一种制备重组病毒的方法及其应用与流程

本发明属于基因工程技术领域，更具体地，涉及一种制备重组病毒的方法及其应用。

背景技术：

接种疫苗是隔绝动物与人类之间疾病传染渠道的重要方式之一。目前，我国已针对不同疫病类型研制出了多种疫苗，其中就包括基因工程疫苗。随着重组技术的快速发展，基因工程疫苗也在动物传染病防治中得到了更为广泛的应用，并为提升传染病防治效果奠定了坚实基础。

近年来，重组病毒载体疫苗受到了广泛的重视，它是将外源保护性抗原基因插入到病毒基因组内获得，重组病毒免疫机体后表达出相应的目的蛋白，从而诱导免疫应答的一类载体疫苗。重组病毒载体疫苗具有插入外源基因长，接种途径多，能诱导体液免疫和细胞免疫反应及易生产制备等优点，且能克服传统疫苗的某些弊端，能极大地提高疾病的预防性，已在疫苗研制中得到了广泛的应用。

目前用于病毒基因工程的主要的修饰技术有以下四个方面：

reca蛋白介导的同源重组缺点是：首先需要较长的同源臂，只能利用大肠杆菌操作较为局限，操作步骤复杂繁琐，假阳性率较高等；cre/loxp介导的修饰技术：优点是时空特异、高效性(不受靶基因大小和位置影响)、准确性(非特异性重组少)、快速性，缺点是步骤繁琐，成本高；tn转座子可以介导基因突变和随机插入，缺点是不能定点插入，插入的拷贝数不易控制，效率低。可见，普通的同源重组需要长达几百甚至几千个碱基的同源臂，且容易受限制性酶切位点的限制，使用起来不够灵活。

技术实现要素：

本发明针对于以上问题，提供一种快速、准确，操作简单的一种制备重组病毒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

s1：将待选病毒的基因组与受体载体同源重组，得到病毒载体质粒；

s2：选取含有双向筛选基因的质粒，针对该双向筛选基因设计引物进行扩增，得到含有同源臂的双向筛选基因的扩增产物，其中，所述双向筛选基因包括抗性筛选基因和反向筛选基因，所述抗性筛选基因包括卡那霉素抗性基因(knr)、苄霉素抗性基因(amp)、潮霉素(hyg)或氯霉素抗性基因(cmr)中的一种或多种，且所述含双向筛选基因的质粒与步骤s1中的受体载体的抗性不同，所述反向筛选基因包括ccdb，scab，rpsl，tetr，phes，galk，thya或tolc中的一种或多种；

s3：将步骤s1所述病毒载体质粒与步骤s2所述扩增产物共同转入感受态细胞1，抗性筛选得到含有双向筛选基因和病毒载体基因的重组质粒，其中所述感受态细胞1为可容纳步骤s2中反向筛选基因的并且能表达redα/β重组酶的工程菌；

s4：将含有同源臂目的基因的基因表达盒和步骤s3所述重组质粒共同转入感受态细胞2，筛选得到用ha替换掉双向筛选基因的重组质粒，经拯救即为同时对待选病毒和加载抗原免疫的重组病毒，其中，感受态细胞2为能表达redα/β重组酶，但不能容纳步骤s2中反向筛选基因的工程菌。

该方法是以感染性克隆的病毒载体作为基础，利用red/et重组技术和ccdb反向筛选技术通过两步同源重组得到含有目的基因的重组病毒。本重组系统安全可靠，并可实现稳定表达。

上述方法中，步骤s1中待选病毒的基因组与受体载体同源重组方法是公知，传统的同源重组的方法是通过在受体载体的插入位点两端引入与目标基因同源的同源臂，在含有重组酶的工程菌体内完成的同源重组。

进一步，所述步骤s1中基因组为dna或cdna。

本方法适用于以dna为主要遗传物质的病毒，也适用于以rna为主要遗传物质的病毒，只需将rna反转录成cdna即可进行上述步骤。

进一步，所述步骤s1中受体载体为质粒载体、噬菌体载体或人工染色体载体中的一种。

进一步，所述步骤s2中双向筛选基因为ccdb-amp，所述步骤s3中感受态细胞1为gbredgyra462e.coli。

ccd操纵子存在于大肠杆菌的f质粒上，是一种毒素-抗毒素系统，该系统由ccda和ccdb两部分组成，其中，ccdb是毒蛋白，只有ccdb基因的表达会导致一般的宿主细胞(如感受态细胞2)死亡，本发明中通过两种感受态细胞对ccdb的容纳性的不同(如ccdb基因可在感受态细胞1中表达和生存)将含有筛选基因ccdb的重组质粒和替换掉ccdb的质粒筛选出来，简化了筛选步骤，阳性率高，使用更简单高效。

