一种用于草莓炭疽菌快速检测的LAMP特异引物组、试剂盒及检测方法

本发明涉及一种用于草莓炭疽菌快速检测的lamp特异引物组、试剂盒及检测方法，属于草莓炭疽菌检测技术领域。

背景技术：

草莓是一种重要的经济水果作物，由炭疽菌(colletotrichumspp.)引起的炭疽病自1931年在北美首次报道以来，已成为全球草莓生产的严重威胁。目前，从2012年以来发表的文献中检索到的草莓致病性炭疽菌属共有17种，来自胶孢炭疽菌(colletotrichumgloeosporioide)、尖孢炭疽菌(colletotrichumacutatum)和博宁炭疽菌(colletotrichumboninense)等三个炭疽菌复合种。

炭疽病可危害草莓植株的根颈、叶片、花、果实、匍匐茎等所有组织器官，形成凹陷的坏死病斑，从而引起果实腐烂、植株枯萎。据国内外文献报道，近十年来，炭疽病病害极易在露地育苗中、高温高湿气候条件下爆发，主要危害地上部分草莓组织器官，持续时间长，常常会可造成草莓苗田大面积萎蔫、死苗。在我国因种植草莓经济效益显著，草莓种植面积近年来持续扩大。草莓育苗仍以露地繁苗方式为主，育苗季节适逢高温高湿气候条件，加上草莓栽培土壤连作、设施密闭高温高湿环境等导致草莓炭疽病的发生日益严重，不仅造成草莓大量减产，也影响了草莓果实的风味和品质。由于该病潜伏期长，常常伴随其它病菌复合侵染，症状多样难以防治，给育苗企业和种植户造成巨大损失和危害。因此，建立一种快速、特异、灵敏并且适合在田间现场检测的方法非常必要，将这种检测方法研制成试剂盒进行推广使用更具有很强的实用价值。

炭疽菌的传统鉴定方法主要依据是病原菌的培养特征和微观结构特征。然而，运用传统的分类鉴定方法，培养条件等稳定性差，病原菌分离所需时间长、变异性大，因此仅凭形态学上的特征不足以辨别亲缘关系较近的炭疽菌。

国内外草莓炭疽病现有最主要的诊断方法为分子诊断。主要包括聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,pcr)、反转录-聚合酶链式反应(reversetranscriptionpolymerasechainreaction,rt-pcr)、实时荧光定量rt-pcr(real-timefluorescencequantitativert-pcr,rq-rt-pcr)、环介导等温扩增(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)技术、重组酶聚合酶扩增(recombinasepolymeraseamplification，rpa)、基因测序技术等。以上检测方法多具有耗时费力、设备要求特殊、成本高等局限性。其中lamp是2000年开发的一种核酸恒温扩增方法，具有简单、快速、特异性强、设备要求简单的特点。

但是，目前对于草莓炭疽菌的检测，并没有上述相关技术有效的应用。

技术实现要素：

发明目的：针对上述技术问题，本发明目的在于提供一种用于草莓炭疽菌快速检测的lamp特异引物组、试剂盒及检测方法。通过lamp反应后产物颜色发生变化来判断被测样品是否含有草莓炭疽菌，显色为蓝色判断为阳性，紫色则判断为阴性。用肉眼实现检测结果的可视化，适合于草莓炭疽菌的田间现场快速检测需要，是一种快速、精准、灵敏的新方法。

技术方案：一种用于草莓炭疽菌快速检测的lamp特异引物组，包括以下所示引物：

引物f3：5’-ctcgtcgayttggagcccg-3’(seqidno:1)；

引物b3：5’-taccrgcaccggtaccacc-3’(seqidno:2)；

引物fip：5’-ttggcccagttgttgccggctaccatggacgccgtccgt-3’(seqidno:3)；

引物bip：5’-agctcgtygaycaggttctcgatgttggaarccctggaggcagt-3’(seqidno:4)；

引物lf：5’-agacgaagttgtcggggcg-3’(seqidno:5)；

引物lb：5’-gcgaggcygagggmtgcg-3’(seqidno:6)；

其中，y＝c/t；r＝a/g；m＝a/c。

一种用于检测草莓炭疽菌的lamp检测试剂盒，包括所述的lamp特异引物组。

优选，所述lamp检测试剂盒包含lamp反应体系，该lamp反应体系包括：mgso4、dntp、buffer、所述的lamp特异引物组、甜菜碱、dna模板、bst酶、羟基萘酚蓝。

进一步优选，所述lamp反应体系中各成分的用量，以25μllamp反应体系计，包括：mgso4：2-8mm，dntp：0.5-1mm，1×buffer，引物fip：1-2μm，引物bip：1-2μm，引物f3：0.1-0.3μm，引物b3：0.1-0.3μm，引物lf：1-2μm，引物lb：1-2μm，甜菜碱：0.5-1m，bst酶：6-10u，羟基萘酚蓝：0.15-0.2mm，dna模板：10-20ng。

最优选的，所述25μllamp反应体系中各成分的用量为：mgso4：6mmol，dntp：1.0mm，1×buffer，fip：1.6μm，bip：1.6μm，f3：0.2μm，b3：0.2μm，引物lf：1.6μm，引物lb：1.6μm，甜菜碱：0.8m，bst酶：8u，羟基萘酚蓝：0.16mm，dna模板：20ng。

优选，所述lamp检测试剂盒还包括：阳性对照和无模板对照。进一步优选的，所述阳性对照为含c.fructicolatub2基因片段的质粒。

所述的lamp特异引物组、所述的lamp检测试剂盒在检测草莓炭疽菌中的应用。

一种快速检测草莓炭疽菌的方法，包括以下步骤：

(1)提取待检测样品dna；

(2)以步骤(1)提取的dna为模板，利用权利要求1所述的lamp特异引物组进行lamp反应；

(3)lamp反应结束后，根据产物颜色的变化来判定结果，显色为蓝色判断为阳性，即含有草莓炭疽菌；显色为紫色判断为阴性，即不含草莓炭疽菌。

优选，步骤(2)中所述lamp反应的反应体系，包括：mgso4、dntp、buffer、权利要求1所述的lamp特异引物组、甜菜碱、dna模板、bst酶、羟基萘酚蓝。

进一步优选，所述lamp反应体系包含如下成分，按总体积25μl配制：mgso4：2-8mm，dntp：0.5-1mm，10×buffer，引物fip：1-2μm，引物bip：1-2μm，引物f3：0.1-0.3μm，引物b3：0.1-0.3μm，引物lf：1-2μm，引物lb：1-2μm，甜菜碱：0.5-1m，bst酶：6-10u，羟基萘酚蓝：0.15-0.2mm，dna模板：10-20ng；最优选的，所述25μllamp反应体系中各成分的用量为：mgso4：6mmol，dntp：1.0mm，1×buffer，fip：1.6μm，bip：1.6μm，f3：0.2μm，b3：0.2μm，引物lf：1.6μm，引物lb：1.6μm，甜菜碱：0.8m，bst酶：8u，羟基萘酚蓝：0.16mm，dna模板：20ng。

步骤(2)中所述lamp反应的条件为60℃-65℃恒温30-60min，优选65℃恒温30min。

本发明利用lamp技术建立针对草莓炭疽菌的检测方法，该方法具有多引物同时扩增，并在两端形成了带有引物功能的环状结构，这种多引物结合和可自产生引物的原理使其具有灵敏度高、特异性强等特点，由于lamp反应操作步骤简单及反应产物中包含大量核酸和焦磷酸镁的沉淀，羟基萘酚蓝显色后可以用肉眼观察判定反应结果，适用于各种实验条件下检测工作中使用。

本发明根据lamp的工作原理，以草莓炭疽菌的tub2基因为目标基因，在优化相关反应条件的基础上，建立了适用于田间应用的用于检测草莓炭疽病的lamp方法，并将该方法研制成诊断试剂盒进行推广应用，为草莓炭疽病的早期发现和及时防控提供必要的技术支撑。

有益效果：相对于现有技术，本发明具有以下优势：

1)本发明根据草莓炭疽菌的tub2基因序列，设计合成6个引物，通过对lamp条件的优化，以及敏感性、特异性试验，建立草莓炭疽菌的lamp检测方法，通过向lamp反应产物中加入羟基萘酚蓝后的颜色变化来判断被测样品是否含有草莓炭疽菌，为草莓炭疽菌的现场快速诊断提供了一种简便快速的方法，该方法具有反应条件简单、结果读判方便、敏感性高、特异性强、快速等优点。

2)本发明的优势还在于已经将这种lamp检测方法研制成试剂盒，并进行推广应用。该试剂盒特异性强，灵敏度高，检测限为10²拷贝。

3)本发明所提供的草莓炭疽菌的lamp快速检测试剂盒，操作简单，且直接通过产物颜色变化进行判定，实现了可视化，使反应结果易判定，非常易于田间推广。。

附图说明

图1为genbank中的草莓炭疽菌的tub2基因序列。

图2为本发明实施例2的lamp检测的可视化结果。

图3为本发明实施例4灵敏度试验的可视化结果。

图4为本发明实施例5特异性试验的可视化结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂。

实施例1检测草莓炭疽菌的lamp引物组设计

根据比对genbank中的草莓炭疽菌的tub2基因序列(如图1所示)，针对靶基因的八个不同的区域，基于靶基因3’端的f3c、lf、f2c和flc区以及5’端的bl、lb、b2和b3区共8个不同的位点设计6种引物，具体序列如表1所示。

其中，y＝c/t；r＝a/g；m＝a/c

表1引物序列信息

实施例2草莓炭疽菌的lamp检测方法的建立和验证

包括如下步骤：

1)炭疽菌dna的提取和tub2基因片段克隆

参照quick-dnatmfungal/bacterialminiprepkit(zymoresearch,usa,cat.no.d6005)试剂盒说明书，对分离自上海市青浦区草莓样品的果生刺盘孢菌(c.fructicola)进行dna提取，将提取的dna用作模板，以f3/b3引物组进行常规pcr，得到的产物克隆到pclone007质粒，稀释为10ng/μl作为阳性对照。

2)lamp反应体系的建立

最终优化的反应体系如下：

lamp反应体系(25μl)的配置为：ddh2o5μl，浓度100mmol/l的mgso41μl，浓度10mmol/l的dntp2.5μl，10×buffer2.5μl，浓度40μmol/l的fip1μl，浓度40μmol/l的bip1μl，浓度10μmol/l的引物lf0.5μl，浓度10μmol/l的引物b30.5μl，40μmol/l的lf1μl，浓度40μmol/l的lb1μl、浓度5mol/l甜菜碱4μl，步骤1)提取的dna模板2μl，8u/μl的bst酶1μl、浓度2mmol/l的羟基萘酚蓝2μl。

反应程序：65℃30min。

以阳性对照模板(步骤1中所述的提取c.fructicoladna，扩增f3/b3区域克隆进pclone007-tub2,即阳性质粒)、无模板对照分别进行lamp反应。反应结束后观察颜色变化，显色结果如图2所示。图2中显示：阳性质粒的反应产物颜色变为蓝色，无模板对照(图2中阴性对照组)的反应产物不发生颜色变化，为紫色。由此可见，本发明的lamp反应结果易判定，易于田间推广。

实施例3草莓炭疽菌lamp检测试剂盒的组装

根据以上lamp反应体系组装检测试剂盒，以方便使用。

1)试剂盒的包装规格为200次/盒，试剂盒组成如表2所示：

表2反应体系

2)试剂盒运输及保存方法

低温运输，短期使用放至4℃避光保存，长期保存请置于-20℃或-80℃冰箱避光保存。

实施例4草莓炭疽菌lamp检测试剂盒的使用

1)样品dna的提取

参照t5directpcrkit(plant)(catno.tse011,tsingkebiologicaltechnology,beijing,china)试剂盒说明书，提取待测草莓样品dna作为模板。

2)反应液的配制

取表1中各成分进行配制，具体取ddh2o5μl，预混合液10μl，引物fip1μl，引物bip1μl，引物f30.5μl，引物b30.5μl，引物lf1μl，引物lb1μl，bst酶1μl，模板2μl，羟基萘酚蓝2μl加入反应小管中，混合均匀。

3)反应的进行

lamp反应程序为：65℃恒温30min；

4)结果判定

lamp反应结束后，观察颜色变化：显色为蓝色的样品为阳性，含有草莓炭疽病；显色为紫色的样品为阴性，不含草莓炭疽病。

实施例5草莓炭疽病lamp检测试剂盒的灵敏度试验

首先将实施例2步骤1)中所得c.fructicoladna测其浓度，从浓度10ng/μl开始，做一个十倍的梯度稀释到1fg/μl，-20℃保存备用。

将提取到的c.fructicoladna制备9个样品：1：c.fructicoladna10⁵拷贝2：c.fructicoladna10⁴拷贝，3：c.fructicoladna10³拷贝，4：c.fructicoladna10²拷贝，5：c.fructicoladna10¹拷贝，6：c.fructicoladna10⁰拷贝，7：c.fructicoladna10^-1拷贝，8：c.fructicoladna10^-2拷贝，9：无模板对照。使用实施例3组装的检测试剂盒并参照实施例4的使用方法对上述9个样品进行lamp检测试验，具体结果参见图3。

由图3可知，样品1-4均为蓝色，样品5-9均为紫色，最低可检出dna浓度为c.fructicoladna10²拷贝。

以上证明本发明所提供c.fructicoladna的lamp检测方法和试剂盒针对草莓炭疽菌模板的扩增具有很高的效率，即建立的草莓炭疽菌的lamp检测下限为10pg/μl，符合日常检测要求。

实施例6草莓炭疽病lamp检测试剂盒的特异性试验

特异性实验测试模板分别为：1：隐秘刺盘孢菌(c.aenigma)，2：果生刺盘孢菌(c.fructicola)，3：睡莲炭疽菌(c.nymphaeae)，4：暹罗刺盘孢菌(c.siamense)，5：胶孢刺盘孢菌(c.gloeosporioide)，6：c.murrayae，7：灰葡萄孢菌(botrytiscinerea)，8：假毛丛赤壳菌(nectriapseudotrichia)，9：拟盘多毛孢菌(pestalotiopsisclavispora)，10：尖孢镰刀菌(fusariumoxysporum)，11：白粉菌(podosphaeraaphanis)，12：草莓(fragaria×ananassa)，13：无模板对照。

用本发明的草莓炭疽病lamp检测试剂盒对供试的特异性实验测试12种样品dna进行lamp检测，具体结果参见图4。

由图4可知，本发明提供的草莓炭疽菌引物组(fip、bip、f3、b3、lf和lb)在非草莓炭疽菌样品(样品7-12)中颜色反应均为紫色，而在所有供试草莓炭疽菌样品(样品1-6)中颜色反应均为蓝色，说明本发明设计的草莓炭疽菌引物组特异于草莓炭疽菌样品检测，本发明提供的lamp检测方法和试剂盒对草莓炭疽菌具有良好的特异性。

实施例7草莓炭疽菌lamp检测试剂盒的田间应用试验

使用本发明提供的lamp检测试剂盒检测68个田间草莓样品是否感染炭疽病。结果检出其中有18个田间样品感染炭疽病，炭疽病感染率26.5％。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>上海市农业科学院

<120>一种用于草莓炭疽菌快速检测的lamp特异引物组、试剂盒及检测方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(引物f3artificialsequence)

<400>1

ctcgtcgayttggagcccg19

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(引物b3artificialsequence)

<400>2

taccrgcaccggtaccacc19

<210>3

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(引物fipartificialsequence)

<400>3

ttggcccagttgttgccggctaccatggacgccgtccgt39

<210>4

<211>44

<212>dna

<213>人工序列(引物bipartificialsequence)

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agctcgtygaycaggttctcgatgttggaarccctggaggcagt44

<210>5

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(引物lfartificialsequence)

<400>5

agacgaagttgtcggggcg19

<210>6

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(引物lbartificialsequence)

<400>6

gcgaggcygagggmtgcg18