一种碱性蛋白酶突变体及其基因、工程菌、制备方法和应用与流程

技术领域：
：本发明属于生物工程
技术领域：
，具体涉及一种碱性蛋白酶突变体及其基因、工程菌、制备方法和应用。技术背景：蛋白酶是催化蛋白肽键裂解，可将蛋白分子、多肽降解为小的肽链、氨基酸的一类水解酶，根据蛋白酶作用时适宜ph值的不同，可分为中性蛋白酶、酸性蛋白酶和碱性蛋白酶，其中碱性蛋白酶的最适反应ph值一般大于9，较其它蛋白酶而言，碱性蛋白酶的酶活力、耐热、耐碱能力更强，并且具有酯酶特性。这些优势使得碱性蛋白酶在工业上的应用更为广泛，其在洗涤剂、食品加工、饲料、环境保护、皮革制造和丝绸制造等行业都有着十分重要的作用。在洗涤剂中加入碱性蛋白酶能保持被洗衣物的原有色彩，提高产品的去污效果，有效减少洗涤剂中表面活性剂和某些助剂的用量，还能增加节水、节能和环境保护的效益。在食品中主要用来水解植物蛋白质，植物蛋白水解后转化成分子量更小的肽和氨基酸，更利于消化吸收，产品营养价值更高，产品质量和安全性也相对更好。在制革工艺中以蛋白质和蛋白质类似物为主要成分的皮与毛，通常情况下处理较为困难，传统的方法是利用有毒的化学物质进行处理，这种方法不但危害人们自身安全，而且对环境也有着很大的污染，而蛋白酶可以代替这些化学物质来降解制革过程中非胶质组分和非纤维蛋白，同时也可以减少环境的污染。微生物是蛋白酶的重要来源，相比于植物蛋白酶和动物蛋白酶，微生物由于其生长迅速、易于人工遗传改造，产生的蛋白酶类资源丰富微生物可以在相对较短的时间内大量培养，因此可以生产大量的满足生产需要的酶类。产碱性蛋白酶的微生物主要从盐碱湖、深海、沙地等碱性环境中分离得到，目前，芽孢杆菌、放线菌以及真菌均有报道可以产碱性蛋白酶，但在工业生产中主要是芽孢杆菌属。然而，由于菌株自身产酶能力有限，导致了发酵酶活水平不高，芽孢杆菌产碱性蛋白酶的产品成本较高，限制了其大规模的应用。因此，提高碱性蛋白酶活力对其在工业生产及应用具有重要的意义。蛋白质工程是建立在基因工程基础上的新技术，主要依靠计算机软件等辅助设计和蛋白质化学等多学科的基础知识，通过对蛋白编码基因的人工定向改造，对蛋白质进行修饰、改造和拼接以获得能满足人类需要的新型蛋白质的技术。酶的定向进化又称为酶的体外分子定向进化，属于蛋白质的非理性设计，是蛋白质工程新的发展方向，它不用事先了解蛋白质的结构、活性位点、催化机制等因素，而是模拟自然进化过程，人为地创造特殊的进化条件，从一个或多个已经存在的亲本酶(天然的或者人为获得的酶前体)出发，在体外或体内对基因进行随机突变或体外基因重组，构建人工突变酶库，进一步通过一定的筛选或选择方法，最终获得预先所期望的具有某些特性的进化酶。体外定向进化常用方法主要是易错pcr(error-pronepcr)和dna改组(dnashuffling)。易错pcr是通过利用低保真度taqdna聚合酶和改变pcr反应条件，如加入mn、改变循环次数和dntp浓度等，降低dna复制的保真度，在新dna链合成过程中增加碱基错配，从而使扩增产物出现较多点突变的一种体外诱导dna序列变异的方法。dna改组是将一个或一组密切相关的基因序列，在dnasei作用下切割成一系列随机大小的dna小片段，由于基因的同源性，这些小片段之间有部分的碱基序列重叠，它们通过自身引导，随机重组，最后通过特定引物的pcr，生成全长基因，在这一过程中，由于模板的变换产生了相关序列间的交换，从而产生了多样的基因重组文库，再进一步对改组的基因表达的产物进行筛选，从而达到目的基因的定向进化。芽孢杆菌表达系统具有以下优点：1、芽孢杆菌拥有一套高效的分泌信号肽和分子伴侣系统，这有利于实现目的蛋白的高效表达；2、大多数芽孢杆菌都是没有致病性的，这符合工业生产中的一般安全需求；3、芽孢杆菌的细胞壁组成要相对简单，这有利于表达蛋白的胞外分泌，不会导致分泌蛋白在细胞内积累，有利于蛋白的下游回收和纯化；4、芽孢杆菌作为单细胞生物，可以较短时间内达到较高的菌体密度，且所需培养基组成相对较简单，成本较低符合工业生产的要求。因此，本发明中，基于碱性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的表达平台，利用易错pcr及dna改组技术，对来源于克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶基因进行分子改造，获得高活力碱性蛋白酶基因，并成功在解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌体系中进行表达。技术实现要素：：本发明目的在于提供一种碱性蛋白酶突变体及其基因、工程菌、制备方法和应用。本发明为实现上述目的提供的技术方案之一为：以克劳氏芽孢杆菌cgmccno.12953基因组为模板，克隆出野生型碱性蛋白酶酶原区基因apr(seqidno.3所示)序列后(氨基酸序列如seqidno.4所示)，通过连续易错pcr对野生型碱性蛋白酶基因进行随机突变，再利用枯草芽孢杆菌表达系统进行高通量筛选获得若干碱性蛋白酶高活力突变体基因，再将这些高活力碱性蛋白酶突变体基因进行dna改组，经过筛选后获得高活力的碱性蛋白酶突变体基因。为了实现上述目的，本发明提供的技术方案之二为：将上述突变体基因构建重组载体并在解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌中成功表达，得到产酶活力提高的重组菌株，进一步通过发酵工艺优化获得新型碱性蛋白酶，可应用在洗涤剂、食品、制革、医药等领域。在本发明中采用如下定义：1、氨基酸和dna核酸序列的命名法使用氨基酸残基的公认iupac命名法，采用三字母代码形式。dna核酸序列采用公认iupac命名法。2、碱性蛋白酶高活力突变体的标识采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示碱性蛋白酶高活力突变体中突变的氨基酸。在本发明中，碱性蛋白酶的突变点位置按其成熟肽的氨基酸序列进行编号，位置的编号对应于seqidno.6中野生型碱性蛋白酶成熟肽的氨基酸序列编号，如asn212表示野生型碱性蛋白酶成熟肽氨基酸序列的第212位氨基酸为asn，asn212ser表示位置212的氨基酸由野生型碱性蛋白酶的asn替换成ser，也可用氨基酸单字母简称进行表示，如n212s，同时发生多位点突变的采用“/”连接各突变位点的方式表示，如v11i/g95v/v145i/n212s，表示位置11、95、145和212位的氨基酸依次由野生型碱性蛋白酶的v替换成i、由g替换为v、由v替换为i、由n替换为s；核苷酸表示方法与氨基酸表示方法类似，位置的编号对应于seqidno.5中野生型碱性蛋白酶的核苷酸序列编号，如c425，表示碱性蛋白酶核苷酸序列的第425位碱基为c。在本发明中，apr表示野生型碱性蛋白酶，即原始序列如seqidno.4所示，其编码基因表示为apr(如seqidno.3所示)。用aprm加数字x的方式表示各个碱性蛋白酶突变体，各突变体的编码基因则以其氨基酸表示形式的小写斜体表示。本发明中，所述碱性蛋白酶突变体具有蛋白水解活性，其成熟肽是：(1)在seqidno.6所示的野生型碱性蛋白酶成熟肽基础上发生包含以下突变中的任意一种获得的：v11i/g23a/g25p/i35v/g95p/s99h/v145i/n212s/a267g、v11l/g23a/g25p/i35v/g95p/s99h/v145i/n212s/a267g、v11l/g23a/g25a/i35v/g95p/s99h/v145i/n212s/a267g、v11i/g23a/g25a/i35v/g95p/s99h/v145i/n212s/a267g、v11i/g23a/g25a/i35v/g95p/s99h/v145i/n212s/a267p、v11l/g23a/g25a/i35v/g95p/s99h/v145i/n212s/a267p、v11i/g23a/g25p/i35v/g95p/s99h/v145i/n212s/a267p、v11l/g23a/g25p/i35v/g95p/s99h/v145i/n212s/a267p；或(2)与(1)同源性75％以上的氨基酸序列；或(3)在(1)的基础上进行一个或多个氨基酸替换，和/或缺失，和/或添加后获得的具有(1)相同功能的氨基酸序列。本发明还提供上述突变体的编码基因；优选地，所述突变体的编码基因如seqidno.7-14任一所示。本发明还提供包含上述突变体或其编码基因的重组载体或重组菌；进一步地，所述重组载体的表达载体为pbsa43；进一步地，表达所述突变体编码基因的宿主细胞为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或克劳氏芽孢杆菌；优选地，所述枯草芽孢杆菌为wb600；优选地，所述解淀粉芽孢杆菌为cgmccno.11218；优选地，所述地衣芽孢杆菌为tccc11965；优选地，所述克劳氏芽孢杆菌为cgmccno.12953。pbsa43是以大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭克隆载体pbe2为骨架，克隆入一个强的芽孢杆菌组成型启动子p43，以及能够使重组蛋白直接分泌到培养基中果聚糖蔗糖酶信号序列sacb而获得。它带有ampr基因，可以在大肠杆菌中利用氨苄青霉素抗性作为筛选标记；同时也具有kmr基因，可以在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中利用卡那霉素抗性作为筛选标记。本发明实验步骤具体如下：(1)将来自克劳氏芽孢杆菌的碱性蛋白酶基因通过易错pcr进行随机突变，获得随机突变的基因aprmx1，将其连接到表达载体后转化至枯草芽孢杆菌wb600中进行筛选，将获得的高活力突变体基因作为模板再次进行易错pcr，重复三轮，最终获得若干碱性蛋白酶高活力突变体基因；(2)将经易错pcr筛选获得的高活力突变体基因进行dna改组，再将改组后的突变基因aprmx2连接到表达载体后转化至枯草芽孢杆菌中，通过高通量筛选后获得了八个碱性蛋白酶高活力突变体基因；(3)将获得的碱性蛋白酶高活力突变体基因连接到表达载体，将其转至解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌及克劳氏芽孢杆菌中，获得各重组菌株；(4)表达所述的重组菌株，纯化后获得碱性蛋白酶高活力突变体aprmx。有益效果：1、本发明使用易错pcr技术及dna改组技术，对野生型碱性蛋白酶基因进行突变，筛选获得了八个碱性蛋白酶高活力突变体。2、本发明中碱性蛋白酶高活力突变体基因在枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌表达系统中进行了表达，并经过纯化制得了高活力碱性蛋白酶酶粉。附图说明：图1为野生型碱性蛋白酶酶原基因的pcr扩增电泳图。其中：m为dnamarker，1为碱性蛋白酶酶原基因apr。图2为pbas43-apr质粒酶切验证图。其中：m为dnamarker，1为pbsa43-apr经bamhi和hindiii双酶切图。图3为碱性蛋白酶突变体基因易错pcr扩增电泳图。其中：m为dnamarker，1、2为碱性蛋白酶突变体基因aprmx1易错pcr扩增电泳图。图4为碱性蛋白酶突变体基因dna改组产物电泳图。其中：m为dnamarker，1、2为碱性蛋白酶突变体改组基因aprmx2电泳图。图5为本发明重组质粒pbsa43-aprmx酶切验证图。其中：m为dnamarker，1、2、3、4、5、6、7、8分别为重组质粒pbsa43-aprm1、pbsa43-aprm2、pbsa43-aprm3、pbsa43-aprm4、pbsa43-aprm5、pbsa43-aprm6、pbsa43-aprm7、pbsa43-aprm8经bamhi和hindiii双酶切图。图6为野生型碱性蛋白酶apr酶学性质曲线图。其中：a为野生型碱性蛋白酶apr最适反应温度曲线图；b为野生型碱性蛋白酶apr最适反应ph曲线图；c为野生型碱性蛋白酶apr在60℃条件下的温度稳定性曲线图；d为野生型碱性蛋白酶apr在ph＝11条件下的ph稳定性曲线图。具体实施方式：为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。本发明所使用的地衣芽孢杆菌为tccc11965，公开于：developmentandapplicationofacrispr/cas9systemforbacilluslicheniformisgenomeediting[j].internationaljournalofbiologicalmacromolecules,2019,122:329-337，目前保存于天津科技大学微生物菌种保藏管理中心，公众可从该中心获取菌种。实施例1野生型碱性蛋白酶基因的获得1、野生型碱性蛋白酶基因来自实验室保存的克劳氏芽孢杆菌(bacillusclausii)cgmccno.12953菌株，利用试剂盒(omega:bacterialdnakit)提取其基因组dna，其中克劳氏芽孢杆菌基因组dna的提取步骤如下：(1)菌株活化：用接种环从甘油管中蘸取少许菌液接种于lb固体培养基平板上，三区划线，37℃恒温培养12h；(2)转接：从培养菌体的平板上挑取单菌落接种于含5ml液体lb培养基中，于220rpm，37℃条件下振荡培养12h；(3)收集菌体：取适量培养菌液分装于已灭菌的1.5mlep管中，12000rpm离心1min收集菌体，弃上清；(4)加入100μlddh2o重悬菌体，并加入50μl的50mg/ml溶菌酶，37℃水浴10min；(5)加入100μlbtlbuffer和20μl蛋白酶k，旋涡振荡，55℃水浴40-50min，每隔20-30min，振荡混匀；(6)加入5μlrna酶，颠倒混匀数次，室温放置5min；(7)12000rpm离心2min，去掉未消化部分，将上清部分转移至新的1.5mlep管中，加入220μlbdlbuffer，振荡混匀，65℃水浴10min；(8)加入220μl无水乙醇，吹吸混匀；(9)将ep管中的液体转移至吸附柱中静止2min，12000rpm离心1min，将滤液重新倒入吸附柱中静置、离心，重复两次，弃滤液；(10)加入500μlhbcbuffer，静置2min，12000rpm离心1min，弃滤液；(11)加入700μldnawashbuffer，静置2min，12000rpm离心1min，弃滤液；(12)加入500μldnawashbuffer，静置2min，12000rpm离心1min，弃滤液；(13)12000rpm空离2min，将吸附柱放到一个新的ep管上，置于55℃金属浴10min，晾干；(14)加入50μl的55℃分子水，室温静置3-5min，12000rpm离心2min收集基因组。2、以提取的克劳氏芽孢杆菌的基因组为模板，根据genbank序列号fj940727.1登录的碱性蛋白酶序列，在orf框上下游设计一对引物，分别引入限制性酶切位点bamhi、hindiii，本发明的碱性蛋白酶基因的扩增引物如下：上游引物p1(seqidno.1)：5’-cgcggatccgctgaagaagcaaaagaaaaatatttaat-3’下游引物p2(seqidno.2)：5’-cccaagcttttagcgtgttgccgcttct-3’以p1和p2作为上、下游引物，以克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶基因组为模板进行扩增。其扩增的反应体系为：扩增程序为：95℃预变性10min；94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸1min20s，反应30个循环；72℃延伸10min。pcr扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，得到1059bp的条带(图1)，用小量dna回收试剂盒回收pcr产物，得到本发明的野生型碱性蛋白基因apr(seqidno.3)，将扩增获得的apr与载体pbsa43载体连接，得到重组质粒pbsa43-apr，酶切验证如图2所示，并将其转化至大肠杆菌jm109及枯草芽孢杆菌wb600中。实施例2易错pcr构建碱性蛋白酶突变体文库筛选高活力碱性蛋白酶突变体1、基于易错pcr技术进行随机突变，构建碱性蛋白酶突变体文库，设计引物如下：上游引物p1(seqidno.1)：5’-cgcggatccgctgaagaagcaaaagaaaaatatttaat-3’下游引物p2(seqidno.2)：5’-cccaagcttttagcgtgttgccgcttct-3’在易错pcr反应体系中，以p1和p2作为上、下游引物，以野生型碱性蛋白酶基因apr为模板，进行易错pcr。其扩增的反应体系为：扩增程序为：95℃预变性10min；98℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸1min20s反应30个循环；72℃延伸10min。pcr扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳(图3)，用小量dna回收试剂盒回收pcr产物，得到带有随机突变的碱性蛋白酶的基因aprmx1(x1表示若干不同的随机突变基因)。2、将碱性蛋白酶随机突变体基因aprmx1与表达载体pbsa43连接后转化至jm109中并提取其质粒即得重组质粒pbsa43-aprmx1，再将重组质粒pbsa43-aprmx1转化至枯草芽孢杆菌wb600中，将转化子挑接至装有500μl的lb液体培养基的48孔板中，放入四十八孔板摇床在37℃，750r/min条件下培养48h，培养完成后离心取上清即得碱性蛋白酶粗酶液，用短肽底物法测定碱性蛋白酶酶活力，从中挑出比酶活力比野生型高的转化子。再以高酶活力转化子质粒为模板进行连续易错pcr，按上述方式进行筛选，重复三次，最终筛选获得若干株碱性蛋白酶活力较高的突变体菌株，以这些高活力碱性蛋白酶突变体质粒为模板进行dna改组。3、短肽底物测定碱性蛋白酶酶活力短肽底物：将n-succinyl-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilide(aapf，用氨基酸单字母简称表示，下同)、aapy、aapw、aapa、aapr、aapn、aapd、aapc、aapq、aape、aapg、aaph、aapi、aapl、aapk、aapm、aapp、aaps、aapt、aapv混合，用二甲基亚砜(dmso)溶解，使得每种底物的浓度均为6mmol/l(方法参考专利《一种测定蛋白酶活力的新方法》，申请号：201910730238.2)。测定方法：在96孔板中加入80μlph10.5的硼酸缓冲液和20μl短肽底物溶液，在40℃水浴锅中保温1min，再加入100μl稀释后的酶液(阴性对照中加100μlph10.5的硼酸缓冲液)，40℃反应10min，用酶标仪在410nm测定其吸光值。在上述条件下，1ml酶液1min水解底物产生1μmol对硝基苯胺定义为一个酶活力单位u。实施例3dna改组构建碱性蛋白酶突变体文库筛选高活力碱性蛋白酶突变体将实施例2中经易错pcr筛选得到的碱性蛋白酶突变体基因进行dna改组，再通过高通量筛选得到高活力碱性蛋白酶突变体。1、碱性蛋白酶突变体基因的片段化提取易错pcr筛选获得的碱性蛋白酶突变体菌株的质粒，使用限制性内切酶bamhi和hindiii酶切重组质粒，切胶回收碱性蛋白酶突变体基因的dna片段，将这些突变体基因的dna片段等量混匀，取1μg加入100μl缓冲体系(50mmol/ltris-hclph7.4，1mmol/lmgcl2)中，再加入终浓度为0.01udnasei，37℃酶切20min，90℃灭活10min。酶切产物经2％琼脂糖凝胶电泳，用小量dna回收试剂盒回收50-200bp左右的片段。2、无引物pcr将上述消化后回收的小片段作为模板，互为引物进行无引物pcr。其扩增的反应体系为：10×pcrbuffer(无mg2+)5.0μl25mmmgcl25.0μldntps5.0μldna片段模板2.0μlrtaqdna聚合酶0.5μlddh2o37.5μl扩增程序为：95℃预变性10min；98℃变性10s，50℃退火30s，72℃延伸1min20s，反应30个循环；72℃延伸10min。pcr扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳，用小量dna回收试剂盒回收1kb左右的dna片段。3、有引物pcr取无引物pcr产物为模板进行第二轮有引物pcr，其扩增引物如下：上游引物p1(seqidno.1)：5’-cgcggatccgctgaagaagcaaaagaaaaatatttaat-3’下游引物p2(seqidno.2)：5’-cccaagcttttagcgtgttgccgcttct-3’其扩增的反应体系为：扩增程序为：95℃预变性10min；94℃变性30s，57℃退火45s，72℃延伸1min20s，反应30个循环；72℃延伸10min。pcr扩增产物经0.8％琼脂糖凝胶电泳(图4)，用小量dna回收试剂盒回收1kb左右的dna片段即为碱性蛋白酶的改组基因aprmx2(x2表示若干不同的改组基因)。4、将碱性蛋白酶改组基因aprmx2分别克隆入表达载体pbsa43中，得到若干重组质粒pbsa43-aprmx2，并转化至jm109中并提取其质粒即得重组质粒pbsa43-aprmx2，再将重组质粒pbsa43-aprmx2转化至枯草芽孢杆菌wb600中，将转化子挑接至装有500μl的lb液体培养基的48孔板中，放入四十八孔板摇床在37℃，750r/min条件下培养48h，培养完成后离心取上清即得碱性蛋白酶粗酶液，用实施例2中的短肽底物法测定碱性蛋白酶酶活力，从中挑出比酶活力比野生型高的转化子。经过筛选，得到了八株碱性蛋白酶活力较高的突变体菌株wb600/pbsa43-aprmx(x分别为1-8，aprmx表示表示8个不同的突变体编码基因，具体如表1)，将所获得的高活力碱性蛋白酶突变体菌株提取质粒并进行测序(北京华大生物工程公司)。结果表明，获得的8个高活力碱性蛋白酶突变体信息如下表：表1碱性蛋白酶突变体信息实施例4碱性蛋白酶高活力突变体比酶活力评估将上述实施例3步骤4所获得的突变体重组菌株wb600/pbsa43-aprmx(x分别为1、2、3、4、5、6、7、8，下同)和野生型重组菌株wb600/pbsa43-apr接种于5ml的lb液体培养基(含卡那霉素，50μg/ml)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50ml新鲜lb培养基(含卡那霉素，50μg/ml)中，继续以37℃，220r/min培养48h。发酵液离心取上清，先以25％饱和度的硫酸铵盐析除去杂蛋白，再把饱和度加大到65％，沉淀目的蛋白。溶解后，透析除盐，再将盐析脱盐后得到的活性组分用0.02mol/ltris-hcl(ph7.0)缓冲液溶解，上样至纤维素离子交换层析柱后用同样的缓冲液先洗脱未吸附的蛋白，再用含不同浓度nacl(0～1mol/l)的0.02mol/ltris-hcl(ph7.0)缓冲液梯度洗脱，收集目的蛋白。离子交换得到的活性组分先用含0.15mol/lnacl的0.02mol/ltris-hcl(ph7.0)缓冲液平衡，上样至sephadexg25凝胶层析柱后用相同的缓冲液以0.5ml/min的速度洗脱，获得纯化的酶液。使用实施例2中的短肽底物法测定其碱性蛋白酶活力；蛋白质浓度由bca蛋白浓度测定试剂盒测定，按照其说明书进行操作，碱性蛋白酶比酶活力为酶活力(u/ml)与蛋白质浓度(mg/ml)的比值。将野生型重组菌株比酶活力定为1，突变体重组菌株比酶活力以野生型重组菌株比酶活力倍数进行表示，其结果如下表所示。碱性蛋白酶比活力酶学性质测定：对野生型及突变体的酶学性质进行测定，结果如图6所示，野生型碱性蛋白酶最适反应温度为60℃，最适反应ph为10，在ph10，60℃条件下保温40h其残余酶活在6％左右，在60℃，ph＝11条件下保温70h其残余酶活在21％左右，突变体酶学性质与野生型基本一致。实施例5碱性蛋白酶高活力突变体在其它芽孢杆菌中的构建将1μl(50ng/μl)的pbsa43-aprmx和pbsa43-apr重组质粒分别加入到50μl的解淀粉芽孢杆菌cgmccno.11218、地衣芽孢杆菌tccc11965、克劳氏芽孢杆菌cgmccno.12953感受态细胞中并混匀，之后转移到预冷的电转杯(1mm)中，冰浴1-1.5min后，电击一次(25μf，200ω，4.5-5.0ms)。电击完毕之后，立即加入1ml复苏培养基(lb+0.5mol/l山梨醇+0.38mol/l甘露醇)。37℃摇床，震荡培养3h之后，将复苏物涂布于含有卡那霉素的lb平板上，37℃培养12-24h，挑取阳性转化子，并进行双酶切验证(图5)，确定获得表达突变体基因aprmx和野生型基因apr的解淀粉芽孢杆菌重组菌株、地衣芽孢杆菌重组菌株、克劳氏芽孢杆菌重组菌株，分别命名为cgmccno.11218/pbsa43-aprmx、cgmccno.11218/pbsa43-apr；tccc11965/pbsa43-aprmx、tccc11965/pbsa43-apr；cgmccno.12953/pbsa43-aprmx、cgmccno.12953/pbsa43-apr。实施例6碱性蛋白酶突变体在解淀粉芽孢杆菌重组菌株中的表达及制备分别将解淀粉芽孢杆菌突变体重组菌株cgmccno.11218/pbsa43-aprmx和野生型重组菌cgmccno.11218/pbsa43-apr接种于5ml的lb液体培养基(含卡那霉素，50μg/ml)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50ml新鲜lb培养基(含卡那霉素，50μg/ml)中，继续以37℃，220r/min培养48h。发酵液离心取上清，先以25％饱和度的硫酸铵盐析除去杂蛋白，再把饱和度加大到65％，沉淀目的蛋白。溶解后，透析除盐，再将盐析脱盐后得到的活性组分用0.02mol/ltris-hcl(ph7.0)缓冲液溶解，上样至纤维素离子交换层析柱后用同样的缓冲液先洗脱未吸附的蛋白，再用含不同浓度nacl(0～1mol/l)的0.02mol/ltris-hcl(ph7.0)缓冲液梯度洗脱，收集目的蛋白。离子交换得到的活性组分先用含0.15mol/lnacl的0.02mol/ltris-hcl(ph7.0)缓冲液平衡，上样至sephadexg25凝胶层析柱后用相同的缓冲液以0.5ml/min的速度洗脱，获得纯化的酶液，经冷冻干燥制得碱性蛋白酶纯酶酶粉。制得的酶粉可以应用于洗涤剂、食品、制革、医药等行业领域。实施例7碱性蛋白酶突变体在地衣芽孢杆菌重组菌株中的表达及制备分别将地衣芽孢杆菌突变体重组菌株tccc11965/pbsa43-aprmx和野生型重组菌tccc11965/pbsa43-apr接种于5ml的lb液体培养基(含卡那霉素，50μg/ml)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50ml新鲜lb培养基(含卡那霉素，50μg/ml)中，继续以37℃，220r/min培养48h。发酵液离心取上清，先以25％饱和度的硫酸铵盐析除去杂蛋白，再把饱和度加大到65％，沉淀目的蛋白。溶解后，透析除盐，再将盐析脱盐后得到的活性组分用0.02mol/ltris-hcl(ph7.0)缓冲液溶解，上样至纤维素离子交换层析柱后用同样的缓冲液先洗脱未吸附的蛋白，再用含不同浓度nacl(0～1mol/l)的0.02mol/ltris-hcl(ph7.0)缓冲液梯度洗脱，收集目的蛋白。离子交换得到的活性组分先用含0.15mol/lnacl的0.02mol/ltris-hcl(ph7.0)缓冲液平衡，上样至sephadexg25凝胶层析柱后用相同的缓冲液以0.5ml/min的速度洗脱，获得纯化的酶液，经冷冻干燥制得碱性蛋白酶纯酶酶粉。制得的酶粉可以应用于洗涤剂、食品、制革、医药等行业领域。实施例8碱性蛋白酶突变体在克劳氏芽孢杆菌重组菌株中的表达及制备分别将克劳氏芽孢杆菌突变体重组菌株cgmccno.12953/pbsa43-aprmx和野生型重组菌cgmccno.12953/pbsa43-apr接种于5ml的lb液体培养基(含卡那霉素，50μg/ml)中，37℃，220r/min培养过夜，按照2％接种量转接于50ml新鲜lb培养基(含卡那霉素，50μg/ml)中，继续以37℃，220r/min培养48h。发酵液离心取上清，先以25％饱和度的硫酸铵盐析除去杂蛋白，再把饱和度加大到65％，沉淀目的蛋白。溶解后，透析除盐，再将盐析脱盐后得到的活性组分用0.02mol/ltris-hcl(ph7.0)缓冲液溶解，上样至纤维素离子交换层析柱后用同样的缓冲液先洗脱未吸附的蛋白，再用含不同浓度nacl(0～1mol/l)的0.02mol/ltris-hcl(ph7.0)缓冲液梯度洗脱，收集目的蛋白。离子交换得到的活性组分先用含0.15mol/lnacl的0.02mol/ltris-hcl(ph7.0)缓冲液平衡，上样至sephadexg25凝胶层析柱后用相同的缓冲液以0.5ml/min的速度洗脱，获得纯化的酶液，经冷冻干燥制得碱性蛋白酶纯酶酶粉。制得的酶粉可以应用于洗涤剂、食品、制革、医药等行业领域。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利构思的前提下，上述各实施方式还可以做出若干变形、组合和改进，这些都属于本专利的保护范围。因此，本专利的保护范围应以权利要求为准。sequencelisting<110>天津科技大学山东隆科特酶制剂有限公司<120>一种碱性蛋白酶突变体及其基因、工程菌、制备方法和应用<130>1<160>14<170>patentinversion3.5<210>1<211>38<212>dna<213>人工序列<400>1cgcggatccgctgaagaagcaaaagaaaaatatttaat38<210>2<211>28<212>dna<213>人工序列<400>2cccaagcttttagcgtgttgccgcttct28<210>3<211>1059<212>dna<213>克劳氏芽孢杆菌（bacillusclausii）<400>3gctgaagaagcaaaagaaaaatatttaattggctttaatgagcaggaagctgtcagtgag60tttgtagaacaagtagaggcaaatgacgaggtcgccattctctctgaggaagaggaagtc120gaaattgaattgcttcatgaatttgaaacgattcctgttttatccgttgagttaagccca180gaagatgtggacgcgcttgaactcgatccagcgatttcttatattgaagaggatgcagaa240gtaacgacaatggcgcaatcagtgccatggggaattagccgtgtgcaagccccagctgcc300cataaccgtggattgacaggttctggtgtaaaagttgctgtcctcgatacaggtatttcc360actcatccagacttaaatattcgtggtggcgctagctttgtaccaggggaaccatccact420caagatgggaatgggcatggcacgcatgtggccgggacgattgctgctttaaacaattcg480attggcgttcttggcgtagcgccgagcgcggaactatacgctgttaaagtattaggggcg540agcggttcaggttcggtcagctcgattgcccaaggattggaatgggcagggaacaatggc600atgcacgttgctaatttgagtttaggaagcccttcgccaagtgccacacttgagcaagct660gttaatagcgcgacttctagaggcgttcttgttgtagcggcatctgggaattcaggtgca720ggctcaatcagctatccggcccgttatgcgaacgcaatggcagtcggagctactgaccaa780aacaacaaccgcgccagcttttcacagtatggcgcagggcttgacattgtcgcaccaggt840gtaaacgtgcagagcacatacccaggttcaacgtatgccagcttaaacggtacatcgatg900gctactcctcatgttgcaggtgcagcagcccttgttaaacaaaagaacccatcttggtcc960aatgtacaaatccgcaatcatctaaagaatacggcaacgagcttaggaagcacgaacttg1020tatggaagcggacttgtcaatgcagaagcggcaacacgc1059<210>4<211>353<212>prt<213>克劳氏芽孢杆菌（bacillusclausii）<400>4alagluglualalysglulystyrleuileglypheasngluglnglu151015alavalsergluphevalgluglnvalglualaasnaspgluvalala202530ileleuserglugluglugluvalgluilegluleuleuhisgluphe354045gluthrileprovalleuservalgluleuserprogluaspvalasp505560alaleugluleuaspproalailesertyrileglugluaspalaglu65707580valthrthrmetalaglnservalprotrpglyileserargvalgln859095alaproalaalahisasnargglyleuthrglyserglyvallysval100105110alavalleuaspthrglyileserthrhisproaspleuasnilearg115120125glyglyalaserphevalproglygluproserthrglnaspglyasn130135140glyhisglythrhisvalalaglythrilealaalaleuasnasnser145150155160ileglyvalleuglyvalalaproseralagluleutyralavallys165170175valleuglyalaserglyserglyservalserserilealaglngly180185190leuglutrpalaglyasnasnglymethisvalalaasnleuserleu195200205glyserproserproseralathrleugluglnalavalasnserala210215220thrserargglyvalleuvalvalalaalaserglyasnserglyala225230235240glyserilesertyrproalaargtyralaasnalametalavalgly245250255alathraspglnasnasnasnargalaserpheserglntyrglyala260265270glyleuaspilevalalaproglyvalasnvalglnserthrtyrpro275280285glyserthrtyralaserleuasnglythrsermetalathrprohis290295300valalaglyalaalaalaleuvallysglnlysasnprosertrpser305310315320asnvalglnileargasnhisleulysasnthralathrserleugly325330335serthrasnleutyrglyserglyleuvalasnalaglualaalathr340345350arg<210>5<211>807<212>dna<213>克劳氏芽孢杆菌（bacillusclausii）<400>5gcgcaatcagtgccatggggaattagccgtgtgcaagccccagctgcccataaccgtgga60ttgacaggttctggtgtaaaagttgctgtcctcgatacaggtatttccactcatccagac120ttaaatattcgtggtggcgctagctttgtaccagggga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