一种表达果胶酸内切水解酶的工程菌及其应用的制作方法

本发明涉及一种表达果胶酸内切水解酶的工程菌及其应用，属于食品工程领域、生物工程和微生物工程领域。

背景技术：

果胶酸内切水解酶在食品工业、生物能源工业和植物活性物质药物成分提取过程中，具有降解果胶酸、促进植物多糖和纤维素糖化、促进植物细胞壁降解提高活性物质释放等多种应用。

目前果胶酸内切水解酶的工业生产工艺，主要采取丝状真菌固态发酵生产，常用的真菌有黑曲霉、米曲霉和木霉等。传统的黑曲霉和米曲霉等真菌发酵产果胶酸内切水解酶工艺的主要缺点是产量较低，在自然条件下，真菌需要在果胶酸或果胶酸酯等底物的诱导下，才能产生果胶酸内切水解酶和其他果胶酶，在其他碳源如葡萄糖或蔗糖存在的条件下，果胶酶的表达会受到抑制。

基因重组技术是解决葡萄糖或蔗糖等碳源抑制真菌果胶酶自然表达的有效方法，真菌果胶酸内切水解酶已经在丝状真菌中实现同源重组表达和在酵母菌中实现表达质粒重组表达，但表达效果比较差，产酶量约40u/mlmedium左右；相对于真菌表达系统而言，大肠杆菌表达系统是常用的、更为方便的表达系统，申请人在2007年用大肠杆菌表达系统实现了米曲霉果胶酸内切水解酶在大肠杆菌中的表达，表达效率70u/mlmedium，高于真菌表达系统，但是用大肠杆菌重组表达果胶酸内切水解酶工艺的主要缺点是产品容易混有内毒素，难以在食品工业进行广泛的应用，而且现有大肠杆菌表达米曲霉果胶酸内切水解酶的效率还有待进一步提高。

技术实现要素：

本发明针对缺乏能够高效表达食品级果胶酸内切水解酶的质粒及工程菌，提供了一种高效原核表达食品级果胶酸内切水解酶的质粒及工程菌。

本发明提供了一种能够在枯草芽孢杆菌中高效表达的果胶酸内切水解酶gshs-npg-shs，氨基酸序列如seqidno.2所示。

本发明提供了编码果胶酸内切水解酶的基因，所述基因核苷酸序列如seqidno.1所示。

本发明提供了一种表达所述果胶酸内切水解酶npg或含有所述编码果胶酸内切水解酶蛋白npg基因的表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体以pbscwz为出发载体，pbscwz载体的核苷酸序列如seqidno.9所示。

在本发明的一种实施方式中，所述pbscwz载体的核苷酸序列如seqidno.3所示。

本发明提供了一种表达所述果胶酸内切水解酶gshs-npg-shs的工程菌或细胞系。

在本发明的一种实施方式中，所述工程菌或细胞系是以枯草芽孢杆菌b.subtilis800为宿主，表达如seqidno.1所示的核苷酸序列。

本发明提供了一种制备果胶酸内切水解酶的方法，所述方法是以表达果胶酸内切水解酶npg的工程菌或细胞系为发酵菌株进行发酵产酶。

在本发明的一种实施方式中，所述方法为将所述表达果胶酸内切水解酶npg的基因工程菌或转基因细胞系的菌株接入含80～200μg/ml卡那霉素的lb培养基中35～40℃液体培养8h～16h得到菌液，将培养得到的菌液接入tb发酵液体培养基，35～40℃、150～250rpm培养至od600到0.7～1.0，加入终浓度为0.3～0.5mmiptg进行诱导，18～22℃培养，表达23～25h得到发酵液，将发酵液进行纯化得到所述果胶酸内切水解酶。

本发明提供了一种所述果胶酸内切水解酶gshs-npg-shs、表达果胶酸内切水解酶gshs-npg-shs的基因工程菌或转基因细胞系在食品工业、生物能源工业和植物活性物质药物成分提取过程中的应用。

本发明的有益效果：

(1)提供了一种米曲霉果胶酸内切水解酶的食品级产品的原核重组表达的方法，本发明优化设计并合成了适合枯草芽孢杆菌表达系统的米曲霉果胶酸内切水解酶基因npg，构建高效表达果胶酸内切水解酶的表达质粒(npg/pbscwz)和工程菌(npg/pbscwz/b.subtilis800)。

(2)npg对宿主细胞生长影响较小。摇瓶发酵表达结果表明，30℃条件下表达24h后，npg/pbscwz/b.subtilis800工程菌od600可以达到2.5，高于原始果胶酸内切水解酶独立表达的工程菌(od600为1.30)。

(3)本发明的工程菌表达的npg具有较高的可溶性蛋白产量，表达蛋白的活性产量达到350u/ml。

附图说明

图1是npg/pbscwz表达质粒结构图。

图2是npg/pbscwz双酶切的电泳图；泳道1为dnamarker，泳道2为npg/pbscwz双酶切。

图3是npg蛋白电泳图；泳道1为蛋白mark，泳道2为来自npg/pbscwz/b.subtilis800的上清蛋白，泳道3为来自npg/pbscwz/b.subtilis800的胞内沉淀，泳道4为来自pbscwz/b.subtilis800的胞内沉淀，泳道5为来自pbscwz/b.subtilis800的上清蛋白；箭头指向为目标蛋白。

图4是npg蛋白处理马铃薯块根组织块图；1是实验组，带杆箭头指向马铃薯块根组织块中被npg水解中胶层果胶后释放的单细胞，2是对照组，箭头指向马铃薯块根组织块中细胞的之间未发生变化的中胶层，图中标尺长度代表50μm。

具体实施方式

以下通过实施例来进一步阐明本发明，下列实施例用于说明目的而非用于限制本发明范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，基本上都按照常见的分子克隆手册所述的条件进行操作。

lb培养基：在1l去离子水中加入10g胰化蛋白胨、5g酵母提取物、5gnacl，用1mol/lnaoh调节ph至7.4，121℃高压下蒸汽灭菌20min。

tb培养基：甘油5g/l，蛋白胨12g/l，酵母膏24g/l，k2hpo412.54g/l，kh2po42.31g/l。

果胶酶水解酶酶活测定方法(详细步骤参照王小敏等，分光光度计法测定果胶酶活力的方法研究，食品工业科技分析检测vol.28,no.05,2007)：0.5ml反应体系含有50mmhac/naac(ph5.5)，1mg/ml果胶酸，适量的酶37℃条件下反应10min，为了检测反应体系中产生的还原糖的量，加0.5ml二硝基水杨酸(dinitrosalicylicacid，dns)试剂终止反应，然后检测在520nm处的吸收值，再根据标准曲线回归方程，换算得到还原糖浓度，然后计算裂解细胞上清的每毫升体积所含的总酶活，再计算相对于每毫升菌体培养液体积的总酶活。一个酶活单位定义为每分钟释放的产物等同于1μmol半乳糖醛酸的酶量。

实施例1npg基因设计及npg/pmd18t质粒构建

利用来源于米曲霉果胶酸内切水解酶a的npg基因，对其基因序列进行35个密码子优化，使其适合枯草芽孢杆菌表达系统，并在其上下游分别融合编码特定多肽gshs和shs(sssshhhhhhhhsss和sshhhhss)的核苷酸序列，在5’端添加ndeⅰ位点序列，在3’端加上salⅰ位点序列，化学合成如seqidno.1所示的核酸序列，其氨基酸序列如seqidno.2所示。

将合成的片段与pmd18t载体连接，转化dh5α(具体转化步骤参见全式金dh5α说明书)，转化产物涂布含100μg/ml氨苄青霉素的lb平板，经过37℃培养过夜(10h～14h)得到单克隆转化子，挑取单克隆至含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中在37℃、200rpm下培养8h得到菌液，将菌液进行菌落pcr鉴定，将鉴定通过的菌液提取质粒(步骤详见omega质粒提取试剂盒)，质粒酶切鉴定和测序验证，得到质粒npg/pmd18t。

菌落pcr所用引物：

f1：5’catatgtcttcttcttctcacc3’(seqidno.5)，

r1：5’gtcgacttaagaagagtggtggtggtgag3’(seqidno.6)。

实施例2npg/pbscwz表达载体结构设计和构建

设计表达质粒(npg/pbscwz)的核苷酸序列如seqidno.3所示，质粒结构如图1所示。

使用的载体为发明人构建的pbscwz载体(载体核苷酸序列如seqidno.9所示)，将pbscwz质粒和npg/pmd18t用ndeⅰ和salⅰ进行酶切(图2)，酶切产物切胶后进行胶回收(步骤详见omega胶回收试剂盒)，再用t4连接酶连接得到连接产物，将连接产物转化e.colidh5α感受态细胞，经过37℃培养过夜(10h～14h)至长出单克隆，挑取单克隆至含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中在37℃、200rpm下培养8h得到菌液，将菌液进行菌落pcr鉴定，菌落pcr所用引物为实施例1中的f1和r1。将鉴定通过的菌株(npg/pbscwz/dh5α)的菌液提取质粒(步骤详见omega质粒提取试剂盒)，质粒酶切鉴定和测序验证，验证通过的质粒即为npg/pbscwz。

实施例3npg/pbscwz/b.subtilis800表达工程菌构建

将质粒npg/pbscwz转化b.subtilis800，将转化液涂布于含100μg/ml卡那霉素的lb平板，经过37℃培养过夜(10h～14h)至长出单克隆，挑取单克隆至含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中在37℃、200rpm下培养8h得到菌液，将菌液进行菌落pcr鉴定并进行测序，菌落pcr所用引物为实施例1中的f1和r1。验证得到单克隆转化子npg/pbscwz/b.subtilis800(即gshs-npg-shs工程菌)。转化步骤：参照《分子克隆实验指南》(黄培堂等译，科学出版社2002年9月出版)。

实施例4蛋白npg表达与酶活测定

将实施例3得到的菌株分别以体积比1％的量接种在含100μg/ml卡那霉素的lb培养基中37℃液体培养过夜(10h～14h)得到菌液，将培养得到的菌液接入tb发酵液体培养基，37℃、200rpm培养至od600到0.8，加入终浓度为0.5mmiptg进行诱导，30℃培养，表达24h，得到发酵液。摇瓶发酵表达结果表明，30℃条件下表达24h后，gshs-npg-shs工程菌od600可以达到2.5。

将酶进行纯化：将发酵液于4℃、6000rpm离心10min，取菌体。加入10ml结合液a(20mm磷酸钠、0.5mmnacl、20mm咪唑、1％甘油，用hcl调ph至7.4)充分重悬菌体，然后将离心管置于冰浴中，放入超声波细胞破碎仪中，超声破碎的条件为：工作时间4s，间隔时间4s，共计10min。将获得的破碎液进行低温高速离心，4℃、8000rpm离心30min，得粗酶液。用0.45μm微孔滤膜过滤，备用。

准备镍离子亲和层析柱，首先，在4℃环境下利用恒流泵，向柱子里泵入去离子水冲洗柱子(约6～12倍柱体积)，然后用10ml结合液a平衡柱子环境。待柱子下端的流出液与泵入柱子的低盐浓度缓冲液(500mmol/lnacl，50mmpbs调节ph至6.0)ph值一致时(约需5倍柱体积缓冲液)，将得到的过膜粗酶液加入到柱子中。先用结合液a冲洗杂蛋白至基线平衡，再用洗脱液b(20mm磷酸钠、0.5mmnacl、500mm咪唑)洗脱。收集吸收峰的洗脱液，测定酶活，获得达到电泳纯的目的蛋白。

测定实施例3构建的工程菌表达米曲霉果胶酸内切水解酶的活性，结果显示，工程菌诱导表达24h后，所生产的米曲霉果胶酸内切水解酶产量达到350u/ml。

实施例5果胶酸内切水解酶处理食品材料实验

用1％(v/v)次氯酸钠对土豆块茎进行消毒，再用无菌的生理盐水清洗20g土豆，在室温条件下晾干。将土豆块茎切成2mm×2mm×2mm小块。2g土豆块茎小块用1ml反应溶液(50mmollnaachac，2μlnpg表达样品，ph5.0)37℃下处理0.5h。

如图4所示，图4中的1是利用果胶酸内切水解酶处理后得到的马铃薯块茎单细胞，2是未用果胶酸内切酶处理的马铃薯块茎组织切片，结果表明：果胶酸内切水解酶可以降解植物细胞之间的中胶层果胶，植物细胞会相互分离，显微镜镜检发现有单细胞被有效释放。

对比例1

(1)npg独立表达的工程菌的构建

化学合成如seqidno.4(其与实施例1中seqidno.1的区别在于未在序列两端添加多肽gshs和shs的核苷酸序列)所示的核苷酸序列(酶切位点为ndei和sali)，将其与pbscwz载体进行酶连后，转化b.subtilis800，将转化液涂布于含100μg/ml卡那霉素的lb平板，经过37℃培养过夜(10h～14h)至长出单克隆，挑取单克隆至含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中在37℃、200rpm下培养8h得到菌液，将菌液进行菌落pcr鉴定并进行测序，验证得到单克隆转化子npg/pbscwz/b.subtilis800。

菌落pcr所用引物：

f2：5’catatggactcctgtacattcac3’(seqidno.7)，

r2：5’gtcgacttaacatgaagcacctg3’(seqidno.8)。

(2)蛋白npg表达与酶活测定

具体实施方式参照实施例4，摇瓶发酵表达结果表明，30℃条件下表达24h后，果胶酸内切水解酶npg独立表达的工程菌od600为1.30，活性产量为50u/ml。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

sequencelisting

<110>盐城师范学院

<120>一种表达果胶酸内切水解酶的工程菌及其应用

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