专利名称:一种藤仓赤霉的电穿孔遗传转化方法
技术领域：
本发明涉及赤霉菌Gibberella fujikuroi的电穿孔遗传转化技术，适用于赤霉菌的遗传工程以及赤霉菌分子生物学研究等领域。
背景技术：
藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)是赤霉素的产生菌，在水稻上因过度产生赤霉素而引起恶苗病，该病在我国各水稻产区都有发生，给水稻生产造成严重威胁。赤霉素是一种植物生长调节剂，在植物生长发育中有非常重要的作用，在水果、蔬菜、水稻等作物上有非常广泛的应用。赤霉素还可以用于啤酒生产工业、临床医学等方面。
赤霉菌已成为具有良好开发前景的丝状真菌之一，目前很多研究正在试图通过基因工程的办法改良菌种。同时，赤霉菌对水稻的致病分子生物学以及发育的研究也引起高度重视。但是，遗传转化方法的研究开发是对赤霉菌实施基因工程和分子生物学研究的前提。
丝状真菌的遗传转化目前主要有醋酸锂介导的孢子转化法、PEG介导原生质体转化法、农杆菌介导的转化法和电穿孔转化法。在赤霉菌(G.fujikuroi)中，目前只有前2种转化方法有应用--孢子转化法、PEG介导原生质体转化法，尚未有利用电穿孔转化的报道。孢子转化法仅限于能够产生孢子的赤霉菌菌株，PEG介导原生质体转化法应用较多，但是转化步骤多，效率不高。电穿孔转化技术在微生物等的遗传转化中具有很高的效率，而且简单易行，已广泛应用于基因工程和分子生物学等研究。Bio-rad、Phamacia等世界著名公司已开发了电穿孔仪。
本发明首次利用了电穿孔技术对藤仓赤霉(G.fujikuroi)实施了外源基因转化，找到了合适的转化参数并优化了参数的组合，转化程序较现有的其它方法更简单，提高了转化效率，此法可用于赤霉菌的遗传工程以及分子生物学研究和应用。
发明内容本发明目的是提供一种利用电穿孔(electroporation)技术对藤仓赤霉(G.fujikuroi)进行外源基因的遗传转化方法，并找到转化效率较高的转化参数组合，可用于赤霉菌遗传工程以及分子生物学研究等领域，以解决其它的遗传转化方法的不足之处。
本发明达到发明目的所采用的技术方案是利用真菌细胞壁降解酶对赤霉菌的细胞壁进行处理，得到原生质体并进行纯化，纯化的原生质体和适量外源基因/脱氧核糖核酸(DNA)水溶液进行混合，然后利用电穿孔仪对混合液进行电击处理，电击处理的原生质体可以吸纳外源DNA，从而实现了外源DNA对赤霉菌的遗传转化。
所述的藤仓赤霉Gibberella fujikuroi的电穿孔遗传转化方法按如下步骤进行1)将藤仓赤霉原生质体用1M山梨醇溶液A悬浮，以显微镜检查计数，调整原生质体液的原生质体浓度为107-108/mL；2)用于转化的外源DNA溶于无菌去离子水至浓度为5～10μg/ul，每100ul原生质体液中加入10～15μgDNA，混匀，冰浴30～40min成混合液；
3)在预冷的电击杯中加入步骤2)所得混合液，冰浴5～10min后，用电穿孔仪进行电击；4)电击后电击杯中加入浓度为1M的山梨醇溶液B，冰浴30min～1h，悬浮后涂布于MYG固体再生培养基平板，28℃培养12h后，于再生平板上覆盖含与所述外源DNA相应的抗生素终浓度50μg/mL的软琼脂MYG再生培养基，在28℃培养至转化子出现；所述的山梨醇溶液B溶液中含有10mM Tris-Cl，50mM CaCl2，且pH7.5；所述的MYG固体再生培养基终浓度为麦芽糖5g/L；酵母膏5g/L；葡萄糖10g/L；琼脂粉15g/L；蔗糖0.5mol/L；pH6.5；所述软琼脂MYG再生培养基终浓度为麦芽糖5g/L；酵母膏5g/L；葡萄糖10g/L；琼脂粉8g/L；pH6.5。
6)化子在含与所述外源DNA相应的抗生素终浓度100μg/ml的软琼脂MYG再生培养基上继代培养，稳定生长后保存，所述软琼脂MYG再生培养基终浓度为麦芽糖5g/L；酵母膏5；葡萄糖10g/L；琼脂粉8g/L；pH6.5。
所述的藤仓赤霉菌的原生质体的制备方法如下(1)Dryslase和Lying enzyme(Sigma)质量比为3∶7的混合酶溶解于1M MgSO4溶液中，制成终浓度为15mg/ml的细胞壁降解酶液，所述的酶液经过滤灭菌后每10mL酶液加入约0.9～1.1g湿菌体，置30℃的摇床，转速为50～60rpm，酶解游离原生质体3～4h得原生质体酶解液；(2)将原生质体酶解液离心，倾出上层原生质体液，过滤除去菌丝残片，在含原生质体的滤液中滴入无菌去离子水使MgSO4的浓度为0.5M，离心得原生质体沉淀。
所述的藤仓赤霉菌的湿菌体的制备方法如下a.在PDA培养基平板上进行藤仓赤霉菌种活化，培养温度26-28℃，所述的PDA培养基终浓度为马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，琼脂粉15g/L；pH自然，在121℃下灭菌18分钟；b.取经活化的藤仓赤霉菌种接种至含玻璃珠的MYG液体培养基，置于温度为26～28℃、转速为200rpm的摇床培养20h，所述的MYG液体培养基终浓度为麦芽糖5g/L；酵母膏5g/L；葡萄糖10g/L；pH6.5；c.将步骤b所得培养液按10％的接种量在MYG液体培养基进行扩大培养20h；d.将步骤c所得培养液用灭菌的单层滤布miracloth(Calbiochem)进行过滤，用无菌去离子水冲洗滤布上的菌丝体，重复2～4次，去除残余培养液，再用1M MgSO4冲洗2～4次，收集湿菌体。
由于目前真菌绝大多数用潮霉素筛选，故本发明中所述的外源DNA优选带有潮霉素抗性基因的质粒pAN7-1，与其相应的抗生素为潮霉素。其它带有潮霉素抗性基因的质粒，如质粒pCB1003，pCB1004(Anne M.Carroll，et al，Fungal Genetics Newsletter 1994，4122)等，同样适用于本发明。其它任何可以转化真菌的DNA或质粒，也可采用本发明所述的方法进行转化。
具体的，所述的方法按如下步骤进行1)将藤仓赤霉原生质体用1M山梨醇溶液A悬浮，以显微镜检查计数，调整原生质体液的原生质体浓度为107/mL；2)用于转化的外源质粒pAN7-1(Punt et al.1987 Gene 56117-124)经限制酶切成线状，纯化后溶于无菌去离子水5～10μg/uL，每100uL原生质体液中加入10μg DNA，混匀，冰浴30min成混合液；3)预冷的2cm电击杯，中加入步骤2)所得混合液40uL冰浴5min后，准备电穿孔仪，设定电击参数电压为850V，电容25μF，电阻为250Ω，进行电击；4)电击后电击杯中加入1mL浓度为1M山梨醇溶液B，冰浴30min～1h，悬浮后涂布于MYG固体再生平板，200uL/皿，28℃培养12h后，于再生平板上覆盖含潮霉素终浓度50μg/mL的软琼脂MYG再生培养基，10mL/平板，在28℃培养至转化子出现；所述的山梨醇溶液B溶液中含有10mMTris-Cl，50mM CaCl2，且pH7.5；5)转化子在含潮霉素终浓度为100μg/mL的软琼脂MYG再生培养基上继代培养，稳定生长后保存。
本发明的有益效果体现在可以用于藤仓赤霉的分子生物学研究，如研究该菌对水稻的致病分子机制以及该菌的生长发育机制等。可以用来对赤霉菌实施基因工程从而进行遗传改良育种，提高赤霉素的合成能力。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例1利用电穿孔法对藤仓赤霉(Gibberella fujikuroi)进行外源抗潮霉素基因的遗传转化利用
发明内容
中所述的方法，将含潮霉素抗性基因的外源质粒pAN7-1导入了赤霉菌，通过潮霉素筛选获得了稳定转化的工程菌，转化效率高于醋酸锂介导的孢子转化法，比聚乙二醇PEG介导的转化法步骤简单。具体方法如下1.赤霉菌原生质体的制备1)在PDA培养基平板上进行藤仓赤霉菌种活化，培养温度26～28℃。
PDA培养基终浓度为马铃薯，200g/L；蔗糖，20g/L；琼脂粉，15g/L；pH自然。在121℃下灭菌18分钟。
2)取1小块接种至MYG液体培养基(含约40粒玻璃珠)，置于温度为26～28℃、转速为200rpm的摇床培养20h。所述的MYG液体培养基终浓度麦芽糖5g/L；酵母膏5g/L；葡萄糖10g/L；pH6.5；3)将步骤2)培养液按10％的接种量在MYG液体培养基进行扩大培养20h。MYG液体培养基终浓度麦芽糖5g/L；酵母膏5g/L；葡萄糖10g/L；pH6.5；4)将步骤3)培养液用灭菌的单层滤布miracloth(Calbiochem)进行过滤，用无菌去离子水冲洗滤布上的菌丝体多次，尽量去除残余培养液，然后用1M MgSO4冲洗3次，收集湿菌体。
5)配制细胞壁降解酶液，用质量配比为Dryslase∶Lying enzyme＝3∶7的混合酶溶解于1M MgSO4，终浓度约为15mg/ml，酶液经过滤除菌后加入赤霉菌湿菌体，每10ml酶液中加入1克湿菌体。置30℃的摇床，转速为60rpm下酶解游离原生质体4h。
6)原生质体酶解液以500rpm离心10min，上层原生质体液经灭菌的双层滤布miracloth过滤除去菌丝残片，在含原生质体的滤液中缓缓滴入无菌去离子水调节MgSO4的浓度至0.5M，3500rpm离心10min，沉淀原生质体。
7)原生质体沉淀用1M山梨醇溶液悬浮，3500rpm离心10min，重复1次。
8)原生质体沉淀悬浮于适量1M山梨醇溶液100μL，显微镜检检查和计数，调整原生质体的浓度为107/ml左右，用于以下转化。
2.电穿孔法对原生质体进行外源DNA转化1)DNA制备。用于转化的外源质粒pAN7-1(Punt et al.1987 Gene56117-124)经限制酶切成线状，纯化后溶于无菌去离子水，浓度10ug/ul，用于转化。
2)100ul原生质体液中加入10ug DNA，混匀，冰浴30min后，取40ul混合液加入至预冷的电击杯(2cm)，冰浴5min后，准备电穿孔仪，设定电击参数进行电击。电压，850V；电容25μF；电阻，250Ω。
3)电击后加入1ml浓度为1M的山梨醇溶液(含10mM Tris-Cl，pH7.5，50mMCaCl2)，冰浴1h，悬浮后涂布于MYG固体再生平板，200ul/皿。28℃培养12h后，于再生平板上覆盖含潮霉素(50ug/ml)的软琼脂MYG再生培养基，10ml/平板。继续在28℃培养观察转化子的出现。所述的MYG固体再生培养基终浓度为麦芽糖5g/L；酵母膏5g/L；葡萄糖10g/L；琼脂粉15g/L；蔗糖0.5mol/L；pH6.5；所述软琼脂MYG再生培养基麦芽糖5g/L；酵母膏5g/L；葡萄糖10g/L；琼脂粉8g/L；pH6.5。
4)转化子在提高潮霉素浓度(100ug/ml)的上述MYG固体再生培养基上继代培养，稳定生长后保存。
结果转化率在大于8个转化子/ug DNA以上，相对于LESLIE and DICKMAN(APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，May 1991，p.1423-1429)的醋酸锂介导的孢子转化法(1-2个转化子/ug DNA)，有较大提高。
权利要求
1.一种藤仓赤霉的电穿孔遗传转化方法，其特征在于所述的方法按如下步骤进行1)将藤仓赤霉原生质体用1M山梨醇溶液A悬浮，以显微镜检查计数，调整原生质体液的原生质体浓度为107-108/mL；2)用于转化的外源DNA溶于无菌去离子水至浓度为5～10μg/ul，每100ul原生质体液中加入10～15μgDNA，混匀，冰浴30～40min成混合液；3)在预冷的电击杯中加入步骤2)所得混合液，冰浴5～10min后，用电穿孔仪进行电击；4)电击后电击杯中加入浓度为1M的山梨醇溶液B，冰浴30min～1h，悬浮后涂布于MYG固体再生培养基平板，28℃培养12h后，于再生平板上覆盖含与所述外源DNA相应的抗生素终浓度50μg/mL的软琼脂MYG再生培养基，在28℃培养至转化子出现；所述的山梨醇溶液B溶液中含有10mM Tris-Cl，50mM CaCl2，且pH7.5；所述的MYG固体再生培养基终浓度为麦芽糖5g/L；酵母膏5g/L；葡萄糖10g/L；琼脂粉15g/L；蔗糖0.5mol/L；pH6.5；所述软琼脂MYG再生培养基终浓度为麦芽糖5g/L；酵母膏5g/L；葡萄糖10g/L；琼脂粉8g/L；pH6.5。6)转化子在含与所述外源DNA相应的抗生素终浓度100μg/mL的软琼脂MYG再生培养基上继代培养，稳定生长后保存，所述软琼脂MYG再生培养基终浓度为麦芽糖5g/L；酵母膏5；葡萄糖10g/L；琼脂粉8g/L；pH6.5。
2.如权利要求
1所述的藤仓赤霉的电穿孔遗传转化方法，其特征在于所述的藤仓赤霉菌的原生质体的制备方法如下(1)Dryslase和Lying enzyme质量比为3∶7的混合酶溶解于1MMgSO4溶液中，制成终浓度为15mg/ml的细胞壁降解酶液，所述的酶液经过滤灭菌后每10mL酶液加入约0.9～1.1g湿菌体，置30℃的摇床，转速为50～60rpm，酶解游离原生质体3～4h得原生质体酶解液；(2)将原生质体酶解液离心，倾出上层原生质体液，过滤除去菌丝残片，在含原生质体的滤液中滴入无菌去离子水使MgSO4的浓度为0.5M，离心得原生质体沉淀。
3.如权利要求
2所述的藤仓赤霉的电穿孔遗传转化方法，其特征在于所述的藤仓赤霉菌的湿菌体的制备方法如下a.在PDA培养基平板上进行藤仓赤霉菌种活化，培养温度26～28℃，所述的PDA培养基终浓度为马铃薯200g/L，蔗糖20g/L，琼脂粉15g/L；pH自然，在121℃下灭菌18分钟；b.取经活化的藤仓赤霉菌种接种至含玻璃珠的MYG液体培养基，置于温度为26～28℃、转速为200rpm的摇床培养20h，所述的MYG液体培养基终浓度为麦芽糖5g/L；酵母膏5g/L；葡萄糖10g/L；pH6.5；c.将步骤b所得培养液按10％的接种量在MYG液体培养基进行扩大培养20h；d.将步骤c所得培养液用灭菌的单层滤布miracloth进行过滤，用无菌去离子水冲洗滤布上的菌丝体，重复2～4次，去除残余培养液，再用1M MgSO4冲洗2～4次，收集湿菌体。
4.如权利要求
1所述的藤仓赤霉的电穿孔遗传转化方法，其特征在于所述的外源DNA为带有潮霉素抗性基因的质粒pAN7-1，所述的抗生素为潮霉素。
5.如权利要求
1所述的藤仓赤霉的电穿孔遗传转化方法，其特征在于所述的方法按如下步骤进行1)将藤仓赤霉原生质体用1M山梨醇溶液A悬浮，以显微镜检查计数，调整原生质体液的原生质体浓度为107/mL；2)用于转化的外源质粒pAN7-1经限制酶切成线状，纯化后溶于无菌去离子水5～10μg/uL，每100uL原生质体液中加入10μg DNA，混匀，冰浴30min成混合液；3)冰上预冷的2cm电击杯，中加入步骤2)所得混合液40uL冰浴5min后，准备电穿孔仪，设定电击参数电压为850V，电容25μF，电阻为250Ω，进行电击；4)电击后电击杯中加入1mL浓度为1M山梨醇溶液B，冰浴30min～1h，悬浮后涂布于MYG固体再生平板，200uL/皿，28℃培养12h后，于再生平板上覆盖含潮霉素终浓度50μg/mL的软琼脂MYG再生培养基，10mL/平板，在28℃培养至转化子出现；所述的山梨醇溶液B溶液中含有10mM Tris-Cl，50mM CaCl2，且pH7.5；5)转化子在含潮霉素终浓度为100μg/mL的软琼脂MYG再生培养基上继代培养，稳定生长后保存。
专利摘要
本发明提供了一种利用电穿孔(electroporation)技术对藤仓赤霉(Gibberalla fujikuroi)进行外源基因的遗传转化方法利用真菌细胞壁降解酶对赤霉菌的细胞壁进行处理，得到原生质体并进行纯化，纯化的原生质体和适量外源基因/脱氧核糖核酸(DNA)水溶液进行混合，然后利用电穿孔仪对混合液进行电击处理，电击处理的原生质体可以吸纳外源DNA，从而实现了外源DNA对赤霉菌的遗传转化。本发明的有益效果体现在可以用于藤仓赤霉的分子生物学研究，如研究该菌对水稻的致病分子机制以及该菌的生长发育机制等；可以用来对赤霉菌实施基因工程从而进行遗传改良育种，提高赤霉素的合成能力。
文档编号C12N1/15GK1995362SQ200610155561
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月28日
发明者朱廷恒, 王渭霞, 汪琨, 崔志峰, 裘娟萍 申请人:浙江工业大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan