一株芽孢杆菌SEM-2、包括SEM-2的复合菌剂、复合微生物肥及其应用的制作方法

本发明属于微生物应用
技术领域：
，尤其涉及一株芽孢杆菌SEM-2、包括SEM-2的复合菌剂、微生物复合肥及其应用。
背景技术：
：枯萎病是一种毁灭性的土传病害，有植物“癌症”之称。引起枯萎病的病原主要是镰刀菌，寄主范围广泛，可引起100多种植物发生病害。长期以来，人们对病害的防治手段主要有作物轮作、选育抗病品种、化学药物防治和生物防治等。抗病品种选育周期长且易失去抗性，化学药物虽然具有防效高、速度快、杀虫抗菌谱广、成本低及使用简单等优点，但长期使用化学药剂易导致土质退化、病原菌产生抗药性，造成次要病害猖獗、药剂残留、环境污染等严重生态和农产品安全问题。近年来人们对于食物安全的重视和环保意识的增强，对农业的可持续发展提出了更高的要求。生物防治因其低成本、高效率、环境友好和无药物残留等特点已成为当前国内外植物病害防治的研究热点。生物防治主要是通过拮抗微生物土壤定殖，与病原菌竞争营养及生存空间、分泌抑菌物质及蛋白酶、激发植物体的抗性免疫机制、促进植物生长、强化抗逆性等综合作用形成对土传病害的预防与防治效果。目前对于枯萎病的生物防治，使用的主要生防因子包括真菌木霉、AM菌根、非致病尖孢镰刀菌、青霉属、拟青霉属、放线菌、细菌等。但是存在适用范围小、效率低、不稳定的问题。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一株芽孢杆菌SEM-2、包括SEM-2的复合菌剂、微生物复合肥及其应用；所述芽孢杆菌SEM-2能够高效稳定的抑制尖孢镰刀菌，有效的防治枯萎病。为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：本发明提供了一株芽孢杆菌SEM-2，所述芽孢杆菌SEM-2的保藏编号为GDMCCNo.60039。本发明提供了所述芽孢杆菌SEM-2在防治植物枯萎病中的应用。本发明提供了一种的复合微生物菌剂，包括所述的芽孢杆菌SEM-2和巨大芽孢杆菌OP6；所述巨大芽孢杆菌OP6的保藏编号为CGMCCNo.11837；所述芽孢杆菌SEM-2和巨大芽孢杆菌OP6的活芽孢数独立的为(0.5～3)×1011cfu/g。优选的，所述芽孢杆菌SEM-2和巨大芽孢杆菌OP6的活芽孢数比例为(1～2):1。优选的，当所述复合微生物菌剂为固体制剂时，所述复合微生物菌剂中还包括载体。优选的，所述载体为轻质碳酸钙。本发明提供了所述的复合微生物菌剂在防治植物枯萎病中的应用。本发明还提供了一种复合微生物肥，包括以下重量份的组成：所述的芽孢杆菌SEM-2或所述的复合微生物菌剂5～15份，蚕沙55～75份，烟梗10～15份，贝壳粉15～30份。优选的，所述蚕沙为生蚕沙或堆肥腐熟后的蚕沙。优选的，所述芽孢杆菌SEM-2为固体菌粉，所述菌粉中芽孢杆菌SEM-2的活芽孢数为(1～3)×1011cfu/g。本发明的有益效果：本发明提供的芽孢杆菌SEM-2，所述芽孢杆菌SEM-2的保藏编号为GDMCCNo.60039，来源于蚕沙，所述芽孢杆菌SEM-2基因组测序信息显示，内含有Bacillaene、Fengycin、Bacillibactin、Subtilosin_A、Surfactin及Bacilysin等抗菌物质的合成基因簇，能够有效的抑制镰刀菌，菌落半径抑制率最高达到87％；所述芽孢杆菌SEM-2同时具有溶解释放土壤难溶无机磷的作用。本发明提供的微生物复合菌剂，将所述芽孢杆菌SEM-2与巨大芽孢杆菌OP6复配，两者复配后，在拮抗镰刀菌、释放土壤难溶无机磷、钾等方面具有显著的效果。本发明提供的复合微生物肥，包括芽孢杆菌SEM-2、蚕沙、烟梗和贝壳粉；本发明菌株来源于堆肥发酵过程中的蚕沙，因此跟蚕沙相容性好；烟梗腐熟后富含烟碱、多糖、纤维素、木质素、钾等，有较好的杀虫防虫效果；贝壳粉是海产的副产物，其主要成分是CaCO3，钙是植物生长需要所必须的中量营养元素，而南方土壤普遍偏酸，添加CaCO3能改良酸性土壤的作用。生物保藏说明本发明提供的芽孢杆菌SEM-2(Bacillussp.)保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，保藏编号为GDMCCNo.60039，保藏日期为2016年5月16日，保藏地址为中国广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮政编码为510075。附图说明图1为芽孢杆菌SEM-2的菌落形态；图2为芽孢杆菌SEM-2显微镜下的细胞形态；图3为单独培养镰刀菌菌丝的状态；图4为本发明复合微生物菌剂与镰刀菌共培养后镰刀菌菌丝的状态；图5为本发明复合微生物肥与镰刀菌共培养后镰刀菌菌丝的状态。具体实施方式本发明提供了一株芽孢杆菌SEM-2，所述芽孢杆菌SEM-2的保藏编号为GDMCCNo.60039。本发明提供的芽孢杆菌SEM-2的菌落形态为乳白色，圆形，表面皱褶，不透明，边缘不整齐；扫描电镜观察发现芽孢杆菌SEM-2的菌体为杆状，长度约1.4um。本发明提供的芽孢杆菌SEM-2的基因组测序比对分析：SEM-2的全基因组序列经IlluminaHiseq4000平台测序分析发现，基因组大小为4,083,029bp，GC含量43.64％，共20个scaffold，34个contig。基因组组分分析后发现，芽孢杆菌SEM-2的基因组含有4,246个基因，总长度为3,600,030bp，平均长度848bp，占基因组全长的88.18％；芽孢杆菌SEM-2的基因组含有tRNA72个，rRNA5个；经分析发现芽孢杆菌SEM-2的基因组序列内含有Bacillaene、Fengycin、Bacillibactin、Subtilosin_A、Surfactin及Bacilysin等抗菌物质的合成基因簇。本发明还提供了所述芽孢杆菌SEM-2在防治植物枯萎病中的应用。本发明对所述应用的方式没有特殊限定，以所述芽孢杆菌SEM-2为唯一活性成分防治植物枯萎病，也可以将所述芽孢杆菌SEM-2与其他菌种或活性成分混合共同防治植物枯萎病。本发明提供了一种的复合微生物菌剂，包括所述的芽孢杆菌SEM-2和巨大芽孢杆菌OP6；所述巨大芽孢杆菌OP6的保藏编号为CGMCCNo.11837；所述芽孢杆菌SEM-2和巨大芽孢杆菌OP6的活芽孢数独立的为(0.5～3)×1011cfu/g。在本发明中，所述芽孢杆菌SEM-2和巨大芽孢杆菌OP6的活芽孢数独立优选为(0.5～3)×1011cfu/g，更优选为(1～2.5)×1011cfu/g，所述芽孢杆菌SEM-2和巨大芽孢杆菌OP6的活芽孢数比例优选为(1～2):1，更优选为1.5:1。在本发明中，所述复合微生物菌剂优选为固体制剂；所述复合微生物菌剂优选的通过将所述芽孢杆菌SEM-2菌粉与巨大芽孢杆菌OP6菌粉混合获得。在本发明中，所述芽孢杆菌SEM-2菌粉通过以下方法制备获得：将所述芽孢杆菌SEM-2活化后进行连续两级发酵、浓缩获得浓缩菌液；将所述浓缩菌液与载体混合后喷雾干燥获得所述芽孢杆菌SEM-2菌粉。在本发明中，将所述芽孢杆菌SEM-2接种于NB液态培养基中培养12～16h获得一级种子液；所述培养的温度优选为37℃，所述培养的转速优选为200rpm；所述培养的时间优选为14h。本发明在得到一级种子液后，将所述一级种子液转接于NB液态培养基中培养8～12h获得二级种子液。本发明中，所述一级种子液转接的接种量优选为0.7％～1％(V/V)；所述培养优选的在发酵罐中进行，所述培养的过程中进行通气，所述通气的通气比优选为1:(1～1.5)；所述培养的温度优选为37℃，所述培养的转速优选为200～400rpm，更优选为300rpm；所述培养的时间优选为10h。在本发明中，所述二级种子液的OD600优选为0.9～1.0；所述二级种子液中活菌含量优选为107cfu/mL。本发明在获得所述二级种子液后，将所述二级种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养获得发酵菌液。在本发明中，所述二级种子液的接种量优选为0.5～1％(V/V)；所述发酵培养优选的在发酵罐中进行，所述发酵培养的过程中罐压优选的维持在0.05Mpa；所述发酵培养过程中进行通气，所述通气的通气比优选为1:(1～1.5)；所述发酵培养的温度优选为37℃，所述发酵培养的转速优选为200～400rpm，更优选为300rpm；所述发酵培养的时间优选为40～50h，更优选为48h。在本发明中，所述发酵菌液中枯草芽孢杆菌SEM-2活芽孢含量优选为2～3×109cfu/mL。在本发明中，所述发酵培养基以水为溶剂，优选的包括以下质量浓度的组分：玉米淀粉2％～3％；豆粕粉1.5％～2.5％；酵母膏0.5％～1％，NaCl0.1～0.3％，MgSO4·7H2O0.2％～0.4％，CaCO30.2％～0.3％，K2HPO40.02％～0.04％，MnSO4·H2O0.005％～0.015％，NaHCO30.1％～0.3％；所述发酵培养基的pH值优选为6.5～7.5，所述发酵培养基在使用前优选的经过高温湿热灭菌；所述高温湿热灭菌的温度优选为121℃，所述高温湿热灭菌的时间优选为20min。本发明在获得所述发酵菌液后，将所述发酵菌液浓缩获得浓缩菌液。在本发明中，所述浓缩的倍数优选为10～20倍；所述浓缩的方法优选为碟片离心或微滤；本发明对所述碟片离心或微虑的具体参数设置没有特殊限定，采用常规的参数设置实现上述倍数的浓缩即可。本发明在获得所述浓缩菌液后，将所述浓缩菌液与载体混合后喷雾干燥获得所述芽孢杆菌SEM-2菌粉。在本发明中，所述载体优选为轻质碳酸钙；所述浓缩菌液与轻质碳酸钙的质量比优选为(95～105):3，更优选为100:3。在本发明中，所述喷雾干燥的进风口温度优选为180～200℃，所述喷雾干燥的出风口温度优选为80～85℃。在本发明中，所述芽孢杆菌SEM-2菌粉中含水量小于5％(W/W)，所述芽孢杆菌SEM-2菌粉中活芽孢数优选为(1～3)×1011cfu/g，更优选为2×1011cfu/g。本发明将所述芽孢杆菌SEM-2菌粉与巨大芽孢杆菌OP6菌粉混合获得所述复合微生物菌剂。本发明对所述巨大芽孢杆菌OP6菌粉的制备方法没有特殊限定，采用本领域常规方法制备即可。本发明提供了所述的复合微生物菌剂在防治植物枯萎病中的应用。本发明还提供了一种复合微生物肥，包括以下重量份的组成：所述的芽孢杆菌SEM-2或所述的复合微生物菌剂5～15份，蚕沙55～75份，烟梗10～15份，贝壳粉15～30份。在本发明中，所述芽孢杆菌SEM-2优选为固体菌粉，所述菌粉中芽孢杆菌SEM-2的活芽孢数优选为(1～3)×1011cfu/g，更优选为2×1011cfu/g；在本发明中，所述菌粉的制备方法参见上述微生物复合菌剂中记载的制备方法，在此不再赘述。在本发明中，所述蚕沙优选为堆肥腐熟后的蚕沙；所述蚕沙是养蚕生产中的主要有机废弃物，不但含有丰富的营养物质，还含有丰富的微生物菌群。下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1芽孢杆菌SEM-2菌株的分离及鉴定(1)样品稀释：从发酵腐熟的蚕沙堆肥中取样，称取5g溶解到装有45mL无菌水的三角瓶中，150rpm振荡器振荡成均匀的10-1稀释液，然后用1mL移液枪吸取该稀释液1mL至装有9mL无菌水的试管中，充分摇匀，即制成10-2的样品稀释液，并依次稀释至10-6。(2)培养基准备：解无机磷筛选培养基：葡萄糖10.0g、Ca3(PO4)25.0g、(NH4)2SO40.5g、NaCl0.2g、KCl0.2g、MgSO4·7H2O0.1g、FeSO4·7H2O0.03g、MnSO4·4H2O0.03g、酵母粉0.5g、蒸馏水1000mL、pH6.8～7.2，灭菌20min；马铃薯土豆培养基(平板对峙法所用培养基)：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂18g、蒸馏水1000mL、pH6.8～7.2；NA培养基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl5g，琼脂粉20g，蒸馏水1000mL，PH7.0；121℃灭菌20min，于45℃～55℃倾倒至无菌的培养皿。(3)菌种分离、纯化与筛选：分别吸取不同稀释倍数的稀释液0.1mL，均匀涂布于冷却好的解无机磷培养基，放置30℃培养箱中倒置培养5天，观察并挑选长势良好、解磷圈显著的菌落于NA培养基培养；将所挑选出菌于NA培养基多次继代培养后，通过平板对峙法，检测与镰刀菌的拮抗效果，取拮抗效果显著的一个菌株，命名为芽孢杆菌SEM-2菌株。(4)菌株的鉴定A、形态鉴定：芽孢杆菌SEM-2菌株的菌落形态为乳白色，圆形，表面皱褶，不透明，边缘不整齐。扫描电镜观察发现芽孢杆菌SEM-2菌体为杆状，长度约1.4um(图1/2)。B、基因组测序比对分析：SEM-2的全基因组序列经IlluminaHiseq4000平台测序分析发现，基因组大小为4,083,029bp，GC含量43.64％，共20个scaffold，34个contig。基因组组分分析后发现，样品SEM-2的基因组含有4,246个基因，总长度为3,600,030bp，平均长度848bp，占基因组全长的88.18％。tRNA72个，rRNA5个。分析发现基因组序列内含有Bacillaene、Fengycin、Bacillibactin、Subtilosin_A、Surfactin及Bacilysin等抗菌物质的合成基因簇。实施例2芽孢杆菌SEM-2拮抗镰刀菌效果对比实验：采用平板对峙法，在平板中央分别接种枯萎病病原菌尖孢镰刀菌，Fusariumoxysporum，在距其约1.5cm处放置滤纸片(滤纸片去除表面活性剂，肥皂水浸泡，冲洗干净，烘干，灭菌)，分别点5μL芽孢杆菌SEM-2及其它四株市售的枯草芽孢杆菌的发酵液(浓度一致)，待完全吸收后，倒置培养2-3天，观察，计算其对镰刀菌菌落半径抑制率。结果表明：枯草芽孢杆菌SEM-2对所测尖胞镰刀菌的拮抗效果最好，菌落半径抑制率达到86±1％，而其他四株对照菌株对所测尖胞镰刀菌菌落半径抑制率分别在74～85％。表1芽孢杆菌SEM-2拮抗镰刀菌结果SEM-21234CK镰刀菌菌落半径(cm)0.7±0.051.2±0.10.8±0.050.85±0.051.0±0.15.0菌落半径抑制率(％)86±176±284±183±180±20实施例3微生物复合菌剂的制备：活化芽孢杆菌SEM-2菌株，挑取单菌落，接种于100mLNB液态培养基(121℃下，灭菌20min)中，37℃、200rpm下培养14h，得到一级种子液。将一级种子液接入无菌的种子罐中，接种量为0.7～1％(V/V)；培养条件为：通气比1:1，搅拌转速为300rpm，培养温度37℃，罐压0.05MPa，培养时间为10h，培养结束时得到二级种子液，其活菌含量约为107cfu/mL，OD值在0.9～1.0，此时菌种活力强。芽孢杆菌SEM-2的菌液发酵发酵培养基配方(重量百分比)：发酵培养基以水为溶剂，包括以下质量浓度的组分：玉米淀粉2.5％；豆粕粉2％；酵母膏0.75％，NaCl0.2％，MgSO4·7H2O0.3％，CaCO30.25％，K2HPO40.03％，MnSO4·H2O0.01％，NaHCO30.2％；发酵培养基pH7.0，121℃灭菌20min；将芽孢杆菌SEM-2的二级种子液，按照接种量为0.8％(V/V)接入无菌发酵罐中，培养条件为：通气比1:1，搅拌转速为300rpm，培养温度37℃，罐压0.05MPa，保持5％以上的溶氧条件，培养时间为48h；下罐时间以取样镜检芽孢90％以上释放为准，成熟发酵液中枯草芽孢杆菌SEM-2活芽孢含量为2～3×109cfu/mL，得到发酵成熟菌液；芽孢杆菌SEM-2菌粉的制备上述所得的发酵成熟菌液(活芽孢含量为2～3×109cfu/mL)经碟片离心机或微滤设备浓缩15倍后，加入轻质碳酸钙(载体)搅拌混合均匀，浓缩成熟发酵菌剂与轻质碳酸钙的重量比为100:3，得到液固混合物，喷雾干燥，得到芽孢杆菌SEM-2菌粉，菌粉中含水量小于5％(W/W)，活芽孢含量2×1011cfu/g。喷雾干燥条件为：进风口温度为180～200℃，出风口温度为80-85℃，。上述所得的芽孢杆菌SEM-2菌粉与巨大芽孢杆菌OP6，菌种登记号：CGMCCNo.11837)的菌粉按55：45比例混合，得到复合微生物菌剂。实施例4复合微生物菌肥的制备将实施例3中制备得到的芽孢杆菌SEM-2菌粉或者复合微生物菌剂按比例与堆肥腐熟后的蚕沙、烟梗和贝壳粉混匀，获得蚕沙微生物菌肥。所述蚕沙或堆肥腐熟化处理后的蚕沙、微生物菌剂原粉、烟梗和贝壳粉的质量百分含量分别为60％、15％，10％和15％。实施例5复合微生物菌剂、微生物菌肥拮抗镰刀菌菌丝生长效果鉴定采用共培养的方法，分别收集镰刀菌孢子、活化复合微生物菌液及1％稀释的复合微生物菌肥，在PDB培养基中按体积1％比例接种复合微生物菌液及1％稀释的复合微生物菌肥，镰刀菌孢子终浓度106～107CFU/mL，30℃条件下200rpm振荡培养1～2d；革兰氏染色后，显微镜观察菌丝生长状态。观察结果显示：与未添加复合微生物菌剂的对照相比，添加复合微生物菌剂或复合微生物菌肥共培养的镰刀菌菌丝破裂、生长受到显著抑制(图3～5)。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3