专利名称:在小麦根中特异表达的肉桂酰辅酶a还原酶、编码该酶的基因和含有该基因的表达载体的制作方法
发明领域本发明涉及在小麦根中特异表达的肉桂酰辅酶A还原酶，编码该酶的基因和含有该基因的表达载体。
发明背景在包括蕨类、裸子植物和被子植物在内的维管植物中，木质素的出现对于植物向陆生进化具有重要作用，它使植物能够适应较干燥的外界环境，并向更大的空间发展，从而形成了更为多样化的植物类群(Facchini，P.J，1999，Trends in Plant Sci，4382-384)。木质素的合成对于植物的生长发育也具有重要作用。木质素主要沉积在植物的导管、射线、厚壁细胞等的细胞壁上，能够增加细胞壁的机械强度，降低其通透性，因此，木质素的合成增强了植物的机械支持作用。在植物受伤和受到病虫害侵袭时，植物细胞能够迅速木质化以有效地保护其内部组织免受进一步的危害，因此增强了植物对于外界机械损伤和病虫害侵袭的抵抗力(Whetten，R.W.等，1998，Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol，49585-609)。
木质素属高分子有机酚类化合物，在地球上所有高分子有机化合物中，其含量居纤维素之后，居第二位。在植物体中通常占干重的10-20％，在树木中甚至可达30％。木质素合成是以苯丙氨酸为前体，经过一系列酶促反应，形成几种简单酚类的醇衍生物，被称为木质素单体(monolignol)，再由这些木质素单体聚合形成高分子木质素。构成木质素的单体主要有三类，即香豆醇(p-coumaryl alcohol)、松柏醇(coniferylalcohol)和丁香醇(sinapyl alcohol)。这三类化合物在结构上的区别是甲氧基的数量。
不同种类的植物其木质素在组成上有明显的区别。裸子植物的木质素主要由松柏醇组成，双子叶植物的木质素由松柏醇和丁香醇组成，而单子叶植物的木质素则包括香豆醇、松柏醇和丁香醇等三种单体。此外，植物在不同的发育时期、不同的环境条件以及不同的部位，其木质素的组成也有明显的差异。
木质素的生物合成反应涉及如下几个基本过程(1)苯丙氨酸经过氨解作用形成肉桂酸(苯丙稀酸，cinnamic acid)，(2)羟基化和转甲基，在苯环的不同部位形成羟基和甲氧基，(3)已酰化，即在羧基侧链已酰化，(4)还原反应，使羧基侧链经过醛基最后形成醇(Baucher，M.B.等，1998，Crit.Rev.Plant Sci.，17125-197)。
肉桂酰辅酶A还原酶(cinnamoyl CoA reductuase，EC1.2.1.44，CCR)是催化木质素合成中的第一步还原反应，负责催化肉桂酰辅酶A到肉桂醛的转化。它决定植物体的苯丙氨酸类代谢物是否进入木质素合成途径，是木质素合成反应中具有控制作用的关键酶。
从20世纪70年代起，就有研究人员开展对肉桂酰辅酶A还原酶的分离和纯化工作，先后从大豆的悬浮培养细胞(Wegenmayer，H等，1976，Eur.J Biochem，65529-536.)、云衫(Luderitz，T等，1981，Eur.J.Biochem，119115-124)和杨树(Sarni，F等，1984，Eur.J.Biochem，139259-265)中得到了部分纯化的酶蛋白。但由于这些蛋白质并未被完全纯化，因此人们对其生化特点和生物学性质尚缺乏深入的研究。1994年，法国科学家从桉树中获得比较纯的肉桂酰辅酶A还原酶，并证明它属于NADP类氧化还原酶(Goffner，D等，1994，Plant Physiol，106625-687)。
在此基础上，法国科学家于1997年首先从桉树中克隆了肉桂酰辅酶A还原酶基因，序列分析表明此基因所编码的酶与负责花色素合成的二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol-4-reducase)具有较高同源性，同时与哺乳动物中的3-羟基类固醇脱氢酶(3-hydroxysteroid dehydrogenase)和细菌中的UDP-半乳糖异构酶(UDP-galactose-4-epimerase)具有同源性，表明此类酶是生物进化过程中比较古老的一类酶。在桉树基因组中，CCR属于单拷贝基因，基因的表达主要在根、茎等组织正在形成的木质部，表明此基因与植物木质素的合成和组织的木质化密切相关(Lacombe，E等，1997，Plant J，11429-441)。其后，从玉米中分离的CCR基因也证明，在单子叶植物中，CCR基因的表达与茎杆组织中木质素的合成和木质化关系密切(Pichon，M等，1998，Plant Mol Biol，38671-676)。
