一种产麦芽五糖能力提高的直链麦芽低聚糖生成酶突变体的制作方法

本发明涉及一种产麦芽五糖能力提高的直链麦芽低聚糖生成酶突变体，属于酶工程技术领域。

背景技术：

直链麦芽低聚糖通常是指由3～10个葡萄糖单元以ɑ-1,4糖苷键连接而成的聚合体，是一种功能性新糖源。直链麦芽低聚糖对人类健康具有潜在的益处：可直接进入小肠水解吸收，易消化；渗透压低，延长供能时间；不易被链球菌和酵母菌利用，抗龋齿；促进人体对钙离子的吸收，预防骨质疏松；促进肠道有益菌生长，改善肠道功能。并且具有良好的加工适应性，例如粘度高，可作为增稠剂；冰点降低作用小，可增强冷饮抗熔融性；具有抗结晶性，抑制巧克力返砂；吸湿性小，保湿性好，因此可用作水分调节剂。此外，直链麦芽低聚糖能够抑制淀粉回生和蛋白质变性，可延长食品保质期。

直链麦芽低聚糖是一种在食品工业中具有潜在应用的新型功能性低聚糖，除此之外，高纯度的麦芽低聚糖还可作为生化试剂，用于生物、医学或化工等研究当中。日本等国家首先对直链麦芽低聚糖进行研究，已开始批量生产；而国内对直链麦芽低聚糖的研究起步较晚，国内的淀粉糖生产主要集中于麦芽糖和葡萄糖。当前直链麦芽低聚糖的市场被美国、日本等少数发达国家所垄断，价格昂贵。但由于直链麦芽低聚糖强大的的生理功效及良好的加工适应性，在国内开发具有工业应用价值的直链麦芽低聚糖势在必行。

在直链麦芽低聚糖中，麦芽五糖可作为淀粉酶研究的反应剂，在临床医学中用于测定人血清和尿液中α-淀粉酶的活性。然而目前工业上利用直链麦芽低聚糖生成酶生产得到的一般是一种或几种麦芽低聚糖混合物，且生产得到的麦芽低聚糖混合物中麦芽五糖含量较低。产物中麦芽五糖的含量过低会导致生产成本过高，且后续分离提纯困难，难以满足工业上的需求。

目前对直链麦芽低聚糖生成酶的研究主要集中于酶学性质及催化性质，且大多数直链麦芽低聚糖生成酶存在活力低下、热稳定性差、产物特异性低等问题。通过定点突变提高酶活力或热稳定性的报道较多，而对产物特异性的提高却鲜有报道。主要是缺乏酶与底物复合的晶体结构以更进一步了解产物特异性的影响因素。产物直链麦芽低聚糖制备方面主要依靠优化体系条件来提高产物含量。但这种提高效果有限，只有提高酶本身的产物特异性，方可有效提升其工业应用价值。

技术实现要素：

为了解决上述存在的技术问题，本发明通过对来源于bacillusstearothermophilusstb04的直链麦芽低聚糖生成酶进行突变得到主产物麦芽五糖提高的直链麦芽低聚糖生成酶突变体w139a、w139l、w139y，其催化得到的产物中麦芽五糖的百分含量分别高达44.08％、56.71％及50.01％，更能适应工业化生产。

本发明的第一个目的是提供一种产麦芽五糖能力提高的直链麦芽低聚糖生成酶突变体，所述突变体的氨基酸序列包括：在seqidno:1所示的氨基酸序列的基础上，将第139位的氨基酸进行突变后得到的氨基酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述编码seqidno:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列是seqidno:2所示的序列。

在本发明的一种实施方式中，所述直链麦芽低聚糖生成酶为来源于bacillusstearothermophilusstb04的直链麦芽低聚糖生成酶。

在本发明的一种实施方式中，所述将第139位的氨基酸进行突变，是突变成丙氨酸、亮氨酸或酪氨酸。

在本发明的一种实施方式中，所述直链麦芽低聚糖生成酶突变体的氨基酸序列分别为seqidno:3、seqidno:4、seqidno:5。

本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。

本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体或细胞。

本发明的第四个目的是提供表达所述突变体的基因工程菌。

在本发明的一种实施方式中，所述的基因工程菌以枯草芽孢杆菌为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述的基因工程菌以bacillussubtiliswb600为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述的基因工程菌以pst为表达载体。

本发明的第五个目的是提供一种制备直链麦芽五糖的方法，所述方法是以所述突变体或含有所述突变体的全细胞为催化剂，以淀粉为底物制备直链麦芽五糖。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是以ph6.0的5～20％(w/w)玉米淀粉溶液为底物，以5～10u/g干基淀粉的加酶量加入所述直链麦芽低聚糖生成酶突变体，在ph6.0、60℃条件下反应48小时。

本发明还提供所述的突变体或所述的基因工程菌在医药生产、化工或食品领域的应用。

本发明的有益效果：

(1)以5％(w/w)玉米淀粉溶液为底物，直链麦芽低聚糖生成酶突变体w139a、w139l、w139y产物中麦芽五糖的百分含量分别为44.08％(w139a)、56.71％(w139l)及50.01％(w139y)，分别是野生酶(28.15％)的1.57、2.01、1.78倍。结合底物转化率，w139y生产的麦芽五糖产量最高(为18.01g·l^-1)，相比野生型(麦芽五糖产量为10.55g·l^-1)提高了71％；

(2)即使在较高的底物浓度下(玉米淀粉20％，w/w)，突变体w139y依然可以有效水解淀粉生产高浓度麦芽五糖，产物中麦芽五糖的百分含量为45.86％，高产物纯度及底物转化率可以有效降低高纯度直链麦芽低聚糖浆的生产加工成本，更具有工业应用价值。

(3)本发明所提供的生产直链麦芽五糖糖浆的方法，和其他生产淀粉糖的方法相比，不需要在生产过程中调节温度和ph，不需要添加钙离子，不需要加入普鲁兰酶、异淀粉酶等其他协同酶制剂，因此工艺更为简单、便捷，生产成本更低。

生物材料

本发明的菌株bacillusstearothermophilusstb04和质粒pst、pst/mfa均在潘思惠的文献《直链麦芽低聚糖生成酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达、酶学性质与产物研究》中公开(具体参见第二章2.1.1小节)，公开日：2018-06-30。

附图说明

图1：直链麦芽低聚糖生成酶的sds-page分析。

图2：直链麦芽低聚糖生成酶作用于5％(w/w)玉米淀粉的产物中各糖组分的百分含量及底物总转化率。

图3：直链麦芽低聚糖生成酶作用于5％(w/w)玉米淀粉的产物的hpaec-pad曲线；g1～g7分别代表葡萄糖、麦芽糖、直链麦芽三糖、直链麦芽四糖、直链麦芽五糖、直链麦芽六糖、直链麦芽七糖；标准品中g1～g7的浓度均为2μg/ml。

具体实施方式

直链麦芽低聚糖生成酶活力的测定方法：酶活力的测定采用3,5-二硝基水杨酸(dns)法。以c6h8o7-na2hpo4缓冲液(10mm，ph5.5)配制1％(w/v)可溶性淀粉溶液作为底物，在0.9ml底物中加入100μl适当稀释后的酶液，60℃下反应15min，加入1.0mldns溶液终止反应，沸水浴中显色5min后立即冰浴冷却。加入2ml去离子水振荡均匀，于540nm下测定吸光值，根据葡萄糖标准曲线计算出体系中还原糖含量。以每分钟生成1μmol还原糖(以葡萄糖计)所需的酶量定义为1个酶活单位(u)。

利用高效阴离子交换色谱(hpaec-pad)分析产物中各组分含量。分析条件为：采用carbopacpa200色谱柱，以0.25mnaoh、1mnaac和超纯水为流动相，设置流速为0.5ml/min，柱温35℃，进样量10μl。底物总转化率与各单糖组分在g1～g7中所占百分比的计算方法如下：

单糖百分含量＝(单糖组分质量/g1～g7总质量)×100％

总转化率＝(g1～g7总质量/底物干基质量)×100％

实施例1：直链麦芽低聚糖生成酶突变体基因序列的制备

(1)将氨基酸序列如seqidno.1所示(核苷酸序列如seqidno.2所示)的直链麦芽低聚糖生成酶基因连接到载体pst上，得到重组载体pst/mfa，具体构建过程参见文献《直链麦芽低聚糖生成酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达、酶学性质与产物研究》的第10页第2.2.2小节。

(2)以表达载体pst/mfa为模板，设计实验所需的互补引物链(见表1)，引物由金唯智生物科技有限公司合成，参照takara公司starprimergxl试剂盒说明书所示方法进行定点突变。pcr反应体系依照starprimer试剂盒说明书中所设定条件：超纯水32μl，5×primestargxlbuffer10μl，dntpmixture(各2.5mm)4μl，正向和反向引物(10μm)均为1μl，模板dna1μl，primestargxldnapolymerase(2.5u/μl)1μl。pcr扩增条件为：98℃条件下预变性3min；随后以98℃10s，60℃15s，68℃8min为一个循环，在以上条件下进行35个循环；最后68℃下保温10min。

表1直链麦芽低聚糖生成酶突变位点的引入

注：¹下划线碱基对应于相应突变氨基酸。

实施例2：基因工程菌的构建

在37℃下，用dpni处理实施例1中得到的pcr产物2h，随后将处理好的pcr产物转化到e.colijm109中，将转化的e.colijm109涂布到含有100μg/ml卡那霉素的lb琼脂培养基中，在37℃恒温箱中过夜培养12h，从中挑选出单菌落接种到含有100μg/ml卡那霉素的lb液体培养基中，在37℃下、200r/min培养过夜并按照质粒提取试剂盒说明书所示方法提取质粒鉴定测序。将构建好的目的质粒通过化学转化法转入表达宿主bacillusubtiliswb600感受态中。最终得到基因工程菌b.subtiliswb600(pst/mfa)。

实施例3：直链麦芽低聚糖生成酶突变体的表达

lb培养基：酵母粉5g/l，胰蛋白胨10g/l，nacl10g/l，ph7.0。

发酵培养基：酵母粉30g/l，玉米淀粉6g/l，kh2po417mm，k2hpo472mm，ph7.5。

(1)宿主菌活化培养：将实施例2中得到的含有表达载体质粒pst/mfa的bacillusubtiliswb600在lb固体培养基上进行划线分离，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，挑取阳性单菌落接种于含有50mllb液体培养基的250ml锥形瓶中。接种前添加终浓度为5μg/ml卡那霉素。锥形瓶置于200r/min的回转式摇床中，在37℃下培养12h。

(2)发酵培养：将活化后的种子液以4％(v/v)的接种量转接至装有50ml发酵培养基的250ml锥形瓶中，在摇床中振荡培养48h(转速为200r/min)，接种前添加终浓度为5μg/ml卡那霉素。结束发酵后，将发酵液于4℃、10,000×g条件下离心15min，收集上清液即得到粗酶液。

实施例4：直链麦芽低聚糖生成酶突变体的纯化

将实施例3中得到的发酵上清液通过0.45μm水系膜过滤，并使用5-mlhitrapphenylhp柱进行一步疏水纯化。用25ml超纯水以2ml/min的流速平衡柱子，并保持流速恒定。上样60ml后，用10mmnaoh以2ml/min的流速洗脱柱上的目的蛋白。收集到的洗脱液在超纯水中透析24h，然后通过测定酶活力和sds-page(见图1)进行鉴定，分别得到直链麦芽低聚糖生成酶突变体w139y(氨基酸序列如seqidno:3所示)、w139l(氨基酸序列如seqidno:4所示)、w139a(氨基酸序列如seqidno:5所示)纯酶，并在-80℃保存。

实施例5：直链麦芽低聚糖生成酶突变体的产物分析

配制ph6.0的5％(w/w)玉米淀粉溶液，按5u/g加酶量加入野生型(氨基酸序列如seqidno.1所示)和突变体直链麦芽低聚糖生成酶，在60℃下反应48h。反应结束后沸水浴灭酶，10,000×g条件下离心5min，稀释一定倍数后用0.22m针头式过滤器过滤。以一定浓度梯度的g1～g7混合标准品为对照进行定性与定量分析。

产物分析结果如图2和图3所示。野生型主产麦芽五糖和麦芽六糖，两者的百分含量分别为28.15％和33.10％，底物转化率75.00％。突变体直链麦芽低聚糖生成酶显著提高了产物中麦芽五糖的百分含量，分别为44.08％(w139a)、56.71％(w139l)及50.01％(w139y)。结合底物转化率，w139y生产的麦芽五糖产量最高，相比野生型其麦芽五糖产量提高了71％。

表2直链麦芽低聚糖生成酶的产物分析

注：g1～g7分别代表葡萄糖、麦芽糖、直链麦芽三糖、直链麦芽四糖、直链麦芽五糖、直链麦芽六糖、直链麦芽七糖；

表3直链麦芽低聚糖生成酶的产物中g5的产量

实施例6：直链麦芽低聚糖生成酶水解高浓度玉米淀粉乳制备麦芽五糖

配制20％(w/w)的玉米淀粉乳200g，调节ph6.0，在60℃水浴中保温15min，搅拌速率300r/min。按照10u/g干基淀粉的加酶量加入野生型直链麦芽低聚糖生成酶及突变体w139y，提高水浴温度至90℃，液化20min，立即将温度降至60℃，开始反应计时。分别在反应24、48、72h后取样，经称量、定容、离心、过膜、稀释后，利用hpaec-pad进行产物测定。各糖组分的百分含量及底物总转化率如表4所示。野生型麦芽低聚糖生成酶的水解产物中麦芽五糖百分含量为19.92％～27.58％，底物转化率59.52％～67.19％；突变体w139y的水解产物中麦芽五糖百分含量为42.91％～45.86％，底物转化率55.45％～62.51％。综合各阶段的产物情况及底物转化率，48h的反应时间较为合适，此时突变体w139y的麦芽五糖产量相比野生型提高了68％，产物中麦芽五糖占比45.86％(野生型25.54％)。

表4野生型及突变体直链麦芽低聚糖生成酶水解玉米淀粉乳的产物情况

注：g1～g7分别代表葡萄糖、麦芽糖、直链麦芽三糖、直链麦芽四糖、直链麦芽五糖、直链麦芽六糖、直链麦芽七糖；

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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