一种抑郁症精准用药基因检测方法、引物探针组合及试剂盒与流程

本发明涉及基因检测领域，具体地涉及一种抑郁症精准用药基因检测方法、引物探针组合及试剂盒。
背景技术：
：抑郁症又称抑郁障碍，是常见的精神疾病。据世界卫生组织统计数据显示，到2020年，抑郁症将成为仅次于心脏病的第二大疾病。目前全球有3亿多人正遭受抑郁症困扰，中国抑郁症的患病率为6.1％,比全球平均水平高3个百分点，而且发病率近年来呈逐年上升趋势，按照6.1％的发病率折算，国内抑郁症患者已达到9000万。目前，治疗抑郁症最有效的手段为药物治疗，但是药物疗效和不良反应表现出显著的个体化差异。仅有30％-45％的患者在抗抑郁药物的治疗下可获得临床症状的缓解，10％的患者对任何抗抑郁药物治疗均无效，超过80％患者出现至少一种不良反应，包括恶心、呕吐、血压异常、头晕、头疼等。且抗抑郁药起效时间长，需要长期服药。因此，预测患者对抗抑郁药的疗效和不良反应，对于药物的选择、提高治疗效果、降低不良反应、缩短治疗时间和节省治疗费用具有十分重要的意义。导致药物治疗出现巨大个体化差异的原因，除了传统上的病理、生理、性别、年龄、身高、体重、依从性等方面外，遗传因素是影响药物反应差异的重要因素。其中药物代谢酶、转运蛋白、受体和其他药物作用靶点的基因多态性是引起药物效应和毒性个体差异的重要原因。目前，临床上对于抑郁症用药相关指导的关注较少，临床中缺乏对抑郁症用药指导的检测产品，使得较多抑郁症患者根据试误法选择治疗药物，承受多余的治疗费用，延长治疗时间，造成药物疗效不理想，甚至出现不良反应的情况。同时，临床中对抗抑郁药的关注集中在药物代谢酶部分，忽视药物相关转运蛋白、受体及其他作用靶点的作用。中国申请的专利“一种检测抑郁症个体化药物治疗基因多位点突变的特异性引物和探针及试剂盒”(申请号201810784442.8)公开了一种检测cyp2c19和cyp2d6代谢酶基因的试剂盒，通过检测cyp2d6*10、cyp2c19*2、cyp2c19*3、cyp2c19*17基因型，用于预测抗抑郁症药物的不良反应情况。其中对于药物代谢酶以外的相关基因并没有进行关注或检测，对于药物的疗效及不良反应的预测不够精准。技术实现要素：目前市场上缺乏针对抑郁症用药基因检测的产品,临床中对抗抑郁药主要关注药物的代谢基因，对于药物作用靶点的检测关注较少，仅通过对药物代谢基因的检测，对药物疗效预测不够准确。针对上述存在的问题，为抑郁症患者提供更精确的用药指导，本发明提供一种抑郁症精准用药基因检测方法、引物探针组合及试剂盒。本发明技术方案如下所述：一种抑郁症精准用药基因检测方法，其具体步骤包括：(1)根据基因位点的多态性序列，设计特异性引物和探针；(2)配制检测反应液；(3)从血液样本、口腔拭子、干血片等样本中提取基因组dna；(4)在检测反应液中加入待测样本基因组dna，检测基因组dna相关位点型别，获得检测数据；(5)根据设定的阈值，分析检测数据，得到样本中相关基因位点型别，并出具报告。进一步的，上述抗抑郁药物包括选择性5-ht再摄取抑制剂(ssri)、选择性5-ht及ne再摄取抑制剂(snri)、ne及特异性5-ht能抗抑郁药(nassa)、三环类抗抑郁药(tca)、四环类抗抑郁药等临床常用药物。进一步的，上述抗抑郁症药物相关基因包括cyp2d6、cyp2c19、fkbp5、htr2a、htr1a。进一步的，上述基因位点包含上述5个基因的11个多态性位点：序号基因型别rs号1cyp2d6c.2850c>t(*2、*41)rs169472cyp2d6c.1846g>a(*4)rs38920973cyp2d6c.100c>t(*4、*10)rs10658524cyp2d6c.4180g>c(*2、*4、*10、*41)rs11358405cyp2d6c.2988g>a(*41)rs283717256cyp2c19c.681g>a(*2)rs42442857cyp2c19c.636g>a(*3)rs49868938cyp2c19c.-806c>t(*17)rs122485609fkbp5c.-20+18122t>crs471391610htr2ac.614-2211t>crs799701211htr1ac.-1019g>crs6295本发明依据上述基因位点提供一套抑郁症精准用药基因检测引物探针组合：本发明提供一种含有上述特异性引物探针的试剂盒。进一步的，所述试剂盒还包括pcr反应液。进一步的，所述pcr反应液成分包括pcr反应缓冲液、引物、探针、dutp、ung酶。进一步的，所述试剂盒中各条引物浓度为0.1-1.0μm、各条探针浓度为0.1-1.0μm、dutp浓度0.01-0.2mm、ung酶0.1-1.0u。进一步的，所述试剂盒进行pcr反应的程序为：(i)50℃，5-10min；(ii)95℃，1min；(iii)95℃，15s；60℃，60s；40-45个循环。应当指出的是，本发明涉及对抗抑郁药物疗效和不良反应的预测的检测，并不涉及抗抑郁药物的具体使用。本发明的试剂盒检测结果，可以作为临床用药的参考，但一些非遗传因素(如食物、药物等)也可能影响药物的疗效及不良反应。因此，应结合患者病情、生活习惯及其他实验室检测指标等临床信息确定给药方案。附图说明图1cyp2d6基因rs1065852杂合型检测结果，fam荧光通道(野生型)和vic荧光通道(突变型)均检出扩增曲线(ct<35)。图2cyp2d6基因rs1135840杂合型检测结果，fam荧光通道(野生型)和vic荧光通道(突变型)均检出扩增曲线(ct<35)。图3cyp2c19基因rs4244285野生型检测结果，fam荧光通道(野生型)检出扩增曲线(ct<35)。图4fkbp5基因rs4713916杂合型检测结果，fam荧光通道(野生型)和vic荧光通道(突变型)均检出扩增曲线(ct<35)。图5htr1a基因rs6295纯合突变型检测结果，vic荧光通道(突变型)检出扩增曲线(ct<35)。图6htr2a基因rs7997012野生型检测结果，fam荧光通道(野生型)检出扩增曲线(ct<35)。具体实施方式以下通过具体实施例进一步描述本发明，但所述实施例并不以任何方式限定本发明专利保护的范围。实施例1引物和探针的设计依据常用抗抑郁药物在体内的代谢及效用情况，确定影响药物疗效及不良反应的基因及位点，相关基因包括cyp2d6、cyp2c19、fkbp5、htr2a、htr1a。基于上述所列基因，涉及11个不同的基因位点，具体位点如下表：序号基因型别rs号1cyp2d6c.2850c>t(*2、*41)rs169472cyp2d6c.1846g>a(*4)rs38920973cyp2d6c.100c>t(*4、*10)rs10658524cyp2d6c.4180g>c(*2、*4、*10、*41)rs11358405cyp2d6c.2988g>a(*41)rs283717256cyp2c19c.681g>a(*2)rs42442857cyp2c19c.636g>a(*3)rs49868938cyp2c19c.-806c>t(*17)rs122485609fkbp5c.-20+18122t>crs471391610htr2ac.614-2211t>crs799701211htr1ac.-1019g>crs6295基于上述位点，查找位点附近上下游200bp的序列，使用primerexpress3.0软件进行引物和探针的设计，引物18-25bp、探针选择mgb探针、探针长度13-25bp，经过精心设计、多次验证，获得基于taqman等位基因分析法的特异性引物和探针(seqidno.1—seqidno.44)，具体序列见下表：相关引物及探针在生工生物工程(上海)有限公司进行合成。使用时，合成的引物和探针使用灭菌纯化水配制成100μm的储存液，使用时再配制为10μm的工作液。实施例2试剂盒的制备一种同时检测cyp2d6/cyp2c19/fkbp5/htr2a/htr1a基因多态性的试剂盒，包含11管分别检测基因位点多态性的pcr反应液和2管质控品。根据实验摸索，pcr反应体系各成分使用量如下：组分用量(μl)pcr反应缓冲液5上游引物(f)(10μm)0.1-1.0下游引物(r)(10μm)0.1-1.0野生型检测探针(10μm)0.1-1.0突变型检测探针(10μm)0.1-1.0dutp(10mm)0.1ung酶(0.1u/μl)1样本dna(>0.5ng/μl)1-5灭菌纯化水补至20pcr反应缓冲液，采用赛默飞世尔科技(中国)有限公司的genotypingmastermix试剂。各条引物及探针的用量分别为：rs16947-f体积为0.4μl，rs16947-r体积为0.4μl，rs16947-pw体积为0.4μl，rs16947-pm体积为0.4μl，rs3892097-f体积为0.4μl，rs3892097-r体积为0.4μl，rs3892097-pw体积为0.4μl，rs3892097-pm体积为0.4μl，rs1065852-f体积为0.4μl，rs1065852-r体积为0.4μl，rs1065852-pw体积为0.4μl，rs1065852-pm体积为0.4μl，rs1135840-f体积为0.4μl，rs1135840-r体积为0.4μl，rs1135840-pw体积为0.4μl，rs1135840-pm体积为0.4μl，rs28371725-f体积为0.4μl，rs28371725-r体积为0.4μl，rs28371725-pw体积为0.4μl，rs28371725-pm体积为0.4μl，rs4244285-f体积为0.8μl，rs4244285-r体积为0.8μl，rs4244285-pw体积为0.4μl，rs4244285-pm体积为0.4μl，rs4986893-f体积为0.4μl，rs4986893-r体积为0.4μl，rs4986893-pw体积为0.4μl，rs4986893-pm体积为0.4μl，rs12248560-f体积为0.4μl，rs12248560-r体积为0.4μl，rs12248560-pw体积为0.4μl，rs12248560-pm体积为0.4μl，rs4713916-f体积为0.8μl，rs4713916-r体积为0.8μl，rs4713916-pw体积为0.8μl，rs4713916-pm体积为0.8μl，rs7997012-f体积为0.4μl，rs7997012-r体积为0.4μl，rs7997012-pw体积为0.4μl，rs7997012-pm体积为0.4μl，rs6295-f体积为0.6μl，rs6295-r体积为0.6μl，rs6295-pw体积为0.6μl，rs6295-pm体积为0.6μl。2管质控品分别为杂合型质控品和空白质控品，杂合型质控品由上述11个位点的野生型质粒和突变型质粒等量混合而成。质粒由生工生物工程(上海)有限公司合成，使用时稀释至104-107copies/μl作为工作液；空白质控品由灭菌纯化水制备。实施例3试剂盒的使用本发明可用于检测血液、口腔拭子、干血片等多种样本，现以2例抗凝血样本为例，说明实施例2中试剂盒的具体使用。(1)样本dna提取取2例抗凝血样本1-2ml，使用天根生化科技(北京)有限公司生产的血液基因组dna提取试剂盒(离心柱型)(货号：dp318规格：50/200人份)，按照说明书的操作进行dna提取。提取的dna使用超微量紫外分光光度计测定dna的浓度(≥0.5ng/μl)和纯度(1.6～2.0)。样本dna浓度调整为5-25ng/μl，作为待测模板。(2)配制反应体系取18μl检测反应液至pcr管中，每管加入2μl样本dna，配制成总体积20μl的反应体系，在abistepone实时荧光定量pcr仪上进行反应。反应条件为：(i)50℃，10min；(ii)95℃，1min；(iii)95℃，15s；60℃，60s；40个循环。每次延伸结束后采集荧光信号，反应结束后获得检测数据。(3)结果判定反应结束后，分析荧光曲线：首先进行质控品分析，空白质控品无扩增曲线出现且ct>38，杂合型质控品所有位点均有野生型和突变型扩增曲线且ct<35，说明本次检测合格，可以进行样本分析；样本结果分析时，位点野生型只有野生型扩增曲线且ct<35，纯合突变只有突变型扩增曲线且ct<35，杂合型同时具有野生型和突变型扩增曲线且ct<35。根据上述判定标准，2例样本的检出结果如下：实施例420例临床样本检测本案例中针对20例已知基因型的血液样本，采用实施例3中试剂盒的使用方法进行检测。具体操作步骤如下：(1)样本dna提取20例血液样本使用天根生化科技(北京)有限公司生产的血液基因组dna提取试剂盒(离心柱型)(货号：dp318规格：50/200人份)，按照说明书的操作进行dna提取。dna的浓度5-50ng/μl、纯度1.6～2.0，符合要求。(2)配制反应体系取18μl检测反应液至pcr管中，每管加入2μl样本dna，配制成总体积20μl的反应体系，在abistepone实时荧光定量pcr仪上进行反应。反应条件为：(i)50℃，10min；(ii)95℃，1min；(iii)95℃，15s；60℃，60s；40个循环。每次延伸结束后采集荧光信号，反应结束后获得检测数据。(3)结果判定反应结束后，分析荧光曲线：首先进行质控品分析，空白质控品无扩增曲线出现且ct>38，杂合型质控品所有位点均有野生型和突变型扩增曲线且ct<35，说明本次检测合格，可以进行样本分析；样本结果分析时，位点野生型只有野生型扩增曲线且ct<35，纯合突变只有突变型扩增曲线且ct<35，杂合型同时具有野生型和突变型扩增曲线且ct<35。根据分析结果可以得到实验结论，20例样本中，cyp2d6*1/*1型(野生型)10例、*1/*10型4例、*10/*10型3例、*2/*10型2例、*1/*2型1例，cyp2c19*1/*1型(野生型)18例、*1/*2型2例，fkbp5rs4713916杂合突变1例，htr1ars6295杂合突变4例、纯合突变1例，与已知sanger检测结果相同。由上可见，本发明通过检测抗抑郁症药物包括cyp2d6、cyp2c19、fkbp5、htr2a、htr1a的5个相关基因的11个位点，进而确定相关基因位点型别，经过分析即可对临床抑郁症用药进行指导，通过与sanger测序结果相比，本发明所述的方法准确度，操作简单，可以大大提高基因型的检测效率。序列表<110>广州海思医疗科技有限公司<120>一种抑郁症精准用药基因检测方法、引物探针组合及试剂盒<160>44<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1ccccgttctgtcccgagta19<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gggtgtcccagcaaagttca20<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3agaacctgcgcatagmgb18<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4tgagaacctgtgcatagmgb20<210>5<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ggtgggtgatgggcagaag19<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ggaagcgagggtcgtcgta19<210>7<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7ccaggacgcccctmgb16<210>8<211>15<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8ccccaagacgccmgb15<210>9<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9ctgctcctggtggacctgat20<210>10<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10cccatgtttgctggtggtg19<210>11<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11cacgctacccaccagmgb18<210>12<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12cacgctactcaccamgb17<210>13<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13cttcctcttcttcacctccctg22<210>14<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14acatctgctcagcctcaacgt21<210>15<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>15tggtggtgagcccamgb17<210>16<211>17<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>16ctggtgaccccatcmgb17<210>17<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17atagtggtggctgacctgttctc23<210>18<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18actccttcttgcctcctatgttg23<210>19<211>16<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>19gagggaggaagggmgb16<210>20<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>20agggagaaagggtacmgb18<210>21<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>21aattacaaccagagcttggcatat24<210>22<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>22caatcaataaagtcccgagggt22<210>23<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>23tatttcccgggaaccmgb18<210>24<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>24gattatttcccaggaacmgb20<210>25<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>25gcaatgtgatctgctccattattt24<210>26<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>26tgtacttcagggcttggtcaatat24<210>27<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>27tggatccaggtaaggmgb18<210>28<211>18<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>28gaatccaggtaaggcmgb18<210>29<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>29gcagtgatggagaagggagaa21<210>30<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>30ctgggatttgagctgaggtctt22<210>31<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>31ctcaaagcatctctgamgb19<210>32<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>32ttctcaaagaatctctmgb19<210>33<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>33cctggcctcctaaagtgctg20<210>34<211>25<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>34catgtcacaagggtttgttgtagag25<210>35<211>21<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>35tttcctctatcttggtccmgb21<210>36<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>36tacattttcctctgtcttgmgb22<210>37<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>37aggaaagaacgctgagttgatgt23<210>38<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>38gtcatttatctccaccttccaaga24<210>39<211>24<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>39caaagacttaattaacaatatmgb24<210>40<211>23<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>40aaagacttaattgacaatatmgb23<210>41<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>41gagcctgaatgggaaggtga20<210>42<211>22<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>42gtcgtcgttgttcgtttgtttt22<210>43<211>20<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>43tgtgtcttcctttttaamgb20<210>44<211>19<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>44gtgtcttcgtttttaamgb19当前第1页12