一种肝癌细胞抑制剂及其制备方法与流程

本发明涉及抗癌药物技术领域，具体涉及肝癌细胞抑制剂及制备方法。

背景技术：

肝癌即肝脏恶性肿瘤，可分为原发性和继发性两大类。原发性肝脏恶性肿瘤起源于肝脏的上皮或间叶组织，前者称为原发性肝癌，是我国高发的，危害极大的恶性肿瘤；后者称为肉瘤。原发性肝癌的病因及确切分子机制尚不完全清楚，目前认为其发病是多因素、多步骤的复杂过程，受环境和饮食双重因素影响。流行病学及实验研究资料表明，乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染、黄曲霉素、饮水污染、酒精、肝硬化、性激素、亚硝胺类物质、微量元素等都与肝癌发病相关。现有的肝癌治疗方法包括手术治疗，化学药物治疗，放射治疗，生物治疗，中医中药治疗等方式。放疗、化疗的药物大多为化学药物，可以达到控制癌细胞的发展，缓解症状的作用，但由于化疗药物毒副作用大，对身体伤害大，同时免疫能力低下产生一系列并发症，不良反应大，很多患者难以承受，最终只能停药或者放弃治疗。

目前研究出能选择性抑制癌细胞的生长扩散或杀死癌细胞，而对正常细胞毒复作用小，且在长期用药条件下仍能保留其疗效的抗肿瘤药物是目前研究的重点。

技术实现要素：

本发明的目的就是提供一种肝癌细胞抑制剂及制备方法。该抑制剂具有稳定性好，合成方法简单，产率高，抑制能力强的特点，同时具有很强的抗肿瘤活性，能为抗肝癌药物的研发提供理论指导。

本发明的技术方案：

一种肝癌细胞抑制剂，其结构式如下：

本发明的肝癌细胞抑制剂化学名称为：二氯化·2-(2,5-二甲氧基苯)咪唑[4,5-f][1,10]邻菲罗啉·(1S,2S)-环己二胺合铂(II)，简写为MPP-Pt-S，其具有手性。

本发明的肝癌细胞抑制剂中铂是二价金属阳离子。

本发明的肝癌细胞抑制剂的分子量为736.20。

本发明的肝癌细胞抑制剂的制备方法包括如下步骤：将(H-MPP)PtCl2溶于无水甲醇中，65℃水浴加热，搅拌溶解后得黄色固体悬浮液，再向其加入(1S,2S)-(+)-1,2-环己二胺(R-DACH)，(H-MPP)PtCl2与(1S,2S)-(+)-1,2-环己二胺的摩尔比为1:8；混合后继续在65℃加热回流使悬浮液达到完全溶解状态，并趁热过滤除去不溶性固体，在常温下等待滤液缓慢挥发析出红色沉淀；再进行重结晶，待液体蒸只剩30％以下后，向其加入丙酮析出红色固体，过滤得到肝癌细胞抑制剂配合物产物(MPP-Pt-S)。

作为技术方案的优选，所述红色沉淀用乙醇和水按照体积比3:1进行重结晶。

本发明中的(H-MPP)PtCl2的制备包括如下步骤：

(1)化合物(H-MPP)的合成

按照摩尔比为1:1-2准确称取1,10-邻菲罗啉-5,6-二酮和2,5-二甲氧基苯甲醛溶于冰乙酸中，在80-85℃油浴下搅拌均匀后，加入乙酸铵，乙酸铵加入量与1,10-邻菲罗啉-5,6-二酮的摩尔比为1:20，然后升温至130℃回流反应7h，取出冷却至室温后，在冰浴条件下搅拌加氨水调节溶液至中性，产生大量粉红色沉淀析出，抽滤，重结晶，过滤干燥得粉红色产物即为主配体2-(2,5-二甲氧基苯)咪唑[4,5-f][1,10]邻菲罗啉，记作H-MPP；

(2)化合物(H-MPP)PtCl2的合成

称取配体H-MPP溶于二甲基亚砜DMSO中，120℃油浴搅拌至完全溶解，再降温到60℃，搅拌添加氯亚铂酸钾溶液，配体H-MPP与氯亚铂酸钾的摩尔比为5:3，有黄色沉淀析出，继续搅拌2h，趁热抽滤以除去未反应的氯亚铂酸钾和H-MPP配体，依次用DMSO，水和乙醇洗涤，将得到的黄色固体溶于乙醇中，80℃水浴回流20min后，趁热过滤，并用丙酮洗涤固体，滤饼干燥得中间体(H-MPP)PtCl2；

作为技术方案的优选，所述步骤(2)中氯亚铂酸钾溶液的制备是每克氯亚铂酸钾中添加8mL水中，然后在60℃下溶解，用滴加入4mL DMSO，继续搅拌溶解均匀后得到氯亚铂酸钾溶液。

作为技术方案的优选，所述步骤(2)中二甲基亚砜的加入量为每摩尔H-MPP加1000-1100mL。

本发明的肝癌细胞抑制剂在制备抗肝癌药物中应用。

本发明的化学反应式：

本发明各组分在肝癌细胞抑制中的作用：

铂(II)的作用：与DNA的某些亲核基团(如磷酸氧位点或碱基氮、氧位点)直接螯合，引起癌细胞的DNA损伤，使DNA在复制和转录当中受到障碍，从而阻止了癌细胞的生长和分裂，并导致其死亡。

二氯化·2-(2,5-二甲氧基苯)咪唑[4,5-f][1,10]邻菲罗啉·(1S,2S)-环己二胺合铂(II)的作用：有利于插入DNA的双螺旋的碱基对之中。

本发明的肝癌细胞抑制剂对肝癌细胞的抑制作用尤为良好，对肝癌细胞BEL-7404的IC50达到3.3μM。

本发明的有益效果：

本发明的肝癌细胞抑制剂，分子结构稳定，合成方法简单。一方面，该肝癌细胞抑制剂中，由于2-(2,5-二甲氧基苯)咪唑[4,5-f][1,10]邻菲罗啉的引入，大大增强了配合物的细胞跨膜能力，在苯环上其含有的两个甲氧基可通过空间效应或电子效应增强了细胞毒活性。另一方面，该抑制剂含有的手性中心反式环己二胺载体的引入有效改善了抑制剂的水溶性；反式环己二胺的共平面性使得抑制剂更容易沿着DNA分子的大凹槽接近DNA，进一步与DNA碱基相发生互作用,诱导癌细胞凋亡表现细胞毒活性。此外，抗肿瘤实验表明，该类配合物具有很强的抗肿瘤活性，其对肝癌(BEL-7404)增殖的抑制能力比顺铂好，在抗肿瘤药物方面将具有极大的应用潜力，为制备抗人肺腺癌、胃癌和肝癌药物提供理论指导。

附图说明

图1为本发明肝癌细胞抑制剂的结构式。

图2为本发明肝癌细胞抑制剂的红外光谱图，MPP-Pt-S的红外光谱数据为IR(KBr):3318.39,2936.18,1626.81,1582.26,1545.34,1508.51,1473.35,1376.65,1355.90,1339.09,1324.59,1290.81,1262.95,1217.84,1177.10,1152.09,1104,76,1037.89,946.98,882.14,842.80,812.26,746.37,714.44,619.15。

图3为本发明肝癌细胞抑制剂的核磁共振氢谱图，MPP-Pt-S的氢谱数据为¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.27(s,2H),8.97(s,2H),8.08(s,2H),7.65(s,1H),7.34(s,2H),7.15(d,J＝8.8Hz,1H),7.02(d,J＝8.8Hz,1H),6.64(s,2H),3.92(s,3H),3.84(s,3H),2.61(s,2H),2.17(s,2H),1.67(s,2H),1.56(s,2H),1.24(s,2H)。

图4为本发明肝癌细胞抑制剂的核磁共振碳谱图，MPP-Pt-S的氢谱数据为¹³C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ153.56,151.85,141.93,134.11,116.32,114.48,61.95,57.21,56.01,32.28,24.53。

图5为本发明肝癌细胞抑制剂的质谱图，MPP-Pt-S的质谱为ESI-MS m/z:665.20[M-2Cl]²⁺。

图6为本发明实施例1的肝癌细胞抑制剂MPP-Pt-S对5种人肿瘤细胞人肺腺癌(A549)、肝癌(BEL-7404)、卵巢癌(SK-OV-3)、宫颈癌(HeLa)、胃癌(MGC80-3)和正常人肝细胞(HL-7702)的半抑制浓度(IC50)的柱状图。

图7为本发明抑制剂在AnnexinV-FITC/PI双染色法检测MPP-Pt-S(3.33μM)对BEL-7404细胞作用24h后的凋亡情况。

图8为本发明抑制剂在JC-1检测MPP-Pt-S(3.33μM)对BEL-7404细胞线粒体膜电位变化。

图9为本发明抑制剂在Western Blot检测MPP-Pt-S(3.33μM)对BEL-7404细胞凋亡和周期相关蛋白表达量分布图。

具体实施方式

下面通过实施例结合附图对本发明作进一步说明。

以下实施例中，

H-MPP：2-(2,5-二甲氧基苯)咪唑[4,5-f][1,10]邻菲罗啉；

(H-MPP)PtCl2：二氯2-(2,5-二甲氧基苯)咪唑[4,5-f][1,10]邻菲罗啉合铂(II)；

MPP-Pt-S(肝癌细胞抑制剂)：本发明产品，二氯化·2-(2,5-二甲氧基苯)咪唑[4,5-f][1,10]邻菲罗啉·(1S,2S)-环己二胺合铂(II)。

实施例1

一、本发明的制备方法：

(1)化合物2-(2,5-二甲氧基苯)咪唑[4,5-f][1,10]邻菲罗啉(H-MPP)的合成

准确称取0.21g(1mmol)1,10-邻菲罗啉-5,6-二酮，0.166g(1mmol)2,5-二甲氧基苯甲醛溶于10mL冰乙酸中，80℃油浴下磁力搅拌30min后，加入1.55g(20mmol)的乙酸铵，升温至130℃回流7h，取出冷却至室温后，在冰浴条件下用玻璃棒一边缓慢搅拌一边用胶头滴管缓慢滴加适量浓氨水(25-28％)调节溶液至中性，立即有大量粉红色沉淀析出。抽滤5min，将所得固体用乙醇和水进行重结晶，重结晶3次，过滤干燥得粉红色产物即为主配体2-(2,5-二甲氧基苯)咪唑[4,5-f][1,10]邻菲罗啉(H-MPP)。

(2)化合物(H-MPP)PtCl2)的合成

称取2mmol配体H-MPP溶于10mL DMSO中，120℃油浴搅拌至化合物完全溶解，降温到60℃，另外将0.5g(1.2mmol)氯亚铂酸钾溶于0.8mL水中，60℃水浴下，用滴管缓慢滴加入2mL DMSO，继续搅拌5min后，用滴管将以上所得混合液缓慢转移滴加入到粉红色H-MPP配体溶液中，有大量黄色沉淀析出，继续搅拌2h，趁热抽滤以除去未反应的氯亚铂酸钾和H-MPP配体，依次用热的5mL DMSO，10mL水和10mL乙醇洗涤两次。将以上得到黄色固体溶于30mL乙醇中，80℃水浴回流20min后，趁热过滤，并用适量丙酮洗涤固体两次，滤饼干燥得中间体(H-MPP)PtCl2。

(3)MPP-Pt-S的合成和结构表征

将0.5mmol(H-MPP)PtCl2溶于40mL无水甲醇中，65℃水浴加热磁力搅拌20min后得黄色固体悬浮液，再向其加入8倍的(1S,2S)-(+)-1,2-环己二胺(S-DACH)(0.6mL)，65℃加热继续回流使悬浮液达到完全溶解状态，并趁热过滤除去不溶性固体，在常温下等待滤液缓慢挥发析出红色沉淀。固体用无水乙醇和蒸馏水按照体积比3:1进行重结晶，待蒸发了大部分的乙醇和蒸馏水后，向其加入大量丙酮析出红色固体，过滤得到较纯的MPP-Pt-S配合物产物。所得产物用无水乙醇和蒸馏水进行重结晶3次，便可得红色配合物，无需过柱。产率约92％，其结构式见图1。

实施例2

一、本发明的制备方法：

(1)化合物2-(2,5-二甲氧基苯)咪唑[4,5-f][1,10]邻菲罗啉(H-MPP)的合成

准确称取0.21g(1mmol)1,10-邻菲罗啉-5,6-二酮，0.166g(1mmol)2,5-二甲氧基苯甲醛溶于10mL冰乙酸中，85℃油浴下磁力搅拌30min后，加入1.55g(20mmol)的乙酸铵，升温至130℃回流7h，取出冷却至室温后，在冰浴条件下用玻璃棒一边缓慢搅拌一边用胶头滴管缓慢滴加适量浓氨水(25-28％)调节溶液至中性，立即有大量粉红色沉淀析出。抽滤5min，将所得固体用乙醇和水进行重结晶，重结晶3次，过滤干燥得粉红色产物即为主配体2-(2,5-二甲氧基苯)咪唑[4,5-f][1,10]邻菲罗啉(H-MPP)。

(2)化合物(H-MPP)PtCl2)的合成

称取2mmol配体H-MPP溶于10mL DMSO中，120℃油浴搅拌至化合物完全溶解，降温到60℃，另外将0.5g(1.2mmol)氯亚铂酸钾溶于0.8mL水中，60℃水浴下，用滴管缓慢滴加入2mL DMSO，继续搅拌5min后，用滴管将以上所得混合液缓慢转移滴加入到粉红色H-MPP配体溶液中，有大量黄色沉淀析出，继续搅拌2h，趁热抽滤以除去未反应的氯亚铂酸钾和H-MPP配体，依次用热的5mL DMSO，10mL水和10mL乙醇洗涤两次。将以上得到黄色固体溶于30mL乙醇中，80℃水浴回流20min后，趁热过滤，并用适量丙酮洗涤固体两次，滤饼干燥得中间体(H-MPP)PtCl2。

(3)MPP-Pt-S的合成和结构表征

将0.5mmol(H-MPP)PtCl2溶于40mL无水甲醇中，65℃水浴加热磁力搅拌30min后得黄色固体悬浮液，再向其加入8倍的(1S,2S)-(+)-1,2-环己二胺(S-DACH)(0.6mL)，65℃加热继续回流使悬浮液达到完全溶解状态，并趁热过滤除去不溶性固体，在常温下等待滤液缓慢挥发析出红色沉淀。固体用无水乙醇和蒸馏水按照体积比3:1进行重结晶，待蒸发了大部分的乙醇和蒸馏水后，向其加入大量丙酮析出红色固体，过滤得到较纯的MPP-Pt-S配合物产物。所得产物用无水乙醇和蒸馏水进行重结晶3次，便可得红色配合物，无需过柱。产率约90％。

实施例3

一、本发明的制备方法：

(1)化合物2-(2,5-二甲氧基苯)咪唑[4,5-f][1,10]邻菲罗啉(H-MPP)的合成

准确称取0.21g(1mmol)1,10-邻菲罗啉-5,6-二酮，0.166g(1mmol)2,5-二甲氧基苯甲醛溶于10mL冰乙酸中，82℃油浴下磁力搅拌30min后，加入1.55g(20mmol)的乙酸铵，升温至130℃回流7h，取出冷却至室温后，在冰浴条件下用玻璃棒一边缓慢搅拌一边用胶头滴管缓慢滴加适量浓氨水(25-28％)调节溶液至中性，立即有大量粉红色沉淀析出。抽滤5min，将所得固体用乙醇和水进行重结晶，重结晶3次，过滤干燥得粉红色产物即为主配体2-(2,5-二甲氧基苯)咪唑[4,5-f][1,10]邻菲罗啉(H-MPP)。

(2)化合物(H-MPP)PtCl2)的合成

称取2mmol配体H-MPP溶于10mL DMSO中，120℃油浴搅拌至化合物完全溶解，降温到60℃，另外将0.5g(1.2mmol)氯亚铂酸钾溶于0.8mL水中，60℃水浴下，用滴管缓慢滴加入2mL DMSO，继续搅拌5min后，用滴管将以上所得混合液缓慢转移滴加入到粉红色H-MPP配体溶液中，有大量黄色沉淀析出，继续搅拌2h，趁热抽滤以除去未反应的氯亚铂酸钾和H-MPP配体，依次用热的5mL DMSO，10mL水和10mL乙醇洗涤两次。将以上得到黄色固体溶于30mL乙醇中，80℃水浴回流20min后，趁热过滤，并用适量丙酮洗涤固体两次，滤饼干燥得中间体(H-MPP)PtCl2。

(3)MPP-Pt-S的合成和结构表征

将0.5mmol(H-MPP)PtCl2溶于40mL无水甲醇中，65℃水浴加热磁力搅拌20min后得黄色固体悬浮液，再向其加入8倍的(1S,2S)-(+)-1,2-环己二胺(S-DACH)(0.6mL)，65℃加热继续回流使悬浮液达到完全溶解状态，并趁热过滤除去不溶性固体，在常温下等待滤液缓慢挥发析出红色沉淀。固体用无水乙醇和蒸馏水按照体积比3:1进行重结晶，待蒸发了大部分的乙醇和蒸馏水后，向其加入大量丙酮析出红色固体，过滤得到较纯的MPP-Pt-S配合物产物。所得产物用无水乙醇和蒸馏水进行重结晶3次，便可得红色配合物，无需过柱。产率约91％。

二、产品检验：

1、产品确认检测

将本发明实施例1制备得到的产物经过]红外光谱、核磁共振谱和电喷雾质谱进行结构测定(如图2-5所示)，确定目标配合物为MPP-Pt-S:C27H30N6O2Cl2Pt，具体的波谱特性如下：

MPP-Pt-S红外光谱：IR(KBr):3318.39,2936.18,1626.81,1582,26,1545.34,1508.51,1473.35,1376.65,1355.90,1339.09,1324.59,1290.81,1262.95,1217.84,1177.10,1152.09,1104,76,1037.89,946.98,882.14,842.80,812.26,746.37,714.44,619.15。

MPP-Pt-S核磁共振氢谱：¹H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.27(s,2H),8.97(s,2H),8.08(s,2H),7.65(s,1H),7.34(s,2H),7.15(d,J＝8.8Hz,1H),7.02(d,J＝8.8Hz,1H),6.64(s,2H),3.92(s,3H),3.84(s,3H),2.61(s,2H),2.17(s,2H),1.67(s,2H),1.56(s,2H),1.24(s,2H)。

MPP-Pt-S核磁共振碳谱：¹³C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ153.56,151.85,141.93,134.11,116.32,114.48,61.95,57.21,56.01,32.28,24.53。

MPP-Pt-S电喷雾质谱：ESI-MS m/z:665.20[M-2Cl]²⁺。

因此，可确定上述红色产物为二氯化2-(2,5-二甲氧基苯)咪唑[4,5-f][1,10]邻菲罗啉合铂(II)，即MPP-Pt-S。

2、产品性能检测

为了充分说明本发明产品在制药中的用途，申请人以顺铂(cisplatin)为阳性对照，对实施例1所得的抑制剂对多种人类肿瘤细胞株进行了体外抑制活性实验。

(1)用二甲基亚砜(DMSO)分别将MPP-Pt-S和顺铂配成2.0×10^-3mol/L的储备液，缓冲溶液(pH＝7.35)为0.1mol·L^-1的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)，MTT试剂(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)的浓度为5mg/mL。

(2)人肺腺癌(A549)，肝癌(BEL-7404)，卵巢癌(SK-OV-3)，宫颈癌(HeLa)、胃癌(MGC80-3)和正常人肝细胞(HL-7702)细胞株均置于37℃、5％CO2充分湿化条件下的培养箱中，接种于含10％灭活新生牛血清的PPMI1640培养液中培养。

(3)将所有化合物配制成10μg/mL，助溶剂DMSO终浓度不超过1％，测试该浓度下各化合物对癌细胞的抑制率。

(4)取处于对数生长期的细胞，每孔180μL(约4500-5000个细胞)含细胞的培养基接种于96孔培养板，于37℃、5％CO2充分湿化条件下培养24h。

(5)待细胞贴壁后，按每孔20μL的量加入样品,每个样品设6个复孔，同时设定相应的空白对照。

(6)继续培养48h后，每孔加入10μL MTT试剂(浓度为5mg/mL)，继续孵育4h后，吸弃上清液，每孔再加入150μL DMSO，轻微震荡反应5-8min，使结晶颗粒充分溶解。

(7)空白对照组调零，用酶标仪以490nm波长测定去除本底光吸收值后的吸光度值(值)，计算细胞增殖抑制率。可根据公式计算化合物的抑制率：抑制率＝(1-加药组OD值/对照组OD值)×100％。

(8)所有实验均重复3次后取平均值。得到本发明的中间体和MPP-Pt-S对5种人肿瘤细胞和正常人肝细胞(HL-7702)的抑制率，采用Bliss法计算得到相应化合物的半数抑制浓度IC50如图6和表2所示。

表1 MTT法分析抑制剂及顺铂对不同细胞株的IC50值(μM)

从图6及表1可见，本发明实施例1所制得的产物MPP-Pt-S，中间体与配合物对肿瘤细胞A549，BEL-7404，SK-OV-3，HeLa，MGC80-3和HL-7702的IC50值。在相同的实验条件下，用顺铂做阳性对照对5种肿瘤细胞和正常肝细胞均作用24小时。由图分析可知，所有配体H-MPP，和中间体H-MPP)PtCl2对所选的5种癌细胞均表现出极差的抑制活性，对细胞的特异选择性并不强(IC50值>36μM)，与其他细胞对比，配合物对正常肝细胞HL-7702的损伤要小，因此，它们被认为是不活泼的。

一方面，配合物MPP-Pt-S对A549，BEL-7404和MGC80-3癌细胞具有高毒性(IC50＝3.33–15.11μM)。另一方面，其比广泛应用的临床药物顺铂表现出更高效性。其中，肝肿瘤细胞(BEL-7404)对MPP-Pt-S表现出的最高灵敏度(IC50＝3.33±0.21μM)，分别比游离的配体H-MPP和顺铂高出将近38倍和5.4倍。MPP-Pt-S对正常的HL-7702细胞生长无明显抑制作用，因此表明其对BEL-7404肿瘤细胞具有潜在的细胞毒性选择性价值。

3、产品对肝癌细胞凋亡的影响性能检测：

(1)移取1mL细胞悬浮液(约4×105个细胞)接种在6孔培养板中，并将其放置于CO2培养箱培养24h。

(2)当细胞生长到85％左右时，更换培养液，加入不同浓度的样品到各培养孔，并设置空白对照实验组，继续反应24h，用PBS缓冲溶液清洗两遍，消化收集细胞于EP管内，离心并去除细胞上清液，PBS清洗。

(3)向每个EP管加入100μL的结合缓冲液后得到细胞悬浮液，加入5μLAnnexinV(膜联蛋白)和5μL PI(碘化丙啶)结合液到每个EP管中，空白组只加入AnnexinV，室温下避光染色15min后，尽快上流式细胞仪检测。

由图7知MPP-Pt-S(3.33μM)对人类肝癌(BEL-7404)细胞处理24小时后，观察到早期细胞和晚期凋亡细胞率分别为48.8.3％，19.2％，表明MPP-Pt-S(3.33μM)可以通过凋亡途径有效诱导BEL-7404细胞死亡。

4、产品对肝癌细胞端粒酶活性抑制的影响性能检测：

(1)移取1mL细胞悬浮液(约4×105个细胞)接种在6孔培养板中，并将其放置于CO2培养箱培养24h。

(2)当细胞生长到85％左右时，更换培养液，加入不同浓度的样品到各培养孔，并设置空白对照实验组，继续培养24h，去掉上清夜，再与5μg/μL的线粒体膜电位(JC-1)的试剂37℃下培养20min，在荧光显微镜下观察检测线粒体膜电位变化。

从图8中可以看出，MPP-Pt-S(3.33μM)对人类肝癌(BEL-7404)细胞处理24小时有明显的线粒体膜电位的损失，表明MPP-Pt-S很有可能通过线粒体通路障碍途径诱导BEL-7404肿瘤细胞产生凋亡过程。

4、产品对肺癌细胞相关原癌基因的表达水平性能检测：

(1)提取蛋白：细胞分别用受测样品处理培养24h后，收集细胞后使用缓冲溶液(150mM NaCl，100mM Tris-HCl，pH＝7.4，10％甘油，1％Triton X-100，10mM NaF，5mM焦磷酸钠，5mM原钒酸钠，0.1％SDS)和蛋白酶抑制剂溶解裂解。

(2)转膜：总蛋白提取(50μg)加载到12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，然后再转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。膜使用5％在TBST中牛血清白蛋白阻滞，再与相应抗体继续4℃培养过夜。在培养品提取得到相应单抗体，清洗，用过氧化物酶偶联的二抗孵育PVDF膜120min。

(3)免疫反应：免疫反应信号的检测采用增强型化学发光试剂盒按照用户手册中的程序进行操作，同时通过检测β-actin的含量以确保化学发光成像系统X光片上蛋白泳道中含有等量的蛋白。

如图9可见，Western Blot检测MPP-Pt-S(3.33μM)对肝癌(BEL-7404)细胞作用24后细胞线粒体中相关凋亡蛋白基因的表达情况。apaf-1，cytochromec，p21，p27和p53五种基因表达水平显著上调而bcl-2基因表达水平略微下调。p53基因表达水平的上调可以直接诱导肿瘤细胞凋亡，同时也会使细胞周期暂时延长，这与上述实验检测细胞周期和凋亡的结果相吻合；p53基因也会一定程度改变线粒体膜的通透性，促进其它相关调节因子，最终引起线粒体通路障碍诱导细胞凋亡。此外，抗凋亡基因蛋白Bcl-2表达水平的略微下调会降低了对癌细胞的保护作用，导致线粒体功能紊乱，增加肿瘤细胞死亡率。线粒体释放出的cytochrome c与Apaf-1形成凋亡复合体使端粒酶激活，最终诱导肿瘤细胞凋亡。综上,说明一定浓度的配合物MPP-Pt-S作用BEL-7404细胞可能是通过内源性的线粒体途径诱导细胞调亡。

以上数据表明，本发明所制得的产物在抗肿瘤药物方面具有十分广阔的应用前景，有望用于制备人肝癌的抗肿瘤药物。