专利名称:经遍在蛋白或黄瓜花叶病毒外壳蛋白肽的n末端融合在高等植物中增加蛋白质生产的制作方法
发明背景以异源方式生产蛋白质的策略已经广泛用于生物技术领域：
，如从宿主细胞中分泌蛋白质(与信号肽融合)，简便检测或纯化蛋白质产物(与报道酶融合进行检测，与肽标记融合以进行纯化)，筛选具有所需生物活性的蛋白质(如在噬菌体展示技术及双重杂交系统中)。相应蛋白质的表达增强也已经通过小肽与靶蛋白的N末端融合而达到。遍在蛋白基因与遍在蛋白启动子一起与相应基因的5’末端的融合是已用于增强蛋白质表达的系统之一。遍在蛋白存在于所有真核细胞中，且是目前已鉴别的蛋白质中最保守的。它在细胞中是高丰度的且呈现对加热和蛋白酶降解的稳定性。另外，遍在蛋白前体，即遍在蛋白单体头尾连结在一起的多遍在蛋白，和单一遍在蛋白在其C端依附于两个小核糖体蛋白之一的遍在蛋白延伸蛋白，经过裂解遍在蛋白基序C端的遍在蛋白C端水解酶的快速加工，释放游离遍在蛋白单体和C端延伸蛋白。所有这些特点都认定遍在蛋白在遗传工程中是增加靶蛋白积累的良好N端融合配偶体。
遍在蛋白融合方案首先由Butt等(1989)开发，他示出遍在蛋白与酵母金属硫蛋白的融合，或与腺苷酸环化酶刺激性GTP结合蛋白的α亚单位的融合，在大肠杆菌中使这些不稳定或低表达的蛋白质的产量从不可检测水平提高至总细胞蛋白的20％。Ecker等(1989)表明在酵母中遍在蛋白融合导致三个哺乳动物蛋白的表达增强200倍，且所有这些遍在蛋白融合蛋白均由酵母遍在蛋白特异性内肽酶正确加工，以释放真正的功能蛋白。一种类似的酵母遍在蛋白融合系统由Sabin等(1989)报道，其中遍在蛋白/人γ-干扰素和遍在蛋白α1蛋白酶抑制剂是高表达的，并定量裂解产生具有真正氨基端的γ-IFN和α1-PI。
有一些早期报道已经阐述了对在大肠杆菌和酵母中各种蛋白质的遍在蛋白融合表达的大量研究(Baker等，1994；Barr等，1991；Coggan等，1995；Gali和Board，1995；Gehring等，1995；Han等，1994；Kiefer等，1992；Lu等，1990；Lyttle等，1992；Mak等，1989；McDonnell等，1989；McDonnell等，1991；Pilon等，1996；Poletti等，1992；Rian等，1993；Tan和Board，1996；Welch等，1995)。遍在蛋白非常普遍的融合导致细菌中融合蛋白的产量或酵母中裂解产物产量的显著增加。
通过遍在蛋白融合所致的外源蛋白的表达增强在植物中也已观测到。在通过驱动烟草原生质体中GUS报道基因的短暂表达，分析烟草多遍在蛋白基因的启动子Ubi.U4的过程中，Gensohik等(1994)发现，从自-263位跨越至第一个遍在蛋白编码单位末端的Ubi.U4片段中缺失内含子序列对GUS活性无可检测的影响，但进一步缺失遍在蛋白编码序列使GUS活性削弱55％。
这些研究无一显示遍在蛋白融合异源启动子的直接增强功能。Garbarino和Belknap(1994)观测到启动子加上马铃薯遍在蛋白延伸蛋白基因uBi3的遍在蛋白编码区与GUS报道基因的融合导致GUS活性比在转基因马铃薯中ubi3启动子与GUS基因的直接融合的GUS活性高5-10倍。同样，ubi3启动子和遍在蛋白编码序列对增强GUS活性的协同作用未排除。在另外对马铃薯多遍在蛋白基因ubi7的研究中，相同研究小组(Garbarino等，1995)表明在含有ubi7启动子-5’未翻译序列-内含子-第一个遍在蛋白编码单位的融合构建体中转基因马铃薯植物GUS表达水平，比衍生自只有ubi7启动子和5’翻译序列的表达水平高10倍。然而，内含子和遍在蛋白融合对提高GUS报道基因的表达水平的影响未明显辨别。
除上述刊物文章之外，从1989年开始已有一些关于遍在蛋白融合技术的专利申请。如表1所示。本文所用的以例证本发明背景或提供额外相关实践的阐述的出版物及其它材料均并入参考，并分别在所附参考文献表中列出。
表1相关遍在蛋白融合技术的专利
发明概述根据本发明的方法，通过将遍在蛋白单体编码序列与蛋白质的编码序列的5’末端融合，可增强蛋白质在植物或植物细胞中的表达。遍在蛋白融合蛋白的表达是通过不同于多遍在蛋白基因或遍在蛋白延伸蛋白基因的启动子的启动子驱动的。因此，蛋白质表达水平的增强是由于5’端附加遍在蛋白单体编码序列所致。此遍在蛋白融合蛋白推测通过植物遍在蛋白特异蛋白酶，在蛋白羧基端76残基甘氨酸处裂解，以产生具有所需生物性质的蛋白质。本发明第二方面是黄瓜花叶病毒外壳蛋白的N端14个氨基端残基的肽(NP14)可用作N端融合配偶体，以提高靶蛋白在植物中的表达水平。本发明所述的N端融合方案通过真正形式的遍在蛋白融合系统或作为NP14融合系统中的融合蛋白使蛋白质在植物中产量更高。
附图简述
图1示出烟草ubi.NC89的核苷酸序列和推导的氨基酸序列。核苷酸序列在序列表中示为SEQ ID NO1，氨基酸序列在序列表中示为SEQ ID NO2。用于PCR中的引物下划线，修改的37-mer寡核苷酸下划双线。
图2示出编码CMV CP的14个N端氨基酸(NP14)的合成DNA。此核苷酸序列是SEQ ID NO3，氨基酸序列是SEQ ID NO4。
图3例证了遍在蛋白-GUS融合蛋白表达载体pUG的构建。pSKUBC1的核苷酸序列是SEQ ID NO5，pBI221的序列是SEQ IDNO6，pUG的序列是SEQ ID NO7。
图4例证了NP14-GUS融合蛋白表达载体pCG的构建。pUCG2的核苷酸序列是SEQ ID NO8。
图5例证了遍在蛋白-萤光素酶融合蛋白表达载体pUL的构建。pBIubi中Stul的识别序列中标记的箭头是指遍在蛋白编码区的末端和遍在蛋白融合蛋白的裂解位点。上方pBIubi的核苷酸序列是SEQ ID NO9，下方pBIubi的核苷酸序列是SEQ ID NO10，pUL的核苷酸序列是SEQ ID NO11。
图6例证了NP14-萤光素酶融合蛋白表达载体的构建。pCL的核苷酸序列是SEQ ID NO12。
图7例证了遍在蛋白-GUS融合体/LUC双报道二元载体pUGL121的构建。
图8例证了NP14-GUS融合体/LUC双报道二元载体pCGL121的构建。
图9例证了GUS/LUC双报道二元载体pBIL121的构建。
图10例证了遍在蛋白融合体克隆载体pBIubi。上面的核苷酸序列是SEQ ID NO13，下面的序列是SEQ ID NO14。
图11示出了NP14融合体克隆载体pBINP14。
发明详述本发明涉及增加植物中蛋白质产生的方法和构建物。此方法包括在需要增强表达的基因5’端融合一个增强表达的核酸。本发明一方面是将一个遍在蛋白基因插入编码所需蛋白的基因的前面，这样产生一种融合蛋白，其中遍在蛋白直接融合于所需蛋白质的氨基端。酶如C端水解酶将裂解融合蛋白中的遍在蛋白的C端，从而释放天然形式的所需蛋白以及生成游离遍在蛋白。所得融合蛋白中存在遍在蛋白基因导致基因表达增强，从而比在没有遍在蛋白基因的情况中产生更大量的所需蛋白质。必需使用的只是遍在蛋白基因的编码部分。遍在蛋白启动子是非必需的，且遍在蛋白基因融合体可在异源启动子的控制下。
本发明的第二方面是将编码黄瓜花叶病毒外壳蛋白的14个氨基酸的核酸置于编码所需蛋白的基因的前面，这样产生融合蛋白，其中融合蛋白在其氨基端包括黄瓜花叶病毒外壳蛋白的14个氨基酸，这样可见蛋白质产生增加。
以下实施例只是举例说明而非以任何方式限制本发明。利用了本领域熟知的标准技术或在下面特别阐述的技术。如原生质体转染，制备转基因烟草植物，荧光GUS分析及萤光素酶分析等技术本领域技术人员已熟知。在此不再详述。
实施例1编码烟草遍在蛋白和CMV外壳蛋白N端肽的DNA序列遍在蛋白单体的编码序列含有228个碱基对。5’部分的191个碱基对通过在Nicotiana tobacum var.NC89的总DNA上经过聚合酶链反应(PCR)扩增而得，剩余37个碱基对如合成寡核苷酸方式制备。产生涵盖起始密码子ATG的SphI位点和在最后的密码子GGC之后的NcoI位点以促进克隆。然后将烟草遍在蛋白编码序列克隆入pGEM-5ZF中并测序。图1示出烟草遍在蛋白的DNA序列和推导的氨基酸序列。此76个氨基酸的序列等同于衍生自烟草多遍在蛋白基因ubi.U4的序列(Genschik等，1994)。然而，扩增自烟草DNA的区域的核苷酸序列不同于在ubi.U4中发现的所有遍在蛋白单体的相应区域。我们已将此烟草遍在蛋白编码序列命名为ubi.NC89。
黄瓜花叶病毒外壳蛋白(CMV CP)是由病毒次基因组的RNA4编码，并包括218个氨基酸残基。毒株CMV-SD的CP基因通过RT-PCR克隆(Guo等，1993)，将编码14个N端氨基酸(NP14)的cDNA序列通过NcoI/AccI酶切从CP基因上切下或经化学合成。在合成的NP14编码序列中(图2)，将针对BamHI和SalI位点的突出端衔接头分别附于5’和3’末端以便于克隆。
实施例2用于进行瞬时表达分析的翻译的融合体构建体
A.遍在蛋白-GUS融合构建体pUGubi.NC89序列作为XbaI-Ncol(补平的)片段得自质粒pSKUBCl，并插入pBI221中GUS基因上游的XbaI-BamHI(补平的)位点，以构建如图3所示的pUG。
B.NP14-GUS融合构建体pCG质粒pUCG2是pBI221的衍生物，其中将连接为一个连续ORF的ubi.NC89序列和NP14序列插入GUS基因前面的XbaI-SmaI位点。遍在蛋白基序通过XbaI-SacII酶切从pUCG2中除去，并通过再环化生成pCG。图4清晰地例证了这些步骤。
C.遍在蛋白-LUC融合构建体pUL将含有萤火虫萤光素酶(LUC)基因的一个NcoI(补平的)-SstI片段，通过多接头区域中的StuI-SstI位点，插入遍在蛋白融合载体pBIubi(见图10)中ubi.NC89的下游，形成图5所示pUL。
D.NP14-LUC融合构建体pCL将含有LUC基因的NcoI(补平的)-SstI片段，通过AccI(或等价位点SalI)(补平的)-SstI位点，插入NP14融合载体pBINP14(见图11)中NP14编码序列的下游，产生图6所示pCL。
实施例3进行稳定转化的GUS/LUC双报道基因构建体为测试N端附加遍在蛋白或CMV CP NP14增强GUS在稳定转化的植物中表达的作用，产生一系列GUS/LUC(测试/参考)双报道基因构建体。它们必需基于用于瞬时表达分析的融合构建体pUG和pCG。将嵌合的GUS表达盒移入植物转化中间质粒pBI121中，分别产生pUG121和pCG121。参考的报道基因LUC的表达盒是作为HindIII片段预制的(HindIII-35S/LUC/NOS-HindIII)，然后分别插入pUG121，pCG121和pBI121的单一HindIII位点，报道基因LUC是用LUC基因置掀pBI121中的GUS基因而构建的。所得GUS/LUC双报道基因构建体pUGL121，pCGL121和pBIL121分别如图7，8和9所示。
实施例4遍在蛋白融合体增强GUS和LUC在烟草原生质体中表达将遍在蛋白-GUS融合构建体pUG或对照质粒pBI221，与含有由35S启动子驱动的LUC基因的参考质粒FFO一起导入衍生自烟草BY-2悬浮细胞的烟草原生质体中。GUS活性通过萤光素酶活性确定及标准化。在4个独立的转染试验中，pUG中的标准化的GUS活性(AGUS)显著高于pBI221中的活性。由于遍在蛋白融合体所提高的倍数平均为6(表2)。当使用LUC作报道基因及用GUS作内在标准从pBI221中表达时，在三个独立的转染试验中pUL中标准化LUC活性比对照质粒p35SLUC(35S-LUC-NOS)中的活性高1.37-3.11倍，平均提高大约2倍(表3)。
实施例5CMV CP NP-14是比遍在蛋白更有效的融合配偶体在与上述遍在蛋白融合研究并行的试验中，测试NP14融合体增强GUS和LUC在烟草原生质体中表达的作用。NP-14-GUS融合构建体pCG比pBI221产生平均高11倍的GUS活性。这些结果示于表2。NP14与LUC的融合与pCL及p35SLUC的标准化LUC活性相比，计算出LUC活性增加2.87倍。这些结果示于表3。这表明NP14与遍在蛋白相比，在增强GUS和LUC在烟草细胞中表达方面是更有效的融合配体。
表2标准化GUS活性及N端融合构建体的增强倍数
注1、标准化GUS活性是通过下式计算的ΔGUSn=GUSn×LUC221LUCn]]>其中n代表特定的GUS融合构建体，221代表pBI221。
2、增强倍数E以下式计算ΔGUSnGUS221]]>表3、N端融合构建体的标准化LUC活性及增强倍数
注1、标准化LUC活性ΔLUC如下式计算
ΔLUCn=LUCn×GUSp35SLUCGUSn]]>其中n代表特定的LUC融合构建体。
2、增强倍数E如下计算ΔLUCnLUCp35SLUC]]>实施例6遍在蛋白和NP14融合体增强GUS在转基因植物中表达为测试遍在蛋白融合体和NP14融合体增强GUS在稳定转化的植物中的表达，基于二元载体pBI121制备3个GUS/LUC(测试/参考)双报道基因构建体。pUGL121，pCGL121和pBIL121分别含有遍在蛋白-GUS，NP14-GUS和GUS(对照)表达盒，并且参考的LUC表达盒整合入每个质粒中(图7-9)。制备用这三个构建体的每个构建体转化的烟草植物，并分析GUS和LUC活性。每个植物在二个独立的实验中分析2次，并只将在二个实验中显示相对GUS活性(GUS/LUC)的合适的一致性的植物进行对比。如表4所示，尽管相对GUS活性在相同构建体的不同转化体中存在变化，但含有35S-遍在蛋白/GUS融合构建体的5个合格植物的平均GUS表达水平，比衍生自含有35S-GUS构建体的6个植物的表达水平高4倍，证实如前述在烟草原生质体中观测到的一样，遍在蛋白融合体对GUS表达有增强作用。另外，NP14融合体比遍在蛋白融合体增强GUS表达的作用强。14个pCGL植物的平均相对GUS活性是衍生自pBIL121构建体的活性的7倍。
实施例7遍在蛋白融合体和NP14融合体克隆载体pBIubi(图10)和pBINP14(图11)是分别使ubi.NC89和CMVCP NP14编码序列插入靶基因下游的两个融合蛋白表达载体。这二个载体均衍生自pBI221，用ubi.NC89或NP14编码序列置换GUS基因而得。在pBIubi中，多接头序列附于ubi.NC89序列的3’末端，ubi.NC89的倒数第二个密码子由GGT改变为GGA以在多接头区中产生StuI位点。在pBINP14中，二个克隆位点SalI(在此与AccI位点等价)和SstI用于克隆NP14序列下游的靶基因(NP14序列的最后5个碱基对形成部分SalI识别序列)。为用AccI代替SalI裂解pBINP14，消除在CaMV35S启动子-393位的AccI位点。
表4遍在蛋白融合体和NP14融合体对GUS在转基因烟草植物中表达的作用
本发明通过参考本发明优选实施方案的详细论述已经揭示，应知此揭示只是例证而非限制本发明，本领域技术人员在本发明精神及所附权利要求
范围内可对本发明加以修改。
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美国专利5,093,242美国专利5,196,321美国专利5,496,721PCT公开号WO89/09829PCT公开号WO92/08795
PCT公开号WO94/23040PCT公开号WO95/21269PCT公开号WO95/29195PCT公开号WO96/03519PCT公开号WO96/04377PCT公开号WO96/03522EP 608532
序列表<110>Fang，Rong-XiangWu.Jun-LinChen，Xiao-Ying分子农业生物学院<120>经遍在蛋白或黄瓜花叶病毒外壳蛋白肽的N末端融合在高等植物中增加蛋白质生产<130>GM/AY/RN/R33-59<140>PCT/SG 98/00103<141>1998-12-11<160>14<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>235<212>DNA<213>Nicotiana tabacum<220>
<221>CDS<222>(3)..(230)<220>
<223>野生型经修饰而在包含起始密码子ATG的区域中插入一SphI位点并且在最后一个密码子GGC后插入一NcoI位点<400>1gc atg cag atc ttc gta aag acc ctg acg ggg aag act att acc tta 47Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu1 5 10 15gag gta gag tca tcg gac acc att gac aat gtt aag gct aag att cag 95Glu Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln20 25 30gac aag gaa ggc att cca ccg gac cag cag cgg ttg att ttc gca ggt 143Asp Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly35 40 45aag cag ctt gag gat ggc cga aca cta gct gac tac aac atc cag aag 191Lys Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ala Asp Tyr Asn Ile Gln Lys50 55 60gag tcc act ctc cat ctc gtc tta aga ctc cgc ggt ggc catgg 235Glu Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly
65 70 75<210>2<211>76<212>PRT<213>Nicotiana tabacum<400>2Met Gln Ile Phe Val Lys Thr Leu Thr Gly Lys Thr Ile Thr Leu Glu1 5 10 15Val Glu Ser Ser Asp Thr Ile Asp Asn Val Lys Ala Lys Ile Gln Asp20 25 30Lys Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Lys35 40 45Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ala Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu50 55 60Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Leu Arg Gly Gly65 70 75<210>3<211>53<212>DNA<213>黄瓜花叶病毒<220>
<221>CDS<222>(6)..(47)<400>3gatcc atg gac aaa tct gaa tca acc agt gct ggt cgt aac cgt cga 47Met Asp Lys Ser Glu Ser Thr Ser Ala Gly Arg Asn Arg Arg1 5 10cgagct 53<210>4<211>14<212>PRT<213>黄瓜花叶病毒<400>4Met Asp Lys Ser Glu Ser Thr Ser Ala Gly Arg Asn Arg Arg1 5 10
<210>5<211>13<212>DNA<213>质粒pSKUBC1<220>
<221>misc_特征<222>()..)<223>两个基因融合的连接区<400>5ggccatggac aaa 13<210>6<211>33<212>DNA<213>质粒pBI221<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(33)<223>35S启动子和GUS的连接区.
<400>6tctagaggat ccccgggtgg tcagtccctt atg 33<210>7<211>18<212>DNA<213>质粒pUG<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(18)<223>融合基因的连接区.