进一步，所述步骤s3中同源臂位于待选病毒插入位点两端，所述同源臂的核苷酸序列为35～50bp。

一种所述制备重组病毒方法在制备疫苗中的应用。

上述制备重组病毒的方法应用于疫苗领域时，步骤s1中待选病毒为对被免疫宿主安全，能引起有效的免疫应答且可容纳外源基因的病毒，例如hvt，ibv，ndv，prv或adv。

进一步，所述疫苗为表达h9n2禽流感病毒ha基因的传染性支气管炎病毒。

一种表达ha基因的传染性支气管炎病毒rh120-δ5a/h9ha，所述ha基因的序列如seqidno.1所示，其保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏号为cctccno：v201931。

进一步，所述rh120-δ5a/h9ha，通过以下方法制备：

s1：利用质粒载体p15a构建传染性支气管炎病毒疫苗株h120的病毒质粒载体p15a-h120；

s2：以质粒pbr322-kanr-amp-ccdb-rpslneo为模板，扩增含有同源臂的amp-ccdb双向筛选标记基因表达盒；

s3：将步骤s1中病毒质粒载体p15a-h120与步骤s2中amp-ccdb双向筛选标记基因表达盒共同转入感受态的gbredgyra462菌体细胞中，同源重组获得重组质粒p15a-h120-amp-ccdb；

s4：将含有如seqidno.1所示的ha基因的基因表达盒和步骤s3所得质粒p15a-h120-amp-ccdb共同转入感受态gbdire.coli中，筛选获得重组质粒p15a-h120-ha；

s5：构建辅助质粒pvax1-h120n，将步骤s4所述重组质粒p15a-h120-ha与辅助质粒pvax1-h120n共同转染bsr-t7细胞，收集转染上清液再转入鸡胚中，传代获得表达ha基因的传染性支气管炎病毒rh120-δ5a/h9ha。

为了实现上述目的，本发明具体采用以下技术方案：

首先构建含有h120全基因组cdna的感染性克隆载体，第一步在表达重组蛋白redα/redβ的gbredgyra462大肠杆菌中，通过“线-环”重组，用筛选标记基因amp-ccdb替换p15a-h120中的5a基因，获得p15a-h120-δ5a/amp-ccdb，酶切制备线性化载体p15a-h120-δ5a/amp-ccdb。第二步在gbred大肠杆菌中，利用“线-环”重组，目的基因与线性载体p15a-h120-δ5a/amp-ccdb发生重组，实现外源基因替换amp-ccdb基因，得到插入位点在5a处的p15a-h120-δsa/h9ha。第三步拯救得到重组病毒rh120-δ5a/h9ha。

相对于现有技术，本发明具有如下的优点及效果：

本发明所使用的方法步骤简单，能准确快速的实现重组病毒的构建，且构建成功的重组病毒具有能容纳多个大片段外源基因，实现多位点定向插入，无痕迹插入，筛选标记方便的优点，最终形成一个可表达多种抗原基因的重组病毒，应用于载体疫苗，还具有宿主范围广，生产制备方法容易，安全性好，同时诱导多种免疫反应，无需添加佐剂，从而也降低佐剂引发不良反应的概率。

生物材料保藏信息

分类命名：鸡传染性支气管炎病毒ibvrh120-δ5a/h9ha，拉丁学名：infectiousbronchitisvirus，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏日期：2019年5月13日，保藏编号为cctccno：v201931。

附图说明

图1为pcr扩增制备含有同源臂的筛选标记基因，其中1：δ5a/amp-ccdb；2：空白对照；m：dnamarkerdl2，000。

图2为重组质粒p15a-h120-δ5a/amp-ccdb酶切鉴定，其中a：p15a-h120-δ5a/amp-ccdb酶切snapgene软件预测，b：p15a-h120-δ5a/amp-ccdb经xhoi和bstz17i酶切；m：neb1kbdnaladder。

图3为反向筛选标记基因功能验证。

图4：为pcr扩增制备含有同源臂的h9ha基因，其中1：δ5a/h9ha；2：空白对照；m：dnamarkerdl2，000。

图5为重组质粒p15a-h120-δ5a/h9ha酶切鉴定，其中a：p15a-h120-δ5a/h9ha酶切snapgene软件预测，b：p15a-h120-δ5a/h9ha经xhoi和bstz17i酶切；m：neb1kbdnaladder。

图6为pcr扩增rh120f5株及h120-δ5a/h9haf5株s1、m及5ab基因，其中1-3：rh120f5株s1、m及5ab基因；4-6：h120-δ5a/h9haf5株s1、m及δ5a/h9ha基因；7：阴性对照；m：dnamarkerdl5，000。

图7为间接免疫荧光检测rh120-δ5a/h9haf5重组病毒的外源基因表达其中a：重组病毒rh120-δ5a/h9haf5感染的ck细胞；b：rh120f5感染的ck细胞；c：空白cef细胞)

图8为重组病毒rh120-δ5a/h9haf5鸡胚增殖曲线。

图9为pbr322-kanr-amp-ccdb-rpslneo结构示意图。

图10为p15a结构示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1

1)感染性克隆p15a-h120的构建

根据genbank公布三个全基因序列(包含5’-utr、3’-utr及ploy(a))：fj888351、fj807652和gu393335，将h120全基因序列分成4段进行分段克隆至含有同源臂的pbr322载体上，形成pbr322-h120a～d，相邻两段间含有50-70bβ重叠区域作为重组同源臂。5’端第一段h120-a在克隆过程中通过pcr添加t7启动子。各片段克隆需进行酶切鉴定及测序验证序列正确性，然后通过酶切获得四片段dna(h120-a～d)。以质粒puc57-hdvr-t7ter为模板pcr扩增含有基因组3’同源臂的hdvr-t7ter序列作为h120感染性克隆第5段序列。利用red/et重组技术将h120-a～d、hdvr-t7ter和含有同源臂的线性载体p15a结构见图10，在e.coli中组装，形成感染性克隆p15a-cm-t7promotor-h120genome-hdvribozyme-t7terminator(简称p15a-h120)。

2)筛选标记基因δ5a/amp-ccdb的pcr扩增

以质粒pbr322-kanr-amp-ccdb-rpslneo结构见图9为模板，pcr扩增含有同源臂的筛选标记基因δ5a/amp-ccdb。所用引物如下：

δ5a/amp-ccdb-f：

5‘acctacactacttacttgtaataagggcgtttggacttacaagcgcttaacaaatacagacggcgatcgctttgtttatttttctaaatac3’

δ5a/amp-ccdb-r：

5‘ctggcttttttttgaacaaagcgatcgcgcatatacgcccacccaatcgctggtatgaataatagtaaagataatccttttcgcggagcaat’3

反应体系见表1，pcr扩增参数为98℃2min；98℃10s；55℃5s；72℃，20s；扩增35个循环；最后于72℃延伸5min。pcr产物取5ul经1％琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果，结果见图1，剩余pcr产物用pcr产物回收试剂盒回收和纯化，并测定核酸浓度，测序验证序列正确性。

表1primestarmaxdnapolymerase聚合酶pcr反应体系

电泳结果显示，pcr获得含有同源臂的筛选标记基因ccdb-amp。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳，产物大小1.5kb左右，与预期一致(图1)。

回收纯化的pcr产物用限制性内切酶dpni酶切消化以清除质粒模板，酶切体系按表2配制，37℃反应2h，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果，并用凝胶回收试剂盒回收和纯化酶切产物，测定核酸浓度。

表2酶切鉴定

3)筛选标记基因与p15a--h120电转gbredgyra462感受态

gbredgyra462电转感受态制备：取无菌2ml离心管，盖子用2ml注射器针头打孔，加入1.8ml含有链霉素的lb培养基，挑取gbredgyra462单菌落接种至2ml离心管中，30℃，260rpm振摇培养过夜。第二天，取无菌1.5ml离心管，盖子用2ml注射器针头打孔，加入1.4ml无抗生素的lb培养基，再加入40μl过夜菌液，30℃，260rpm振摇培养2h，然后加入35μl10％l-阿拉伯糖溶液，37℃，260rpm振摇培养50min诱导表达redα/redβ重组蛋白。此后菌液操作应置于冰上，灭菌纯水提前预冷，离心机应提前预冷至2℃，菌液2℃离心，9000rpm，30s；弃上清，加预冷纯水1ml，吹打重悬菌体，菌液2℃离心第二次，10000rpm，30s；弃上清，加预冷纯水1ml，吹打重悬菌体，菌液2℃离心第三次，11000rpm，30s，弃上清，加预冷纯水30μl重悬。感受态制备后应置于冰上，立即使用。

第一次重组过程：将洁净无菌的电击杯放置于超净台内通风干燥，置于冰上预冷。将筛选标记基因ccdb-amp与p15a-h120各500ng加入刚制备的gbredgyra462电转感受态中，用手拨打1.5ml离心管管底轻轻混匀，转移至1mm电击杯中，将电击杯放置于电转仪中，按设定的red/et电转程序进行电转，电转参数1350v，10μf，600ohms。电转完成后立即加入1mlsoc培养基至电击杯中，将菌体重悬并转移至2ml离心管中。将电转后的菌液放置于37℃摇床，260rpm振摇培养60min完成重组及抗性复苏。将菌液放置于离心机中，3000rpm离心1min沉淀菌体，吸弃大部分上清液，保留200μl上清并吹打重悬，全部涂布于含有氨苄霉素的lb平板，将平板放置于37℃培养，先正置1h后倒置培养12-16h。

含有筛选标记基因的重组质粒筛选：从平板上挑取菌落，接种于500μl含有氨苄霉素的lb液体培养基中，37℃，260rpm振摇培养6h后，取100μl菌液接种于10ml含有氨苄霉素的lb液体培养基中扩大培养。37℃，260rpm振摇培养6h后，取5ml菌液用质粒小提试剂盒抽提质粒并进行限制性内切酶酶切鉴定，酶切体系按表3配制，37℃反应2h，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果，鉴定正确的质粒送华大基因公司进行测序，测序正确的重组质粒命名为p15a-h120-δ5a/amp-ccdb。

表3酶切鉴定体系

结果显示，线性筛选标记基因ccdb-amp与环状p15a-h120质粒在表达redα/redβ重组蛋白的gbredgyra462大肠杆菌中发生线-环重组，筛选标记基因与5a基因发生替换，产生重组质粒，通过amp抗性筛选，质粒酶切鉴定(图2)及测序鉴定筛选出正确的重组质粒。重组质粒分别命名为p15a-h120-ccdb-amp。

筛选标记基因功能验证：制备的重组质粒p15a-h120-ccdb-amp分别电转gbredgyra462和gbred电转感受态(不需要诱导表达重组蛋白)。转化复苏后将菌液涂布于含有氨苄霉素的lb平板，将平板放置于37℃培养过夜，观察大肠杆菌生长情况。

重组质粒p15a-h120-δ5a/amp-ccdb电转gbred和gbredgyra462感受态后复苏，涂板过夜培养，gbredgyra462可以长出大量菌落，而gbred不能或长出极少量菌落(图3)，说明反向筛选标记基因ccdb可以正常表达。

电转p15a-h120-δ5a/amp-ccdb的gbredgyra462正常生长，可以长出大量菌落，而gbred不能或仅长出极少量菌落。

4)抗原基因替换筛选基因的重组

扩增含有同源臂的抗原基因δ5a/h9ha：

按照rneasyplusminikit的说明书提取禽流感病毒a/chicken/guangdong/yf/2018的rna。

取上述rna按反转录试剂盒说明进行反转录，得到cdna作为模板，扩增得到含有同源臂的ha基因。

引物：δ5a/h9ha-f：

accacctacactacttacttgtaataagggcgtttggacttacaagcgcttaacaaatacagacgatggagacagtatcactaataac

δ5a/h9ha-r：

ctctaatccttctctcagataaattcgcgcttttcttgctattgctccgcgaaaaggttattatatacaaatgttgcatctg

反应体系同表1：pcr反应条件是98℃预变性5min，98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸20s，完成35个循环；72℃延伸10min。

扩增结果见图4.

gbred电转感受态制备：制备过程同gbredgyra462电转感受态制备，也需要用l-阿拉伯糖诱导表达redα/β重组蛋白。感受态制备后应置于冰上，立即使用。

第二次重组过程：将洁净无菌的电击杯放置于超净台内通风干燥，置于冰上预冷。将含有同源臂的ha基因δ5a/h9ha与线性载体p15a-h120-δ5a/amp-ccdb各500ng加入刚制备的gbred电转感受态中，按第一次重组的方法与程序进行电转和复苏。将复苏菌液3000rpm离心1min沉淀菌体，吸弃大部分上清液，保留200μl上清并吹打重悬，全部涂布于含有氯霉素的lb平板，将平板放置于37℃培养，先正置1h后倒置培养12-16h。

重组质粒筛选

从平板上挑取菌落，扩摇菌液、提取质粒进行酶切鉴定。酶切结果见图5，鉴定正确的菌液取5ml加入至200ml含有氯霉素的lb液体培养基中扩大培养，37℃，260rpm振摇培养16h后，按无内毒素质粒大量提取试剂盒说明书提取质粒，置于-20℃冻存。取少量质粒送华大基因公司对重组基因部分进行测序验证。验证正确的重组质粒命名为p15a-h120-δ5a/h9ha。

5)重组病毒的拯救

转染前一天将bsr-t7细胞传代至六孔板，当细胞生长至80％左右时将培养基换成2％血清，不含双抗及g418的gmem培养基。取重组质粒p15a-h120-ha和辅助质粒pvax1-h120n各1ug(六孔板每孔dan转染量)，按照脂质体转染试剂lipofectamine3000reagent(invitrogen)说明书配制转染体系并加入细胞培养液中，细胞置于37℃，5％co2培养箱培养4h后将培养基换成2％血清，含g418的gmem培养基继续培养。48h后，将培养皿置于-80摄氏度冷冻，常温融化，反复冻融两次破碎细胞，收获细胞上清命名为f0。细胞上清经尿囊腔接种10日龄spf鸡胚5枚，0.2ml/枚，37℃孵化。接种后24小时观察鸡胚并弃去死亡鸡胚。接种后48h收获鸡胚尿囊液并继续鸡胚传代，盲传5代并收获第5代鸡胚尿囊液命名为rh120f5，经0.22μm滤膜过滤后分装保存于-80℃。

实验例1

拯救病毒的鉴定

rt-pcr检测

取200μlrh120f5株及rh120-δ5a/h9haf5病毒液按axyprep体液病毒dna/rna小量抽提试剂盒说明书提取病毒rna，提取获得的rna溶于40μlrnase-freetebuffer，取10μlrna按recombinantdnasei(rnase-free)(takara)说明书清除dna。

以上述rna为模板，引物

m-f：5’-cctaagaacggttggaat-3’；

m-r：5’-tactctctacacacacac-3’；

s1-f：5’-aagactgaacaaaagaccgact-3’；

s1-r：5’-caaaacctgccataactaacata

-3’5ab-f：accacctacactacttacttg；

5ab-r：attatctgtgtgttcctcacaag

按一步法rt-pcr试剂盒primescript^tmonesteprt-pcrkitver.2说明书扩增扩增m、s1及5ab基因。pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察扩增结果见图6，并送上海生工生物工程公司测序。

间接免疫荧光(ifa)

为了鉴定重组病毒外源蛋白的表达，将拯救的rh120f5及重组病毒h120-δ5a/h9ha按100moi毒量接到长成新鲜制备的单层原代ck上，同时设空ck对照，接毒前细胞培养液换成含2％胎牛血清dmem培养液，培养于37℃、5％co2的细胞培养箱中。接毒36h，通过间接免疫荧光(ifa)检测拯救的重组病毒h120-δ5a/h9ha的外源基因表达。将细胞培养基吸掉，用热pbs洗两遍；用4％多聚甲醛室温固定15-20min；pbst洗细胞3次，5min/次；打孔：使用0.4％-0.5％的triton-100(pbs)，即triton-100∶pbs＝0.4∶100，孵育15-20min；pbst洗细胞3次，5min/次；封闭：用5％bsa室温下封闭30min或者4℃过夜；一抗(抗h9亚型ha基因的单抗)，室温孵育1h；pbst洗细胞3次，5min/次；避光，二抗(fitc标记的羊抗兔igg)，室温孵育1h；避光，pbst洗3次，每次5min/次；避光，核染色：dapi∶pbs＝1∶200，孵育15min；避光，pbst洗3次，每次5min/次。用荧光显微镜拍照结果见图7。

rh120-δ5a/h9ha病毒生长曲线测定

将rh120-δ5a/h9ha及rh120用生理盐水稀释，经尿囊腔接种10日龄spf鸡胚各30枚，100eid50/胚。分别于接种后6h，12h，24h，36h和48h各收获5枚鸡胚的病毒尿囊液，混合后分装，置于-80℃冻存。采用reed-muench法测定不同时间点病毒eid50。