专利名称:双羰基还原酶突变体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域：
，具体涉及一种可用作手性醇合成催化剂的双羰基还原酶(diketoreductase, DKR)的突变体。
背景技术：
生物催化是迄今为止人类所知的最高效和最具有选择性的催化体系。生物体中的酶能以超出人们想象的高速度催化各种生化反应。酶不仅在生物体内，也能在生物体外促进天然和人工合成的化学分子的诸多转换反应，并且显示出优良的化学选择性、区域选择性和立体选择性。与传统的化学合成相比，生物催化反应所要求的的反应条件一般比较温和常温、常压、中性或者接近中性pH。因此，生物催化是最有发展前景的“绿色”合成手段之一。
对134种工业的生物转化进行分析，发现水解酶(44% )和生物催化的氧化还原 (30% )是最常见的工业应用，其中有89%是生物合成手性化合物(参见Curr Org Chem, 2010，14 :1447-1460)。在大量的手性化合物中，具有光学活性的手性醇是一类重要的中间化合物，广泛应用于手性药物、农药以及其他手性化学品的合成。现在获得这些手性醇化合物的一个重要的方法，就是通过脱氢酶和还原酶生物催化还原相应的手性前体酮而得到。 不过，现在人们所掌握并能应用的酶的数量还很有限，使得很多手性醇的合成反应还没有找到合适的生物催化剂。例如，2-氯-1-苯乙醇是一种重要的手性β-卤代仲醇，其取代基团上的卤素易于脱去，可作为手性药物前体参与构成手性环氧化物以及氨基醇类(参见 Chiral chemistry (2004) 24)。在工业生产中，一般利用Baker，s Yeast由α-氯乙酰苯还原生成(R) -2-氯-1-苯乙醇(参见=Tetrahedron (1991) 47 :2073-2080)。(S) -2-氯-1-苯乙醇则可以由海洋真菌催化α-氯乙酰苯的还原反应而得到。然而，这类海洋真菌的催化条件比较苛刻，只有在类似海水的环境中才能产生活性，且产率和立体选择性都较差(参见=Biotechnol Lett (2009) 31 :1559-1563)。目前，可用于催化α-氯乙酰苯生成高光学纯度2-氯-1-苯乙醇的酶鲜有报道。
公开号为CN 1014^514Α的中国发明专利申请公开说明书公开了一种可用于制备3R，5S-双羟基化合物的双羰基还原酶。所述双羰基还原酶能够催化双羰基化合物的还原反应，例如使3，5_ 二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯生成3R，5S- 二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯，同时该生物催化反应具有高度立体选择性(参见=Nature Precedings. http://hdl. handle. net/10101/npre. 2008. 1697. 1 Acta Biochim Biophys Sin. (Shanghai) (2009)41 :163-170)。随后，而et al.也对双羰基还原酶的底物谱进行了研究，发现该酶在催化单羰基底物还原的反应中也是良好的催化剂(Sl=Tetrahedr0n: Asymmetry (2009) 20 =2504-2509) 不过，在催化α -氯乙酰苯生成2-氯-1-苯乙醇的反应中，表现出来的立体选择性较差，仅能获得ee为3. 91%的R构型产物。
酶的催化功能可通过改变其特定的结构而改善。酶的催化活力只集中表现在酶的活性中心内的少数特异氨基酸残基，这些是酶发挥催化作用与底物直接作用的有效基团。双羰基还原酶是羰基还原酶中的一种。这类酶在结构上主要由两个结构域组成，分别是与 NADH或NADPH结合的辅酶结合结构域，以及与底物结合的结构域。与底物结合的结构域由不同理化性质的氨基酸组成，决定了酶催化的底物的特异性。
因此，需要寻找和发现可提高酶立体选择性和催化效率的双羰基还原酶突变体。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种双羰基还原酶突变体，提高其立体选择性和活性。
为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是一种双羰基还原酶突变体，所述双羰基还原酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 20所示任一氨基酸序列具有80%以上的同源性。
一种双羰基还原酶突变体，所述双羰基还原酶突变体的核苷酸序列与SEQID NO. 21 SEQ ID NO. 40所示任一核苷酸序列具有80%以上的同源性。
优选的技术方案中，所述双羰基还原酶突变体对应野生型双羰基还原酶中的氨基酸的突变情况选自以下任意一种
(1)双羰基还原酶的氨基酸序列中第122位的丝氨酸突变为丙氨酸、半光氨酸；
(2)双羰基还原酶的氨基酸序列中第143位的组氨酸突变为丙氨酸、赖氨酸；
(3)双羰基还原酶的氨基酸序列中第146位的天冬酰胺突变为丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及谷氨酰胺；
(4)双羰基还原酶的氨基酸序列中第147位的组氨酸突变为丙氨酸、赖氨酸；
(5)双羰基还原酶的氨基酸序列中第149位的色氨酸突变为丙氨酸、苯丙氨酸；
(6)双羰基还原酶的氨基酸序列中第151位的天冬酰胺突变为丙氨酸；