<400>7ggccatggat ccccgggt 18<210>8<211>18<212>DNA<213>质粒pUCG2<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(18)
<223>融合基因的连接区<400>8ctccgcggtg gcatggac 18<210>9<211>29<212>DNA<213>质粒pBIubi<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(29)<223>启动子和融合基因的连接区<400>9tctagaacta gtggatccct ggcatgcag 29<210>10<211>35<212>DNA<213>质粒pBIubi<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(35)<223>遍在蛋白基因的最后2个密码子，后接多接头序列<400>10ggaggcctgt cgactcgagc ccgggtaccg agctc 35<210>11<211>12<212>DNA<213>质粒pUL<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(12)<223>融合基因的连接区<400>11ggaggcatgg aa 12<210>12<211>12<212>DNA
<213>质粒pCL<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(12)<223>融合基因的连接区<400>12cgtcgcatgg aa 12<210>13<211>29<212>DNA<213>质粒pBIubi<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(29)<223>启动子和基因的连接区<400>13tctagaacta gtggatccct ggcatgcag 29<210>14<211>35<212>DNA<213>质粒pBIubi<220>
<221>misc_特征<222>(1)..(35)<223>融合基因和终止子之间的具有多克隆序列的连接区<400>14ggaggcctgt cgactcgagc ccgggtaccg agctc 35
权利要求
1.一种增加作为融合蛋白一部分的所需蛋白质在植物细胞或植物中的产量的方法，包括将第一个核酸插入第二个核酸上游以形成融合核酸，其中所述第一个核酸编码SEQ ID NO4的蛋白质，所述第二个核酸编码所述的所需蛋白质，且所述融合核酸编码所述融合蛋白。
2.权利要求
1的方法，其中所述SEQ ID NO4蛋白的羧基端与所述的所需蛋白质氨基端形成一肽连键。
3.权利要求
1的方法，其中所述第一个核酸由SEQ ID NO3的6-47位碱基组成。
4.权利要求
1的方法，其中所述融合核酸在35S启动子的控制下。
5.一种能转化植物细胞的载体，其中所述载体由编码融合蛋白的核酸组成，其中所述融合蛋白包含与相应蛋白连接的SEQ ID NO4的蛋白。
6.权利要求
5的载体，其中所述SEQ ID NO4的蛋白在其羧基端与所述相应蛋白的氨基端经肽键连接。
7.权利要求
5的载体，其中所述核酸在35S启动子控制下。
8.权利要求
5的载体，其中所述载体包含SEQ ID NO3的6-47位碱基。
9.一种包含权利要求
5的载体的植物细胞。
10.一种包含SEQ ID NO3的核酸。
11.一种由SEQ ID NO3组成的核酸。
12.一种由SEQ ID NO4组成的蛋白质。
13.一种融合蛋白，其中所述融合蛋白在其氨基端由SEQ IDNO4的蛋白组成，并且所述融合蛋白在其羧基端包含第二种蛋白。
14.权利要求
13的融合蛋白，其中所述SEQ ID NO4的蛋白的羧基端与所述第二种蛋白质氨基端形成肽连键。
专利摘要
本发明公开了增加蛋白质产量的方法。一种方法包括通过将编码遍在蛋白的基因插入编码相应蛋白的基因的前面而制备一种载体，并将所述载体插入细胞。由此，一种融合蛋白将被表达，其包括遍在蛋白加上相应蛋白。遍在蛋白C端水解酶可裂解所述融合蛋白，使所需蛋白呈游离态。这一方法与不包含遍在蛋白基因作为载体的一部分的方法相比，使相应蛋白质的产量增加。遍在蛋白启动子对于获得这种增加的产量不是必需的并因此未使用。第二种方法非常类似，只是用编码黄瓜花叶病毒外壳蛋白的14个氨基酸的基因代替遍在蛋白基因插入相应蛋白质的前面。这一方法导致一种融合蛋白的表达，该融合蛋白包含与相应蛋白质结合的所述外壳蛋白的14个氨基酸残基。该融合蛋白的产量比当该外壳蛋白基因片段不存在于所述载体中时的蛋白质产量高。在两种方法中，基因可置于异源启动子如35S启动子的控制之下。
文档编号C12N15/63GKCN1209461SQ98814356
公开日2005年7月6日 申请日期1998年12月11日
发明者方荣祥, 吴俊林, 陈晓英 申请人:分子农业生物学院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan