2为5'race鉴定转录起始位点，确定ncgl2319基因转录起始位点，m：dl2000dnamarker；泳道1：race-pcr的扩增产物。

图3为pgx19构建流程图，利用引物扩增基因组得到ncgl2319的5'utr(30bp)、翻译起始位点atg之后的59bp以及一个保守的sd序列(aaaggaggacaactaatg)，重组到pxmj19的mcs之前，得到增强型表达载体pgx19。

图4为pgs19构建流程图，利用引物扩增基因组得到ncgl2319的5'utr(91bp)以及atg之后59bp的对应dna片段，克隆到pxmj19的mcs之前，得到增强型表达载体pgs19。

图5为pxmj19与pgx19和pgs19的egfp表达水平比较，该图表示增强型表达载体pgx19和pgs19与原始载体pxmj19表达egfp的差异。

图6为pxmj19与pgx19和pgs19在谷氨酸棒杆菌表达菌株的egfp表达水平比较，该图表示增强型表达载体pgx19和pgs19与原始载体pxmj19表达egfp的差异。

图7为pxmj19与pgx19sumo-nt-probnp表达水平比较，图7a为检测增强型表达载体pgx19与原始载体pxmj19表达sumo-nt-probnp的wb图。图7b为对应的wb灰度分析图。

图8为pxmj19与pgx19vhh表达水平比较，图8a为检测增强型表达载体pgx19与原始载体pxmj19表达vhh的wb图。图8b为对应的wb灰度分析图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

pgx19载体的构建

首先我们首先对ncgl2319基因的tsp进行鉴定，以确定转录出mrna的完整的5'utr。提取质量较好，无dna污染的谷氨酸棒杆菌总rna，利用cdna末端加多聚脱氧核糖核苷酸尾法5’race实验进行ncgl2319基因的转录起始位点(transcriptionstartpoint,tsp)鉴定。酶切位点为ctcgag，反转录引物为p1(cggtgtagtcgtggcggttgtagttga)，pcr鉴定引物为p2(cgcgtcgactagtacgggggggggg)和p3(agcactgcgtactcttcgtaggtgacttc)。5'race-pcr扩增后分别约在350bp和250bp处出现条带，其中350bp处条带较亮(图2)。对两条不同长度的条带分别进行胶回收，回收产物连接t载，将验证正确的单克隆送测序，测序结果鉴定出的tsp分别位于atg之前30bp和91bp处。短条带可能由于序列中存在某些rna酶的特异性攻击位点，在该位点降解rna所致。

用引物cacaggaaacagaattaattctcgagatcgagttcagccgatcacaaagat/acctgcaggcatgcaagcttcattagttgtcctccttttcagttgcct和cacaggaaacagaattaattctcgagcttcacccccaaagtctctaggagtatg/acctgcaggcatgcaagcttcattagttgtcctccttttcagttgcct分别对谷氨酸棒杆菌cgmcc1.15647基因组扩增，得到实验鉴定的谷氨酸棒杆菌内源ncgl2319基因完整的5′utr91(atg之前91bp)/5′utr30(atg之前30bp)以及atg起始位点之后的59bp、保守的sd序列(aaaggaggacaactaatg)等；随后将扩增片段与hindⅲ内切酶线性化过的pxmj19质粒利用同源重组酶重组，转化大肠杆菌感受态。过夜培养长出单克隆后，挑单克隆做菌落pcr验证，正确后送基因测序，得到载体pgs19(utr91)和pgx19(utr30)(图3、图4)。

将egfp片段克隆到质粒pgx19和pgs19上，转化大肠杆菌感受态，挑单克隆测序验证得到质粒pgx19-egfp和pgs19-egfp。原始载体pxmj19-egfp由本实验室保存。预先在大肠杆菌dh5α菌株中比较了egfp表达水平的差异，挑取正确的单克隆分别接种至10mllbb培养基，200r/min，30℃，培养24h。以2％的接种量将上述三株表达egfp的菌分别转接至2瓶含有10ml的lbb液体培养基中，一瓶加入iptg诱导，另一瓶为不诱导对照组。200r/min，30℃培养，在24h取样：每瓶取1ml菌液低温离心，弃上清，将od600调至0.5左右，使用荧光分光光度计检测od600和荧光强度。根据egfp最适检测波长，设置检测荧光强度时的参数为：激发波长488nm，发射波长507nm。od600表示菌体量，荧光测量值/od600用来表示egfp的单位表达水平。结果显示在大肠杆菌中原始载体pxmj19表达egfp荧光值为2145，增强型表达载体pgx19和pgs19分别为4309和3203，pgx19表达效果更好。

egfp增强绿色荧光蛋白的表达

为测试载体在谷氨酸棒杆菌中的表达能力差异，随后将上述质粒转入谷氨酸棒杆菌表达菌株中。挑取正确的单克隆分别接种至10mllbb培养基，200r/min，30℃，培养24h。以2％的接种量将上述三株表达egfp的菌分别转接至2瓶含有10ml的lbb液体培养基中，一瓶加入iptg诱导，另一瓶为不诱导对照组。200r/min，30℃培养，检测方法同上。结果显示原始载体pxmj19表达egfp荧光值为4304，增强型表达载体pgx19和pgs19分别为9610和8043，说明增强型载体pgx19和pgs19均可以显著提高外源蛋白egfp的表达水平，但载体pgx19的表达效果更好，是原始载体pxmj19-egfp的2.23倍，pgs19表达egfp水平是1.87倍(图6)。

sumo-nt-probnp和vhh的表达

将nt-probnp编码基因(genbank:mg766217)与sumo标签基因一同克隆到增强型质粒pgx19上，转化大肠杆菌感受态，挑单克隆测序验证，测序正确的质粒即为pgx19-sumo-nt-probnp。原始载体pxmj19-sumo-nt-probnp由本实验室保存。将两组质粒转化至谷氨酸棒杆菌表达菌株中，两株菌株均挑取正确单克隆接种至10mllbb中，再以2％的接种量转接至新鲜的lbb培养基中。200r/min，30℃培养4h后一瓶加入终浓度为1mmol/l的iptg诱导，24h后收集0.02g的菌体，pbs洗涤一遍，充分悬浮于1mlpbs中，超声破碎。蛋白免疫印迹(westernblot，wb)检测sumo-nt-probnp表达情况，采用imagej软件对wb检测结果图进行灰度分析。结果增强型表达载体pgx19表达sumo-nt-probnp水平是原始载体的2.11倍(图7)。

将vhh基因(genbank:jq068760.1)分别克隆至增强型表达载体pgx19和原始载体pxmj19上，后续检测步骤同上，wb检测结果显示增强型表达载体pgx19表达vhh水平是原始载体的1.7倍(图8)。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110>江南大学

<120>一种适用于谷氨酸棒杆菌的增强型表达载体

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>30

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

cttcacccccaaagtctctaggagtatgac30

<210>2

<211>91

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atcgagttcagccgatcacaaagatttttccgctaggcagtgatccgactcgcaccccct60

acttcacccccaaagtctctaggagtatgac91

<210>3

<211>59

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

atgacttcagctgaacagatcgttgatccaacagcccacgattcgggcaacaaggcaac59

<210>4

<211>18

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

aaaggaggacaactaatg18

<210>5

<211>89

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cttcacccccaaagtctctaggagtatgacatgacttcagctgaacagatcgttgatcca60

acagcccacgattcgggcaacaaggcaac89