人们利用模式植物烟草进行了转基因实验。结果表明，如果通过反义抑制使转基因烟草中肉桂酰辅酶A还原酶的活性降低到正常植物的50％以下，则转基因烟草中的木质素含量降低40％以上，木质素组成也发生明显的变化，其中，丁香醇含量增加，烟草茎的生长受到严重影响，转基因烟草的株高仅为正常植物的三分之二，并且茎中导管出现坍塌的迹象(Piquemal，J.等，1998，Plant J.，1371-83)。这从反面证明CCR作为木质素合成的关键酶基因，在控制植物茎的生长发育过程中具有重要作用，因而可在植物基因工程技术领域：
中具有广泛的应用潜力。
法国科学家已从桉树(Eucalyptus gunnii)、杨树(Populus trichocara)、烟草(Nicotiana tabacum)、玉米(Zea mays)、羊茅草(Festuca arundinacea)和苜蓿(Medicago sativa)中分离出CCR基因，并申请了发明专利(WO9527790)。对小麦(Triticum aestivum)CCR基因的分离和鉴定工作，本发明人已经申请了一个与小麦茎发育相关的肉桂酰辅酶A还原酶基因(公开号为CNl376787A)，在根中特异表达的肉桂酰辅酶A还原酶基因，目前尚未有报道。
无论在中国还是在世界范围内，小麦都是最重要的农作物之一。在生产实践中，由于病虫害侵袭，以及环境逆境如干旱所造成的损失十分巨大。利用小麦肉桂酰辅酶A还原酶基因，通过基因工程手段，调节基因的表达活性，则可能获得高产抗逆境和抗病虫害的小麦新品系。
发明内容
本发明通过提供在小麦中特异表达的肉桂酰辅酶A还原酶基因和由其编码的蛋白质，达到控制小麦根中的木质素合成、并进一步控制小麦根生长与发育，增强小麦抗病虫害和抵御外界逆境如干旱的目的。本发明的另一个目的是提供可将上述基因翻译成活性蛋白质的表达质粒。
本发明的一个目的是提供一种在小麦根中特异表达的肉桂酰辅酶A还原酶。
本发明的另一个目的是提供一种编码小麦肉桂酰辅酶A还原酶的基因。
本发明的再一个目的是提供一种含有本发明的基因的表达载体。
本发明提供了一种编码肉桂酰辅酶A还原酶的DNA序列，它选自下组(1)编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的DNA序列；(2)与(1)的序列在严谨条件下能够杂交，并能够编码具有活性的肉桂酰辅酶A的DNA序列。
所述的严谨杂交条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS)中，65℃预杂交30min；弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7％SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65℃杂交12hr；弃杂交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5％SDS)，65℃洗膜2次，每次30min；加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1％SDS)，65℃洗膜30min。
本发明的DNA序列可以具有SEQ ID NO1所示的序列。此序列为编码小麦肉桂酰辅酶A还原酶基因(CCR)的全长cDNA，命名为Ta-CCR2。该序列共由1489个碱基组成，其中，5’端未翻译区包括157个碱基，3’端未翻译区包括258个碱基(其中包括18个碱基组成的PolyA)，编码区由1074个碱基(从158位到1231位)组成，其中A占20.76％(223个)，C占32.50％(349个)，G占32.03％(344个)，T占14.71％(158个)，A+T占35.47％(381个)，C+G占64.53％(693个)。在国际基因序列数据库(GenBank/EMBL/DDBJ)中的基因同源性分析表明，Ta-CCR2基因是小麦中未曾报道的新基因，它与从桉树(Eucalyptus gunnii)、杨树(Populus trichocara)、烟草(Nicotiana tabacum)、玉米(Zea mays)、羊茅草(Festuca arundinacea)和苜蓿(Medicago sativa)中分离出的肉桂酰辅酶A还原酶基因具有同源性。与本发明人申请的与小麦茎发育相关的肉桂酰辅酶A还原酶基因(公开号为CN1376787A)同源性仅为60％。
本发明还提供了一种由上述的DNA序列编码的氨基酸序列。这种氨基酸序列最好具有SEQ ID NO2所示的序列。该蛋白质序列包括357个氨基酸，如SEQ ID NO2所示。在该蛋白质序列中，疏水氨基酸占124个，亲水氨基酸占80个，碱性氨基酸占41个，酸性氨基酸占43个，该蛋白质的分子量为39.5KD，等电点为6.8。该蛋白质是国际上未曾报道的新蛋白质。
本发明还提供了一种含有上述的DNA序列的表达载体。这种表达载体最好是一种植物表达载体。它可以是含有上述的DNA序列的表达载体pET-28a。这种表达载体的构建过程如下在Ta-CCR2基因编码区两侧合成引物，并分别引入BamHI及XhoI酶切位点，其引物序列分别为5’-引物5’-CGGGATCCATGCCAATCGAGGCGGCAGAC-3’3’-引物5’-CCGCTCGAGTTAATTACGTAGCAACTGGG-3’。
经过PCR扩增出Ta-CCR2基因的全长编码区，以BamHI与XhoI双酶切下，连接到表达载体pET-28a的相应酶切位点上(见
图1)，通过酶切和序列分析证明此表达载体的完整性和正确性。将表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS菌株，经过IPTG诱导后，将大肠杆菌蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳分析，证明Ta-CCR2基因已在大肠杆菌中翻译出正确的蛋白质。将上述大肠杆菌菌株经过37℃培养和IPTG诱导后，进行菌体裂解，分离菌体蛋白质，并对该蛋白质进行肉桂酰辅酶A还原酶活性分析，所用底物为阿魏酸辅酶A(feruloyl CoA)，得到其酶活性为162.0nmol/sec/mg，证明此蛋白质具有肉桂酰辅酶A还原酶的催化活性。
分别从小麦的根、茎、叶组织中提取总RNA，经过电泳后用毛细管法转移到尼龙膜上，与小麦CCR基因探针杂交，放射自显影检测杂交结果，以rRNA探针为对照使杂交信号标准化。以此方法检测Ta-CCR2基因在小麦不同部位的表达。得到的结果表明该基因主要在小麦根的营养生长组织中表达。
本发明提供了在小麦根中特异表达的肉桂酰辅酶A还原酶基因和与其相关的蛋白质产物。应用该基因，可开发出转基因植物，以控制根中的木质素合成，从而改变根的抗病虫性和抵御外界不良环境的能力。例如，正如本发明的一个优选实施例所表明的那样，利用转基因获得小麦新品系，增加小麦的抗病和抵御外界不良环境的能力；当然，也可通过有性杂交方法将此基因转移到现有的小麦生产品种中。
附图简要说明图1表示Ta-CCR2基因表达质粒。
图2Ta-CCR2基因在小麦不同组织中的表达实施例实施例一、小麦肉桂酰辅酶A还原酶基因探针的分离及序列分析将小麦种植于温室中，正常浇水和施肥，至生长到2-3个节间，采集根、茎、叶组织，用TRI试剂(Molecular Research Center，Inc，Cincinnati，USA)提取总RNA，用PolyAT tractmRNA Isolation试剂盒(Promega公司，Madison，USA)分离Poly(A)+RNA，用紫外分光光度计分析RNA的含量和纯度。
反转录合成cDNA第一条链的条件为Poly(A)+RNA 1ug，5μmol/L引物5’-GACTCGAGTCGACATCGA(T)17-3’，0.5mmol/L dNTP，50单位RNasin，65℃保温10分钟，在冰上冷却后，加入200U SuperScriptTMIIRNase H-Reverse Transcriptase(Gibco)，42℃保温1小时，加EDTA至终浓度10mM，并于95℃保温10分钟，在冰上冷却。
第一轮PCR的引物为D25’-GACTCGAGTCGACATCG-3’；D35’-GArAArGGnTAyACnGT-3’，条件为3μL cDNA反应液，1μmol/L引物，0.4mmol/L dNTP，2.5U Taq DNA聚合酶(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)，于95℃变性5分钟，50℃复性2分钟，72℃延伸40分钟，然后进行40个循环(95℃1分钟，55℃1分钟，72℃3分钟)，最后72℃延伸10分钟。
第二轮PCR引物为D45’-AAGAAyTGGTAyTGyTAyGG-3，D55’-AGrTGnCCyTTyTCyTGnAG-3’，条件为使用1μL第一轮PCR反应液，于95℃变性5分钟，其它反应同第一轮。PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，采用GlassMAXDNA Isolation试剂盒(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)。纯化后连接在pGEM-T Easy载体上(Promega公司，Madison，USA)。连接条件为16℃12小时。转化受体菌为E.coliDH5α，感受态细胞的制备采用CaCl2处理方法(Sambrook，J.等(eds)，Molecular cloningA laboratory manual，2nded.，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)。将连接产物加入到感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激90秒，加入LB液体培养基，37℃保温45分钟，涂布在含氨苄青霉素(100ug/ml)和X-Gal(20ug/ml)的LB平板上，37℃培养过夜。白色克隆接种于LB液体培养基上(含氨苄青霉素100ug/ml)，37℃培养过夜，提取质粒，进行酶切分析后，以ABI 377 DNA序列分析仪进行序列分析，确定小麦的CCR探针。
序列分析的结果表明，所分离的探针具有498个核苷酸，与桉树(Eucalyptus gunnii)、杨树(Populus trichocara)、烟草(Nicotiana tabacum)、玉米(Zea mays)、羊茅草(Festuca arundinacea)和苜蓿(Medicago sativa)中分离出的肉桂酰辅酶A还原酶基因具有同源性。并且，其编码的蛋白质具有肉桂酰辅酶A还原的催化活性中心NWYCY。
实施例二、小麦肉桂酰辅酶A还原酶基因的筛选和序列分析以小麦茎Poly(A)+RNA为模板，以ZAP载体(Stratagene公司，LaJolla，CA，USA)合成cDNA，经过体外包装，构建成小麦茎的cDNA文库。取50ng探针DNA，加50uCi32P-dCTP进行标记，37℃保温1小时，加EDTA至终浓度10mM终止反应。探针通过Sephadex G-50柱后，于100℃煮沸10分钟，立即在冰上冷却，进行杂交。
取50000pfu铺平板，并将其转移到硝酸纤维素膜上，于0.5M NaOH加1.5M NaCl变性2分钟，1.5M NaCl加0.5M Tris-HCl(pH8.0)复性5分钟，0.2M Tris-HCl(pH7.5)加2×SSC漂洗30秒，将膜夹在两层Whatman滤纸中，80℃真空烘烤2小时，之后加入杂交液(6×SSC，5×Denhardt，0.5％ SDS，100μg/mL鱼精DNA，50％甲酰胺)，42℃保温2小时，加入标记的探针，42℃杂交过夜，经过6×SSC加0.1％SDS室温下洗两次，每次30分钟，再用0.1×SSC加0.1％SDS于65℃洗两次，每次20分钟，之后于-80℃下放射自显影，确定阳性克隆后，将噬菌斑取下，于SM溶液中4℃提取过夜，再按同样的程序进行两轮筛选。
对于获得的阳性噬菌斑，按Stratagene公司提供的方法将其转化为质粒DNA，经过酶切分析后，采用ABI 377 DNA序列分析仪进行序列分析。
测得的DNA序列如SEQ ID NO 1所示，将其命名为Ta-CCR2。它是小麦肉桂酰辅酶A还原酶基因，是迄今尚未报道的新基因。
实施例三、小麦肉桂酰辅酶A还原酶基因编码蛋白质的翻译人工合成一对引物5’-引物5’-CGGGATCCATGCCAATCGAGGCGGCAGAC-3’3’-引物5’-CCGCTCGAGTTAATTACGTAGCAACTGGG-3’在引物两端分别引入BamHI及XhoI酶切位点，以Ta-CCR2基因为模板，进行PCR扩增，扩增条件10ng DNA，1μmol/L引物，0.4mmol/L dNTP，2.5U Taq DNA聚合酶(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)。于95℃变性5分钟，然后进行30个循环(95℃1分钟，55℃1分钟，72℃1.5分钟)，最后72℃延伸10分钟。
PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳，采用GlassMAXDNA Isolation试剂盒(Gibco公司，Grand Island，NY，USA)纯化，用BamHI及XhoI双酶切后，连接在载体pET-28a(Novagen Company，USA；Cat No.69872-3)上，转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS感受态细胞，转化细胞冰浴30分钟后，42℃热激50秒，加入LB液体培养基，37℃保温45分钟，涂布在含卡那霉素(50ug/ml)的LB平板上。将抗性菌落于LB液体培养基(含卡那霉素50ug/ml)中37℃震荡培养过夜，再进行1/100稀释后，37℃震荡培养2小时，加入IPTG至终浓度1mM，继续培养3小时，12000g离心10分钟，收集菌体，菌体加入100ul裂解液(50mM Tris-HCl pH6.8，100mM二硫苏糖醇，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)，100℃煮沸5分钟，菌体蛋白按常规方法进行SDS-PAGE电泳(凝胶浓度12％)，结果显示在细菌中有肉桂酰辅酶A还原酶蛋白质的表达，其结构如SEQ IDNO 2所示。
实施例四、肉桂酰辅酶A还原酶活性的测定将IPTG诱导后的大肠杆菌50ml于4000g离心10分钟，加入4ml菌体裂解液(20mMTris-HCl pH7.5，1mM PMSF，2mM二硫苏糖醇，100ug/ml溶菌酶)，30℃保温15分钟，用超声波处理20次，4000g离心10分钟，取上清液进行酶活测定。酶活测定反应液包括100mM磷酸钠缓冲液(pH6.25)，0.1mM NADPH，70uM阿魏酸辅酶A，50ul蛋白溶液，总体积500ul，在30℃下测定A366的降低来计算肉桂酰辅酶A还原酶的活性。蛋白质含量按Bio-Rad公司的方法(Bradford，M.M，1976，Anal.Biochem.，72248-254)测定。
结果显示，以阿魏酸辅酶A(feruloyl CoA)为底物，其酶活性为162.0nmol/sec/mg，表明Ta-CCR2基因所编码的蛋白质具有催化合成肉桂醛的功能，因而能够控制小麦中的木质素合成。
实施例五、小麦组织中Ta-CCR2基因表达产物的检测采用Northern blot杂交检测小麦不同组织中的Ta-CCR2基因的表达产物，从不同小麦组织中分离的总RNA样品，按常规方法在1.4％琼脂糖/甲醛变性凝胶电泳上分离，以20×SSC按毛细管法转移到尼龙膜上(转移时间12小时)，尼龙膜夹在两层Whatman滤纸中，80℃真空烘烤2小时，将膜放在杂交瓶中，之后加入杂交液(6×SSC，5×Denhardt，0.5％SDS，100μg/mL鱼精DNA，50％甲酰胺)10ml，42℃预杂交2小时，加入标记的肉桂酰辅酶A还原酶基因探针，42℃杂交过夜，经过6×SSC加0.1％SDS室温下洗两次，每次30分钟，再用0.1×SSC加0.1％SDS于65℃洗两次，每次10分钟，于-80℃下放射自显影一周。显影后的膜加入0.1×SSC加0.1％SDS于95℃洗两次，每次15分钟，之后加入含有18S rRNA探针的杂交液，42℃杂交过夜。将膜取出，按相同的程序洗膜，于-80℃下放射自显影1小时。
杂交结果如图2所示。对杂交的信号经过Phosphor Image扫描，并与rRNA信号标准化，得到小麦不同组织中Ta-CCR2相对表达量，如表1所示
表1.小麦不同组织中Ta-CCR2基因的表达量(以茎为100)
结果表明，小麦肉桂酰辅酶A还原酶基因Ta-CCR2主要在根的营养生长组织中表达。在茎中有少量表达，在叶中几乎没有表达。
由结果可以看出，Ta-CCR2主要与小麦根的发育和木质化有关。由于根的木质化程度与小麦的抗病虫害和抵御不良环境如干旱密切相关，因此，控制Ta-CCR2基因的表达就能改善小麦的抗病虫害和抵御外界不良环境如干旱的能力。
序列表<110>中国科学院植物研究所<120>在小麦根中特异表达的肉桂酰辅酶A还原酶、编码该酶的基因和含有该基因的表达载体<130>I030179<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1489<212>DNA<213>小麦<220>
<221>CDS<222>(158)..(1231)<223>
<400>1cgcagtgttg tgcggtactg tagtaagtag cagggaagaa ccgttccgag tacacagcgt 60actttgggac ctgtcgatac cttgctaggc accagctgct cgcaacatcc ccggatacgt 120cgtgccaatc cggaagtaag tcgagaggaa gagagag atg ccg atc gag gcg gca 175Met Pro Ile Glu Ala Ala1 5gac aac gtg ccg gcc gag ctt ccc ggc cac ggc cgg acg gtg tgc gtc 223Asp Asn Val Pro Ala Glu Leu Pro Gly His Gly Arg Thr Val Cys Val10 15 20acc ggc gcc ggc ggc ttc atc gcc tcg tgg ctc gtc aag cgc ctc cta 271Thr Gly Ala Gly Gly Phe Ile Ala Ser Trp Leu Val Lys Arg Leu Leu25 30 35cag aag ggc tac aac gtg cgg ggc acc gtt cgc aac cct gtt gat ccg 319Gln Lys Gly Tyr Asn Val Arg Gly Thr Val Arg Asn Pro Val Asp Pro40 45 50aag aat gac cac ctg aga gcc ttc gac ggc gcc gcc gac cgc ctc gtc 367Lys Asn Asp Hi s Leu Arg Ala Phe Asp Gly Ala Ala Asp Arg Leu Val55 60 65 70ctc ctc cgc gcc gac ctt atg gag ccc gaa acc ctc gtc gag gcg ttc 415
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gactcgagtc gacatcg 17<210>5<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
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权利要求
1.一种编码肉桂酰辅酶A还原酶的DNA序列，它选自下组(1)编码SEQ ID NO2的氨基酸序列的DNA序列；(2)与(1)的序列在严谨条件下能够杂交，并能够编码具有活性的肉桂酰辅酶A的DNA序列。
2.按照权利要求
1所述的DNA序列，它具有SEQ ID NO1所示的序列。
3.一种由权利要求
1所述的DNA序列编码的氨基酸序列。
4.按照权利要求
3所述的氨基酸序列，它具有SEQ ID NO2所示的序列。
5.一种含有权利要求
1或2所述的DNA序列的表达载体。
6.按照权利要求
5所述的表达载体，它是一种植物表达载体。
7.按照权利要求
5所述的表达载体，它是含有权利要求
1或2所述的DNA序列的表达载体pET-28a。
专利摘要
本发明提供了一种在小麦根中特异表达的肉桂酰辅酶A还原酶，编码该酶的基因和含有该基因的表达载体。
文档编号C12N9/02GKCN1534095SQ03108445
公开日2004年10月6日 申请日期2003年3月31日
发明者马庆虎 申请人:中国科学院植物研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan