本发明涉及一种无患子三萜类皂苷单体的制备方法，属于生物检测技术领域。
背景技术：
无患子来源无患子科(sapindaceae)，学名：无患子(sapindusmukorossigaertn)，属落叶乔木，俗称“菩提树、皂果、肥皂树”等，主要产于我国长江流域以南的广东、广西、云南、贵州、四川及其沿江省区。《本草纲目》中记载，无患子果皮可用于洗发洗面。无患子果皮含有丰富的皂苷(即无患子皂苷)，其中大部分为三萜类皂苷，三萜类皂苷又包含五环三萜类齐墩果烷型皂苷(如常春藤皂苷)、五环三萜类甘遂烷型皂苷和四环三萜类达玛烷型皂苷，总含量约为5.33％。无患子皂苷为天然的非离子型表面活性剂，临界胶束浓度和表面张力均较低，能显著降低水的表面张力，泡沫丰富，手感细腻，去污力强。经测定表面张力，超声波萃取无患子汁液的去油污能力优于市购洗涤剂，有研究者将无患子皂苷与其他市售表面活性剂复配得到餐具洗涤剂，显示出较好的综合洗涤性能。无患子皂苷为纯天然产物，可100％降解，长期使用不会对人体和环境有害，愈来愈广泛应用于日化行业中，特别是洗涤和化妆品中。目前国内市场上已有添加了无患子皂苷的化妆品出售，例如迪奥、高斯、仙美无患等。
为有效提取无患子果皮中皂苷成分和控制其质量，本领域国内外学者对其分离提取纯化及含量检测等进行了大量的实验研究。在已有提取方法研究中，无患子总皂苷有多种提取方式，主要包括溶剂浸提、酶提取、超声提取、微波提取、蒸汽提取等方式，解辉等研究人员将无患子水提液经大孔树脂吸附分离和硅胶柱吸附分离后，得到无患子总皂苷的标准品，纯度大于96％，可作为无患子总皂苷质控品。进一步，伍恒等通过大孔树脂柱联合mci柱分离得到不同的皂苷混合物。国内外市场上仅有α-常春藤皂苷等3种无患子皂苷成分单体质控品提供，但均不是无患子果皮表面活性物质三萜类皂苷的主要成分，采用这些质控品不能有效控制无患子皂苷果皮、无患子皂苷提取物原料以及无患子皂苷为主要表面活性成分的洗护产品质量。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种工艺简单、制备物纯度较高的一种无患子三萜类皂苷单体的制备方法。
该方法包括以下步骤：
1)用无患子果皮制备无患子皂苷提取液；
2)对无患子皂苷提取液进行萃取提纯除杂，浓缩成稠膏；
3)稠膏用水稀释成溶液，用大孔吸附树脂柱对溶液进行吸附；对吸附后的大孔吸附树脂柱进行洗脱，并收集洗脱液；
4)将收集的洗脱液蒸发至干，得固体物；
5)将固体物用溶剂制成溶液或混悬液后加入硅胶中吸收制成样品-硅胶混合物，然后装入已预装硅胶的层析柱中，用洗脱液洗脱，控制流速为每g层析柱中硅胶0.002-0.05ml/min的范围，分份收集洗脱液，每份体积为40-120ml/kg柱填料，根据薄层色谱和高效液相色谱显示无成分流出后，停止洗脱；根据薄层色谱和高效液相色谱显示，对含有相同皂苷成分的洗脱液分别进行合并；对合并后的洗脱液蒸发至干，得固体物；
6)取固体物真空干燥，主要得以下四类组分：
a类组分包含：sapindosideb和/或sapindosidec混合物；
b类组分包含：rarasaponinii、sapinmusaponionk和/或sapinmusaponionl混合物；
c类组分包含：rarasaponiniii和/或rarasaponinvi混合物；
d类组分包含：sapinmusaponionm和/或sapinmusaponionn；
7)对步骤6)得到的上述四类组分进行色谱分离，最后得到包含sapindosideb、sapindosidec、rarasaponinii、sapinmusaponionk、sapinmusaponionl、rarasaponiniii、rarasaponinvi、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn中一种或多种的皂苷成分单体。
进一步的，当单个成分未达到纯度要求时，则重复使用步骤7)的色谱分离，直至达到纯度要求。
进一步的，上述所述步骤7)中的色谱分离方式包括：取步骤6)中的四类组分各一份，每份分别用50％-80％甲醇溶液溶解成浓度为0.1-1.0g/ml的溶液，分别将溶液加入装有反相硅胶的层析柱，溶液与反相硅胶的质量比为1:5-1:40；并用梯度或等度洗脱方式洗脱，控制流速为每克反相硅胶0.001-0.1ml/min的范围；对层析柱中的洗脱液进行分份收集，每份体积占柱填料体积的0.05:1-0.5:1；根据薄层色谱和高效液相色谱液显示无成分流出后，停止洗脱；根据薄层色谱和高效液相色谱显示，对含有相同皂苷成分的洗脱液进行合并，合并后的洗脱液蒸发至干，得固体物，真空干燥，得sapindosideb、sapindosidec、rarasaponinii、sapinmusaponionk、sapinmusaponionl、rarasaponiniii、rarasaponinvi、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn中一种或多种的皂苷成分单体。
进一步优选的，上述梯度洗脱程序为40％、60％和80％甲醇溶液依次洗脱5-30倍柱体积，等度洗脱方式为40％、50％、60％、70％或80％甲醇洗脱5-50倍柱体积。
进一步优选的，上述反相硅胶为20-100um的反相硅胶。反相硅胶的定义为：正相硅胶(普通硅胶)官能团硅醇基(si-oh)的基础上进行化学反应把oh取代为or(r是碳氢链或称作碳链，ch)的烷基健合硅胶，所述的烷基为丁烷基(c4)、辛烷基(c8)、十八烷基(c18)等。
进一步的，上述步骤7)中色谱分离方式包括：取步骤7)中的四类组分各一份，每份分别用60％-100％甲醇溶液溶解，制成浓度为0.1-0.2g/ml溶液，经制备高效液相色谱仪分离，制备的具体过程和条件为：制备高效液相色谱仪为单泵、二元泵或者四元泵中的一种，其检测器为检测波长为203±2nm的紫外检测器或二极管阵列检测器；色谱柱种类为制备柱和半制备柱，进样体积为0.5ml-5ml，流动相种类为甲醇-水和乙腈-水，比例为40:60-50:50，流速：3-15ml/min，循环1-5次，对流动相进行分份收集，每份收集体积为10-100ml，根据高效液相色谱液显示无成分流出后，停止洗脱；根据高效液相色谱显示，对含有相同皂苷成分的洗脱液进行合并，合并后的洗脱液蒸发至干，得固体物，真空干燥，得sapindosideb、sapindosidec、rarasaponinii、sapinmusaponionk、sapinmusaponionl、rarasaponiniii、rarasaponinvi、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn中一种或多种的皂苷成分单体。
进一步优选的，上述制备柱或半制备柱中所用填料为反相硅胶，填料粒径为3-20um，柱子长度为100-250mm，柱子内径为10-50mm。
进一步的，上述步骤7)中的色谱分离方式为：
a)取b、c、d三种组分各一份，分别按步骤5)处理，得到固体物，对所得固体物进行真空干燥，得rarasaponinii、sapinmusaponionk、sapinmusaponionl、rarasaponiniii、rarasaponinvi、sapinmusaponionm、sapinmusaponionn中一种或多种的皂苷成分单体；
b)取a类组分的皂苷混合物，用50％-80％甲醇溶液溶解成浓度为0.1-1.0g/ml的溶液，将溶液加入装有反相硅胶的层析柱，混合物与反相硅胶的质量比为1:5-1:40；并用梯度或等度洗脱方式洗脱，控制流速为每克反相硅胶0.001-0.1ml/min的范围；分份收集洗脱液，每份体积占柱填料体积的0.05:1-0.5:1；根据薄层色谱和高效液相色谱液显示无成分流出后，停止洗脱；根据薄层色谱和高效液相色谱显示，对含有相同皂苷成分的洗脱液进行合并，合并后的洗脱液蒸发至干，得固体物，真空干燥，得sapindosideb或sapindosidec皂苷单体。
进一步优先的，上述梯度洗脱程序为40％、60％和80％甲醇溶液依次洗脱5-30倍柱体积，等度洗脱方式为40％、50％、60％、70％、或80％甲醇洗脱5-50倍柱体积。
上述本发明的技术方案为无患子皂苷制备提供了一种方法，其可制备出无患子果皮中皂苷九种主要皂苷成分单位质控品，目前尚未有人提出采用前述九种组分中的任意一种或多种作为含无患子皂苷等主要表面活性成分的洗护产品质量控制的质控品，更没有无患子果皮主要皂苷成分单体的制备方法。
进一步的，上述步骤1)中制备无患子皂苷提取液的具体步骤为：将无患子果皮原料粉碎，按料液重量比1:5-1:10加入60％-80％的乙醇溶液，在沸浴下提取2-3次，每次提取30-150min，过滤，合并，回收乙醇，浓缩液加入水至每l中相当于果皮原料2.0-4.0kg，搅匀，得提取液。
进一步的，上述步骤2)的具体操方式为：按提取液与溶剂体积比为1:1-3:1的剂量，将提取液依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取除杂，得萃取液；按萃取液与正丁醇体积比为1:0.4-1:2.5的剂量，将萃取液用正丁醇再萃取2-4次，合并正丁醇萃取液，浓缩至近干的稠膏，稠膏的含水量为15％-20％。
进一步的，上述步骤3)的吸附步骤为：将溶液加入大孔吸附树脂柱，控制流速为每ml大孔树脂0.003-1ml/min的范围，根据薄层色谱和高效液相色谱跟踪富集目标成分，显示皂苷成分流出后，停止添加溶液。
进一步的，上述步骤3)的洗脱步骤为：用ab-8型或d101型大孔吸附树脂柱对溶液进行吸附，大孔树脂和溶液的体积比为1:1.5-1:3，用水洗脱大孔吸附树脂柱至无色，弃去洗脱液，再按洗脱体积与大孔树脂柱填料体积比为1:1-10:1，依次分别以10％、30％、50％、70％、80％、90％的乙醇溶液洗脱，按流份收集50％-80％乙醇洗脱液，根据薄层色谱和高效液相色谱跟踪富集目标成分，显示无成分流出后，停止洗脱。
进一步的，上述步骤5)中制备样品-硅胶混合物的具体方式为：将固体物用氯仿-甲醇溶液溶解或分散，制成浓度为0.1-1.0g/ml溶液或混悬液，分次加至硅胶中吸收，挥干溶剂，重复操作至完全添加，制得样品-硅胶混合物；其中氯仿-甲醇溶液的体积比为1:2-1:5，固体物与硅胶的质量比为0.1:1-0.8:1。
进一步的，上述步骤5)中的层析柱为装有80-300目的正相硅胶的层析柱，其中固体物与层析柱中硅胶的重量比为1:5-1:25，并且层析柱的内径范围为20mm-200mm，装柱后混合物的厚度比与层析柱中的预装硅胶高度比为1:4-1:50。
进一步的，上述步骤5)中洗脱液为体积比为20:1-10:1的氯仿-甲醇溶液；或者为体积比为5:1-1:1的石油醚-丙酮溶液；或者为体积比为5:1-1:2的石油醚-乙酸乙酯溶液；或者为体积比为10:1-1:2的氯仿-丙酮溶液。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供了一种可制备9种无患子三萜类皂苷单体的制备工艺，为无患子果皮、无患子皂苷提取物原料及其衍生品的质量控制提供了可靠质控品。本发明通过使用柱层析正相硅胶、或反相硅胶等设备材料，不论制备技术要求还是成本要求都非常普通。本发明中制备的9种单体皂苷为无患子皂苷中的主要成分，也是其主要表面活性成分，具有很强的代表性，可作为无患子皂苷果皮、无患子皂苷提取物原料以及无患子皂苷为主要表面活性成分的洗护等衍生产品质量控制标准物质。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1
一种无患子三萜类皂苷单体的制备方法，包括以下步骤：
1)将无患子果皮10kg，粉碎成粗粉，置于提取容器中，加入75％的乙醇提取2次，加入乙醇重量分别100kg、80kg，每次加热至沸浴后，保持微沸状态提取120min，过滤，合并，回收乙醇，浓缩液添加水至总量2.5l，搅匀，得提取液。
2)提取液依次用2.5l石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取后，用正丁醇萃取3次，正丁醇用量分别为4l、2.5l、2.5l，合并取正丁醇萃取液。将正丁醇萃取液加入旋转蒸发仪中减压浓缩，控制水浴温度为50-70℃，抽真空压力为-0.07至-0.1bar，转速为100转/min-300转/min，浓缩至近干的稿膏。
3)取稠膏，用水溶解成稠膏浓度为50g/l的溶液。
4)将上述溶液3l加入装有2l大孔树脂的ab-8型大孔吸附树脂柱上(柱直径80mm)，对溶解液进行吸附。具体吸附步骤为：将溶液加入大孔吸附树脂柱，调节阀门使流速为10ml/min，然后用水洗脱大孔吸附树脂柱至无色，弃去此部分洗脱液。再依次分别以7l10％、7l30％、10l50％、10l70％、10l80％、5l90％的乙醇溶液洗脱，按流份接收洗脱液，每个流份200ml，结合薄层色谱法显色(显色条件：喷5％硫酸乙醇溶液110℃烘烤约10min至斑点显色清晰)或高效液相色谱分析(分析条件：二元泵高效液相色谱仪，二极管阵列检测器，检测波长203±2nm，c18分析柱，进样体积5μl，流动相种类含乙腈-水，比例为40:60，流速：1.0ml/min)对每个流份进行跟踪检测，收集50％-80％乙醇洗脱液，再以90％的乙醇溶液洗脱至完全，即薄层色谱或高效液相色谱显示无成分流出。
5)将收集的洗脱液经旋转蒸发至干，得固体物约450g。
6)取固体物300g，加体积比为1:3的氯仿-甲醇溶液1l，制成浓度为300g/l混悬液。取混悬液，分次加入装有400g100-200目硅胶的容器中，每次加入混悬液后拌匀，容器置于水浴锅上加热挥干溶剂，直至混悬液完全添加到硅胶中吸附为止，制成样品-硅胶混合物。
7)将样品-硅胶混合物装入装有5kg100-200目硅胶的层析柱(柱直径100mm)。洗脱液为氯仿-甲醇溶液，体积比为15:1；控制流速为10-20ml/min的范围，每个流分收集体积为200ml，洗脱至完全。停止洗脱，并根据薄层色谱和高效液相色谱显示，对含同一种或者同几种皂苷的流分进行合并，合并后的洗脱液按“2)”所述浓缩方法浓缩，得固体物。
8)对所得固体物进行真空干燥，得sapinmusaponionm皂苷单体和sapinmusaponionn皂苷单体、rarasaponiniii和rarasaponinvi皂苷混合物、rarasaponinii、sapinmusaponionk和sapinmusaponionl皂苷混合物、sapindosideb和sapindosidec皂苷混合物。
9)取rarasaponiniii和rarasaponinvi皂苷混合物20g，加体积比为1:3的氯仿-甲醇溶液100ml溶解，制成浓度为200g/l溶解液。取溶解液，分次加入装有40g100-200目硅胶的容器中，每次加入溶解液后拌匀，容器置于水浴锅上加热挥干溶剂，重复操作至完全添加，制成样品-硅胶混合物。将该样品-硅胶混合物装入装有500g100-200目硅胶的层析柱(柱直径50mm)。洗脱液为氯仿-甲醇溶液，体积比为15:1；洗脱液流速为2ml/min-5ml/min，每个流分收集体积为200ml，洗脱至完全。根据薄层色谱和高效液相色谱显示，对含相同皂苷单体的流份合并，并按步骤2)所述浓缩方法浓缩成固体物，对所得固体物进行真空干燥，得rarasaponiniii皂苷单体和rarasaponinvi皂苷单体。
10)取sapindosideb和sapindosidec皂苷混合物物5g，用60％甲醇20ml溶解，加入装有200g反相硅胶(c-18)的层析柱，用60％甲醇溶液洗脱，洗脱流速为0.2ml/min-2ml/min，分份收集洗脱液，每份体积为20ml，洗脱至完全。根据薄层色谱和高效液相色谱显示，对含相同皂苷单体的流份合并，并按步骤2)所述浓缩方法浓缩成固体物，对所得固体物进行真空干燥，得sapindosideb和sapindosidec皂苷单体。
11)取rarasaponinii、sapinmusaponionk和sapinmusaponionl皂苷混合物20g，用甲醇100ml溶解，经制备色谱分离，制备的具体过程和条件为：二元泵，紫外检测器，检测波长为203nm。色谱柱种类为制备柱品ymc-packods-a(250×20mmi.ds-5μm,12nm)，每次进样量1ml，流动相乙腈-水，比例为40:60-50:50，流速：5-10ml/min，循环次数1-3次，分份收集洗脱液，每份体积为50-100ml，洗脱至完全。根据高效液相色谱显示，对含相同皂苷单体的流份合并，并按步骤2)所述浓缩方法浓缩成固体物，对所得固体物进行真空干燥，得rarasaponinii、sapinmusaponionk和sapinmusaponionl皂苷单体。
12)经质谱和高效液相色谱分析，确定sapindosideb、sapindosidec、rarasaponinii、sapinmusaponionk、sapinmusaponionl、rarasaponiniii、rarasaponinvi、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn皂苷成分单体纯度为98.3％、98.6％、99.3％、98.9％、99.1％、98.7％、97.9％、97.8％、98.6％。
实施例2
一种无患子三萜类皂苷单体的制备方法，包括以下步骤：
步骤1)-8)同实施例1；
9)取sapindosideb和sapindosidec混合物、rarasaponinii、sapinmusaponionk和sapinmusaponionl混合物、rarasaponiniii和rarasaponinvi混合物、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn混合物各5g，分别用60％甲醇20ml溶解，加入装有200g反相硅胶(c-18)的层析柱，用60％甲醇溶液洗脱，洗脱流速为0.2ml/min-2ml/min，分份收集洗脱液，每份体积为20ml，洗脱至完全。根据薄层色谱和高效液相色谱显示(分析条件：二元泵高效液相色谱仪，蒸发光散射检测器，漂移管温度95-115℃，载气流速2.5-3.5ml/min，c18分析柱，进样体积5μl，流动相种类含乙腈-水，比例为40:60，流速：1.0ml/min)，对含相同皂苷单体的流份合并，并按步骤2)所述浓缩方法浓缩成固体物，对所得固体物进行真空干燥,得sapindosideb、sapindosidec、rarasaponinii、sapinmusaponionk、sapinmusaponionl、rarasaponiniii和rarasaponinvi皂苷成分单体。
10)经质谱和高效液相色谱分析，确定sapindosideb、sapindosidec、rarasaponinii、sapinmusaponionk、sapinmusaponionl、rarasaponiniii、rarasaponinvi、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn皂苷成分单体纯度为98.6％、98.2％、98.6％、99.3％、98.7％、98.1％、98.1％、97.8％、98.6％。
实施例3
一种无患子三萜类皂苷单体的制备方法，具体步骤如下：
步骤1)-8)同实施例1；
9)取sapindosideb和sapindosidec混合物、rarasaponinii、sapinmusaponionk和sapinmusaponionl混合物rarasaponiniii和rarasaponinvi混合物、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn混合物各20g，分别用甲醇100ml溶解，经制备色谱分离，制备的具体过程和条件为：二元泵，紫外检测器，检测波长为203nm。色谱柱种类为制备柱品ymc-packods-a(250×20mmi.ds-5μm,12nm)，每次进样量1ml，流动相乙腈-水，比例为40:60-50:50，流速：5-10ml/min，循环次数1-3次，分份收集洗脱液，每份体积为50-100ml，洗脱至完全。根据高效液相色谱显示，对含相同皂苷单体的流份合并，并按步骤2)所述浓缩方法浓缩成固体物，对所得固体物进行真空干燥，得sapindosideb、sapindosidec、rarasaponinii、sapinmusaponionk、sapinmusaponionl、rarasaponiniii和rarasaponinvi皂苷成分单体。
10)经质谱和高效液相色谱分析，确定sapindosideb、sapindosidec、rarasaponinii、sapinmusaponionk、sapinmusaponionl、rarasaponiniii、rarasaponinvi、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn皂苷成分单体纯度为99.2％、98.4％、98.3％、99.4％、98.7％、98.3％、98.7％、97.8％、98.6％。
实施例4
一种无患子三萜类皂苷单体的制备方法，具体步骤如下：
1)将无患子果皮10kg，粉碎成粗粉，置于提取容器中，加入80％的乙醇提取3次，加入乙醇重量分别80kg、60kg、60kg，每次加热至沸浴后，保持微沸状态提取90min，过滤，合并，回收乙醇，浓缩液加入水至总量5l，搅匀，得提取液。
2)提取液依次用3l石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取后，用正丁醇萃取4次，正丁醇用量分别为3l、3l、2l、2l，合并取正丁醇萃取液。将正丁醇萃取液加入旋转蒸发仪中减压浓缩，控制水浴温度为50-70℃，抽真空压力为-0.07至-0.1bar，转速为100转/min-300转/min，浓缩至近干的稿膏。
3)取稠膏，用水溶解成稠膏浓度为50g/l的溶液。
4)将上述溶液12l加入装4lab-8型大孔吸附树脂柱上(柱直径80mm)，对溶解液进行吸附。具体吸附步骤为：将上清液加入大孔吸附树脂柱，调节阀门使流速为12ml/min，然后用水洗脱大孔吸附树脂柱至无色，弃去此部分洗脱液。再依次分别以15l10％、15l30％、20l50％、20l70％、15l80％、10l90％的乙醇溶液洗脱，按流份接收洗脱液，每个流份200ml，结合薄层色谱法显色(显色条件同实施例1)或高效液相色谱分析(分析条件同实施例1)对每个流份进行跟踪检测，收集50％-80％乙醇洗脱液，再以90％的乙醇溶液洗脱至完全，即薄层色谱或高效液相色谱显示无成分流出。
5)将收集的洗脱液经旋转蒸发至干，得固体物约450g。
6)取固体物300g，加体积比为1:5的氯仿-甲醇溶液1l，制成浓度为300g/l混悬液。取混悬液，分次加入装有600g100-200目硅胶的容器中，每次加入混悬液后拌匀，容器置于水浴锅上加热挥干溶剂，直至混悬液完全添加到硅胶中吸附为止，制成样品-硅胶混合物。
7)将样品-硅胶混合物装入装有4kg100-200目硅胶的层析柱(柱直径80mm)。洗脱液为石油醚:乙酸乙酯溶液，体积比为2:1；控制流速为10-20ml/min的范围，每个流分收集体积为300ml，洗脱至完全。停止洗脱，并根据薄层色谱和高效液相色谱显示，对含相同皂苷成分的流分进行合并，合并后的洗脱液步骤2)所述浓缩方法浓缩，得固体物。
8)对所得固体物进行真空干燥，得sapindosideb和sapindosidec混合物、rarasaponinii、sapinmusaponionk和sapinmusaponionl混合物、rarasaponiniii和rarasaponinvi混合物、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn混合物。
9)取rarasaponiniii和rarasaponinvi混合物、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn混合物各20g，分别加体积比为1:5的氯仿-甲醇溶液100ml溶解，制成浓度为200g/l溶解液。取溶解液，分次加入装有30g100-200目硅胶的容器中，每次加入溶解液后拌匀，容器置于水浴锅上加热挥干溶剂，直至溶解液完全添加到硅胶中吸附为止，制成样品-硅胶混合物。将该样品-硅胶混合物装入装有500g100-200目硅胶的层析柱(柱直径50mm)。洗脱液为石油醚:乙酸乙酯溶液，体积比为2:1；洗脱液流速为2ml/min-5ml/min，每个流分收集体积为200ml，洗脱至完全。根据薄层色谱和高效液相色谱显示，对含相同皂苷单体的流份合并，并按步骤2)所述浓缩方法浓缩成固体物，对所得固体物进行真空干燥，得rarasaponiniii、rarasaponinvi、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn皂苷单体。
10)取sapindosideb和sapindosidec混合物5g，用80％甲醇20ml溶解，加入装有200g反相硅胶(c-18)的层析柱，用40％甲醇溶液洗脱，洗脱流速为0.2ml/min-2ml/min，分份收集洗脱液，每份体积为20ml，洗脱至完全。根据薄层色谱和高效液相色谱显示，对含相同皂苷单体的流份合并，并按步骤2)所述浓缩方法浓缩成固体物，对所得固体物进行真空干燥，得sapindosideb、sapindosidec皂苷单体。
11)取rarasaponinii、sapinmusaponionk和sapinmusaponionl混合物20g，用甲醇200ml溶解，经制备色谱分离，制备的具体过程和条件为：二元泵，二极管阵列检测器，检测波长为203nm。色谱柱种类为制备柱品ymc-packods-a(250×20mmi.ds-5μm,12nm)，每次进样量2ml，流动相为甲醇-水，比例为40:60-50:50，流速：5-10ml/min，循环次数1-3次，分份收集洗脱液，每份体积为50-100ml，洗脱至完全。根据高效液相色谱显示，对含相同皂苷单体的流份合并，并按步骤2)所述浓缩方法浓缩成固体物，对所得固体物进行真空干燥，得rarasaponinii、sapinmusaponionk和sapinmusaponionl皂苷单体。
12)经质谱和高效液相色谱分析，确定sapindosideb、sapindosidec、rarasaponinii、sapinmusaponionk、sapinmusaponionl、rarasaponiniii、rarasaponinvi、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn皂苷成分单体纯度为98.6％、99.1％、98.5％、98.9％、99.2％、98.7％、97.6％、98.4％、97.7％。
实施例5
一种无患子三萜类皂苷单体的制备方法，具体步骤如下：
步骤1)-8)同实施例4；
9)取sapindosideb和sapindosidec混合物、rarasaponinii、sapinmusaponionk和sapinmusaponionl混合物、rarasaponiniii和rarasaponinvi混合物、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn混合物各5g，分别用80％甲醇20ml溶解，加入装有200g反相硅胶(c-18)的层析柱，用40％甲醇溶液洗脱，洗脱流速为0.2ml/min-2ml/min，分份收集洗脱液，每份体积为20ml，洗脱至完全。根据薄层色谱和高效液相色谱显示，对含相同皂苷单体的流份合并，并按步骤2)所述方法浓缩成固体物，对所得固体物进行真空干燥，得sapindosideb、sapindosidec、rarasaponinii、sapinmusaponionk、sapinmusaponionl、rarasaponiniii、rarasaponinvi、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn皂苷成分单体。
10)经质谱和高效液相色谱分析，确定sapindosideb、sapindosidec、rarasaponinii、sapinmusaponionk、sapinmusaponionl、rarasaponiniii、rarasaponinvi、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn皂苷成分单体纯度为98.6％、99.1％、98.5％、98.4％、99.2％、99.5％、98.1％、98.6％、99.3％。
实施例6
一种无患子三萜类皂苷单体的制备方法，具体步骤如下：
步骤1)-8)同实施例4；
9)取sapindosideb和sapindosidec混合物、rarasaponinii、sapinmusaponionk和sapinmusaponionl混合物、rarasaponiniii和rarasaponinvi混合物、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn混合物各20g，分别用甲醇100ml溶解，经制备色谱分离，制备的具体过程和条件为：单元泵，紫外检测器，，色谱柱种类为制备柱品ymc-packods-a(250×20mmi.ds-5μm,12nm)，柱温25-40℃，每次进样量2ml，流动相乙腈-水，比例为40:60-50:50，流速：5-10ml/min，循环次数1-3次，分份收集洗脱液，每份体积为50-100ml，洗脱至完全。根据高效液相色谱显示，对含相同皂苷单体的流份合并，并按步骤2)所述浓缩方法浓缩成固体物，对所得固体物进行真空干燥，得sapindosideb、sapindosidec、rarasaponinii、sapinmusaponionk、sapinmusaponionl、rarasaponiniii、rarasaponinvi、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn皂苷成分单体。
10)经质谱和高效液相色谱分析，确定sapindosideb、sapindosidec、rarasaponinii、sapinmusaponionk、sapinmusaponionl、rarasaponiniii、rarasaponinvi、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn皂苷成分单体纯度为98.9％、99.1％、99.3％、99.5％、98.8％、98.7％、99.3％、99.2％、98.7％。
实施例7
一种无患子三萜类皂苷单体的制备方法，具体步骤如下：
1)将无患子果皮10kg，粉碎成粗粉，置于提取容器中，加入60％的乙醇提取3次，加入乙醇重量分别80kg、60kg、60kg，每次加热至沸浴后，保持微沸状态提取90min，过滤，合并，回收乙醇，浓缩液添加水至总量5l，搅匀，得提取液。
2)提取液依次用3l石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取后，用正丁醇萃取4次，正丁醇用量分别为3l、3l、2l、2l，合并取正丁醇萃取液。将正丁醇萃取液加入旋转蒸发仪中减压浓缩，控制水浴温度为50-70℃，抽真空压力为-0.07至-0.1bar，转速为100转/min-300转/min，浓缩至近干的稿膏。
3)取稠膏，用水溶解成稠膏浓度为50g/l的溶液。
4)将上述溶液12l加入装4ld101型大孔吸附树脂柱上(柱直径80mm)，对溶解液进行吸附。具体吸附步骤为：将上清液加入大孔吸附树脂柱，调节阀门使流速为12ml/min，然后用水洗脱大孔吸附树脂柱至无色，弃去此部分洗脱液。再依次分别以12l10％、12l30％、18l50％、18l70％、12l80％、10l90％的乙醇溶液洗脱，按流份接收洗脱液，每个流份200ml，结合薄层色谱法显色(显色条件同实施例1)或高效液相色谱分析(分析条件同实施例1)对每个流份进行跟踪检测，收集50％-80％乙醇洗脱液，再以90％的乙醇溶液洗脱至完全，即薄层色谱或高效液相色谱显示无成分流出。
5)将收集的洗脱液经旋转蒸发至干，得固体物约450g。
6)取固体物300g，加体积比为1:5的氯仿-甲醇溶液2l，制成浓度为150g/l混悬液。取混悬液，分次加入装有600g100-200目硅胶的容器中，每次加入混悬液后拌匀，容器置于水浴锅上加热挥干溶剂，直至硅胶吸附完全为止，制成样品-硅胶混合物。
7)将样品-硅胶混合物装入装有4kg100-200目硅胶的层析柱(柱直径80mm)。洗脱液为氯仿:丙酮溶液，体积比为10:1-1:2，梯度洗脱；控制流速为10-20ml/min的范围，每个流分收集体积为300ml，洗脱至完全。停止洗脱，并根据薄层色谱和高效液相色谱显示，对含相同皂苷的流分进行合并，合并后的洗脱液得步骤2)所述浓缩方法浓缩，得固体物。
8)对所得固体物进行真空干燥，得sapindosideb和sapindosidec混合物、rarasaponinii、sapinmusaponionk和sapinmusaponionl混合物、rarasaponiniii和rarasaponinvi混合物、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn混合物。
9)取rarasaponinii、sapinmusaponionk和sapinmusaponionl混合物、rarasaponiniii和rarasaponinvi混合物、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn混合物各20g，分别加体积比为1:2的氯仿:甲醇溶液100ml溶解，制成浓度为200g/l溶解液。取溶解液，分次加入装有30g100-200目硅胶的容器中，每次加入溶解液后拌匀，容器置于水浴锅上加热挥干溶剂，直至溶解液完全添加到硅胶中吸附为止，制成样品-硅胶混合物。将该样品-硅胶混合物装入装有300g100-200目硅胶的层析柱(柱直径50mm)。洗脱液为氯仿:丙酮溶液，体积比为10:1-1:2，梯度洗脱，洗脱液流速为2ml/min-5ml/min，每个流分收集体积为200ml，洗脱至完全。根据薄层色谱和高效液相色谱显示，对含相同皂苷成分的流份合并，并按步骤2)所述浓缩方法浓缩成固体物，对所得固体物进行真空干燥，得rarasaponinii、sapinmusaponionk、sapinmusaponionl、rarasaponiniii、rarasaponinvi、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn皂苷成分(粗制品)，经质谱和高效液相色谱分析，确此7种皂苷成分纯度为73.9％、85.2％、87.6％、80.4％、76.9％、82.4％、78.7％。
10)取rarasaponinii、sapinmusaponionk、sapinmusaponionl、rarasaponiniii4种皂苷成分(粗制品)各5g，分别加体积比为1:5的氯仿-甲醇溶液20ml溶解，制成溶解液。取溶解液，分次加入装有20g200-300目硅胶的容器中，每次加入溶解液后拌匀，容器置于水浴锅上加热挥干溶剂，直至溶解液完全添加到硅胶中吸附为止，制成样品-硅胶混合物。将该样品-硅胶混合物装入装有300g100-200目硅胶的层析柱(柱直径30mm)。洗脱液为氯仿:甲醇溶液，体积比为20:1-10:1，梯度洗脱，洗脱液流速为2ml/min-5ml/min，每个流分收集体积为100ml，洗脱至完全。根据薄层色谱法显色(显色条件同实施例1)或高效液相色谱分析(分析条件同实施例1)，对含皂苷成分单体的流份合并，并按步骤2)所述浓缩方法浓缩成固体物，对所得固体物进行真空干燥，得rarasaponinii、sapinmusaponionk、sapinmusaponionl、rarasaponiniii皂苷单体。
11)取sapindosideb和sapindosidec混合物5g，用80％甲醇20ml溶解，加入装有200g反相硅胶(c-18)的层析柱，用60％甲醇溶液洗脱，洗脱流速为0.2ml/min-2ml/min，分份收集洗脱液，每份体积为20ml，洗脱至完全。根据薄层色谱和高效液相色谱显示，对含相同皂苷成分单体的流份合并，并按步骤2)所述方法浓缩成固体物，对所得固体物进行真空干燥，得sapindosideb和sapindosidec皂苷单体。
12)取rarasaponinii、sapinmusaponionk和sapinmusaponionl皂苷混合物20g，用甲醇200ml溶解，经制备色谱分离，制备的具体过程和条件为：二元泵，紫外检测器，检测波长为203nm。色谱柱种类为制备柱品ymc-packods-a(250×20mmi.ds-5μm,12nm)，每次进样量2ml，流动相为甲醇-水，比例为40:60-50:50，流速：5-10ml/min，循环次数1-3次，分份收集洗脱液，每份体积为50-100ml，洗脱至完全。根据高效液相色谱显示，对含相同皂苷单体的流份合并，并按步骤2)所述浓缩方法浓缩成固体物，对所得固体物进行真空干燥，得rarasaponinii、sapinmusaponionk和sapinmusaponionl皂苷单体。
13)经质谱和高效液相色谱分析，确定sapindosideb、sapindosidec、rarasaponinii、sapinmusaponionk、sapinmusaponionl、rarasaponiniii、rarasaponinvi、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn皂苷成分单体纯度为98.6％、99.1％、98.5％、98.9％、99.2％、98.7％、97.6％、98.4％、97.7％。
实施例8
一种无患子三萜类皂苷单体的制备方法，具体步骤如下：
步骤1)-8)同实施例7；
9)取sapindosideb和sapindosidec皂苷混合物、rarasaponinii、sapinmusaponionk和sapinmusaponionl皂苷混合物、rarasaponiniii和rarasaponinvi皂苷混合物、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn皂苷混合物各5g，分别用80％甲醇20ml溶解溶解，加入装有200g反相硅胶(c-18)的层析柱，用50％甲醇溶液洗脱，洗脱流速为0.2ml/min-2ml/min，分份收集洗脱液，每份体积为20ml，洗脱至完全。根据薄层色谱和高效液相色谱显示，对含相同皂苷成分单体的流份合并，并按步骤2)所述浓缩方法浓缩成固体物，对所得固体物进行真空干燥，得sapindosideb、sapindosidec、rarasaponinii、sapinmusaponionk、sapinmusaponionl、rarasaponiniii、rarasaponinvi、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn皂苷成分单体。
10)经质谱和高效液相色谱分析，确定sapindosideb、sapindosidec、rarasaponinii、sapinmusaponionk、sapinmusaponionl、rarasaponiniii、rarasaponinvi、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn皂苷成分单体纯度为98.6％、99.1％、99.3％、98.4％、99.2％、99.5％、98.1％、98.6％、99.3％。
实施例9
一种无患子三萜类皂苷单体的制备方法，具体步骤如下：
步骤1)-8)同实施例7；
9)取sapindosideb和sapindosidec皂苷混合物、rarasaponinii、sapinmusaponionk和sapinmusaponionl皂苷混合物、rarasaponiniii和rarasaponinvi皂苷混合物、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn皂苷混合物各20g，分别用甲醇100ml溶解，经制备色谱分离，制备的具体过程和条件为：单元泵，紫外检测器。色谱柱种类为制备柱品ymc-packods-a(250×20mmi.ds-5μm,12nm)，每次进样量2ml，流动相乙腈-水，比例为40:60-50:50，流速：5-10ml/min，循环次数1-3次，分份收集洗脱液，每份体积为50-100ml，洗脱至完全。根据高效液相色谱显示，对含相同皂苷单体的流份合并，并按步骤2)所述浓缩方法浓缩成固体物，对所得固体物进行真空干燥，得sapindosideb、sapindosidec、rarasaponinii、sapinmusaponionk、sapinmusaponionl、rarasaponiniii和rarasaponinvi皂苷成分单体。
10)经质谱和高效液相色谱分析，确定sapindosideb、sapindosidec、rarasaponinii、sapinmusaponionk、sapinmusaponionl、rarasaponiniii、rarasaponinvi、sapinmusaponionm和sapinmusaponionn皂苷成分单体纯度为98.9％、99.3％、98.5％、98.9％、99.2％、98.7％、99.3％、99.2％、98.7％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容范围，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围中，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖与该权利要求范围之中。