(7)双羰基还原酶的氨基酸序列中第155位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；
(8)双羰基还原酶的氨基酸序列中第194位的天冬酰胺突变为丙氨酸；
(9)双羰基还原酶的氨基酸序列中第222位的色氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸；
(10)双羰基还原酶的氨基酸序列中第149位的色氨酸和第222位的色氨酸突变为
苯丙氨酸。
本发明同时要求保护一种重组质粒，所述重组质粒含有上述任一双羰基还原酶突变体的编码序列，进一步的技术方案中，将重组质粒转化入宿主细胞而制备得到一种基因工程菌；优选的技术方案中，所述重组质粒是pET22b(+)；所述宿主细胞是大肠杆菌Ε. coli BL21(DE3)。
上双羰基还原酶突变体，在催化羰基化合物生成羟基产物的反应中，与野生型的双羰基还原酶相比，具有不同的催化性质，催化活性、催化效率以及立体选择性等发生了改变。
优选的技术方案中，所述的222位双羰基还原酶突变体可以作为催化剂，催化双羰基化合物生成双羟基产物的反应，突变体与野生型的双羰基还原酶相比，具有更高的催化效率。
因此，本发明要求保护一种双羰基还原酶突变体作为催化双羰基化合物制备双羟基产物反应的催化剂的应用，其中，所述双羰基还原酶突变体对应野生型双羰基还原酶中的第222位的色氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸。
上述技术方案中，所述双羰基化合物的化学通式如下所示
权利要求
1.一种双羰基还原酶突变体，其特征在于，所述双羰基还原酶突变体的氨基酸序列与 SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 20所示任一氨基酸序列具有80%以上的同源性。
2.一种双羰基还原酶突变体，其特征在于，所述双羰基还原酶突变体的核苷酸序列与 SEQ ID NO. 21 SEQ ID NO. 40所示任一核苷酸序列具有80%以上的同源性。
3.一种双羰基还原酶突变体，其特征在于，所述双羰基还原酶突变体对应野生型双羰基还原酶中的氨基酸的突变情况选自以下任意一种(1)双羰基还原酶的氨基酸序列中第122位的丝氨酸突变为丙氨酸、半光氨酸；(2)双羰基还原酶的氨基酸序列中第143位的组氨酸突变为丙氨酸、赖氨酸；(3)双羰基还原酶的氨基酸序列中第146位的天冬酰胺突变为丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸以及谷氨酰胺；(4)双羰基还原酶的氨基酸序列中第147位的组氨酸突变为丙氨酸、赖氨酸；(5)双羰基还原酶的氨基酸序列中第149位的色氨酸突变为丙氨酸、苯丙氨酸；(6)双羰基还原酶的氨基酸序列中第151位的天冬酰胺突变为丙氨酸；(7)双羰基还原酶的氨基酸序列中第155位的谷氨酸突变为谷氨酰胺；(8)双羰基还原酶的氨基酸序列中第194位的天冬酰胺突变为丙氨酸；(9)双羰基还原酶的氨基酸序列中第222位的色氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸；(10)双羰基还原酶的氨基酸序列中第149位的色氨酸和第222位的色氨酸突变为苯丙氨酸。
4.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有权利要求
1 3中任一双羰基还原酶突变体的编码序列。
5.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌含有权利要求
4所述重组质粒。
6.一种双羰基还原酶突变体作为催化双羰基化合物制备双羟基产物反应的催化剂的应用，其特征在于，所述双羰基还原酶突变体对应野生型双羰基还原酶中的第222位的色氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸。
7.根据权利要求
6所述双羰基还原酶突变体作为催化双羰基化合物制备双羟基产物反应的催化剂的应用，其特征在于，所述双羰基化合物的化学通式如下所示
8.一种双羰基还原酶突变体作为催化α-卤代苯乙酮还原成手性醇的催化剂的应用， 其特征在于，所述双羰基还原酶突变体对应野生型双羰基还原酶中的第222位的色氨酸突变为苯丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、酪氨酸。
9.根据权利要求
8所述双羰基还原酶突变体作为催化α-卤代苯乙酮还原成手性醇的催化剂的应用，其特征在于，所述α -卤代苯乙酮的化学通式如下所示
专利摘要
本发明属于生物技术领域：
，具体涉及一种可用作手性醇合成催化剂的双羰基还原酶(diketoreductase,DKR)的突变体；本发明公开了一种双羰基还原酶突变体，所述双羰基还原酶突变体的氨基酸序列与SEQIDNO.1~SEQIDNO.20所示任一氨基酸序列具有80%以上的同源性。和野生型双羰基还原酶相比本发明所述双羰基还原酶突变体具有更高的转化效率，更高的立体选择性。
文档编号C12N1/21GKCN102277338SQ201110220127
公开日2011年12月14日 申请日期2011年8月2日
发明者祁建洲, 陆卓, 陈依军, 黄彦 申请人:中国药科大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan