专利名称:稳定的二核苷酸类组合物和方法
概括地说，本发明涉及稳定辅酶类的方法和组合物，特别是涉及稳定在溶液中的NADH(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)的方法和组合物。
生化反应几乎普遍地都是通过酶来催化的，每种酶都是一种蛋白质，该蛋白质在底物中能引发高度特异的化学变化。
对许多种类的酶而言，为了发挥其功能，需要有称为辅酶的一类低分子量分子参加催化。一般说来，辅酶的化学变化能均衡底物的化学变化，底物的变化是一个反应所期望的结果，例如，辅酶可以从底物中接受氢离子或向底物给出氢离子。
一些临床诊断化验包括氧化还原反应，在这些诊断反应中都是起辅酶作用的二核苷酸的那些氧化-还原反应，这些二核苷酸包括烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸2′磷酸(NADP)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。
二核苷酸是单核苷酸通过磷酸酯电桥连接起来的，单核苷酸是含氮碱和醣的一种磷酸酯，在NAD和NADP中，第一单核苷酸是由碱腺嘌呤和醣核糖而生成的核苷酸的磷酸酯，而第二单核苷酸是由碱烟酰胺和核糖而生成的核苷酸的磷酸酯，在FAD中，由腺嘌呤和核糖的磷酸酯而生成的第一单核苷酸是与碱7，8-二甲基异咯嗪和糖醇D-核糖醇连接的。
在可逆反应中，无论是NAD还是NADP都可以从还原的底物(Sr)通过用缔合的电子接受氢，作为电子受体或对氧化的底物(So)作为电子给体，即
这些反应的有效特征是，这些二核苷酸(即NADH和NADPH)的还原态能吸收340毫微米波长的光，而氧化态(即NAD+和NADP+)就不能吸收。因此，在绘出已知酶量的反应速率的校准曲线后，由已知量的底物、该酶的已知活性和在340毫微米处的光密度可观测到的变化速率，就可以求催化其中一个反应的酶的未知量，同样，由该校准曲线，已知活性的酶的已知量和在340毫微米处的光密度已测定出的变化速率可以求出催化其中一个反应的酶的底物的量。
虽然以诊断化验的价值而言，NADH类似其他还原的二核苷酸，在水溶液中是十分不稳定的，由于配制NADH的水溶液要比配制较稳定的干粉形式的NADH更容易的多、更廉价以及更精确，这样，就给成套诊断化验的生产者和使用者带来了特殊的问题。
一种稳定NADH溶液的方法包括把混合物与有机溶剂一起尽可能多地除去水分，在美国专利申请号4，153，511中，采用一种惰性的吸湿剂和一种有机溶剂来获得含有小于0.5%水的NADH溶液，然而，可得到的非水溶剂的NADH溶液趋向粘性，要准确而又精确地配制达到这一程度是很困难的。
在另一种方法中，如NAD和NADP的辅酶，在酸性pH下，被稳定在一种有机溶剂，最好是如丙三醇或丙二醇的液态多羟基化合物中，如Modrovich美国专利申请号4，153，511所述。然而，这些溶液都比较不稳定且对实际上要求该还原辅酶有100%稳定性的自动化化验特别不适用。
按照本发明的一种稳定的辅酶组合物包括一种碱性水溶液;一种还原的二核苷酸，优选的是在水溶液中，在第一浓度下的NADH或NADPH;一种多羟基烷基溶剂，最好是在水溶液中的丙二醇;和硼酸盐顺式羟基键联化合物，最好是在水溶液中，在第二浓度下的硼酸或其盐，该第二浓度约等于或大于第一浓度。
按照本发明，目前一种优选的、稳定的辅酶组合物包括pH在约8和约11之间的水溶液;浓度约介于10毫摩尔-500毫摩尔之间的Bicine缓冲液(N-N-二〔2-羟乙基甘氨酸〕);浓度介于约0.001毫摩尔-50毫摩尔之间的NADH;硼酸浓度至少等于NADH的浓度且在约10毫摩尔-500毫摩尔范围内;丙二醇浓度介于该水溶液的约20%(体积/体积)-90%(体积/体积)范围内，最优选的辅酶组合物是其中NADH浓度为10毫摩尔，硼酸浓度为50毫摩尔，丙二醇浓度为50%(体积/体积)和Bicine缓冲液浓度为200毫摩尔并将pH调至约10.0。
按照本发明，一种稳定还原的二核苷酸溶液的方法包括以下几个步骤将第一浓度的还原的二核苷酸溶解在碱性水溶液中，将该水溶液缓冲到pH介于约8.0和约11.0之间;在约等于或大于第一浓度的第二浓度下，使该还原的二核苷酸受到硼酸盐顺式羟基键联化合物的作用;以及通过用多羟基烷基溶剂配制约20%(体积/体积)-90%(体积/体积)的水溶液，以还原暴露于水中的该还原的二核苷酸。
图1是在不同的pH值下，在被金属污染的丙二醇中的NADH的稳定性与在未被金属污染的丙二醇中的NADH的稳定性比较的图示。
图2是在已经过各种纯化程序的丙二醇溶液中的NADH的稳定性的图示。
图3是在各种pH值下，在纯丙二醇中的NADH的稳定性与在50%(体积/体积)丙二醇/水中的NADH的稳定性比较的图示。
图4是按照本发明的稳定的二核苷酸溶液最佳pH的测定结果的图示。
NADH是在临床化学中广泛应用在一种辅酶，现行配方通常是按照重新组成的装填的干配方或干冻配方，且都是不稳定的，干配方通过消耗器混合时是易于消耗的试剂，而且干配方的生产包括干冻和干混合的损耗，当必须依赖消耗器适当地重组试剂时，还有由生产者质量检查的损耗。
本发明包括制备和使用高度稳定的NADH水溶液，目前可得到的液体NADH配方被说成是基本上无水的，很难用吸管吸出，与本发明的配方相比较，这些配方更易消耗、且其生产需要更大的劳动强度。
本发明提供了一种液态NADH的溶液，它至少约一年是稳定的。可采用该溶液系统，其中NADH的氧化被用于分析物浓度的测定。NADH的损失可直接通过在340毫微米处的吸光率的损失而测定出或通过偶联的比色系统，荧光分析或电化学分析的损失而测定出。此外，NADH水溶液的应用为前面配制的全部有机溶液提供了更大灵活性。本发明的一个优点，在NADH溶液内除水能测定NADH的性能，该性能取决于导电溶液的存在。
虽然，NADH被结合到带有硼酸盐键联基的亲和层析柱上，用硼酸钠溶液洗脱，并在NADH存在时，通过分光光度分析来测定洗脱液〔Maestas等人色层分析法杂志189 225-231(1980)〕，但迄今为止尚没有人提出NADH在这种洗脱液中特别稳定或向这种洗脱液加入一种有机溶剂就会产生一种特别稳定的辅酶组合物。
一般说来，按照本发明，通过用4埃(
)分子筛来处理丙二醇并用硼氢化钠从该溶液中除去少量的氧化剂来稳定本发明的NADH或其他还原的二核苷酸，该经处理的丙二醇与含有硼酸的缓冲液，以1∶1混合并将pH调至10.0，该NADH或NADH的还原类似物很容易溶解在含水的碱性物质中，该溶液可在塑料或玻璃贮藏装置中贮藏至少约一年，该NADH溶液可以重复使用多次且在敞开的容器中不会遭受任何损失。
人们认为硼酸盐阴离子是通过在核糖的2′，3′位的1，2-顺式二醇连接来结合二核苷酸的，由于这个原因，硼酸及其盐和硼酸及其盐的衍生物通常可以称为顺式羟基键联化合物，见Fulton“Boronate Ligands in Biochemical Seapralions-，Amicon Corporation，Scientific Systems Division，Danvers，Massachusetts(1981)。按照本发明，有使用价值的硼酸的硼酸盐包括苯基硼酸盐、烷烃硼酸盐、2-苯基乙烷硼酸盐、3-氨基苯硼酸和其它硼酸盐酯，见本文收入参考的下列公开文献Fulton，上述;Glad等人色层分析法杂志200，254-260(1980)及Bouriotis等人色层分析法杂志，210，267-278(1981)。虽然键联的氢和疏水作用也起一部分作用，但是在NAD(H)、NADP(H)、和FAD(H2)中有多过一个容易接近的1，2-顺式二醇的存在将有助于牢固地与硼酸盐结合，Fulton上述。
尽管不打算使本发明受任何特殊作用方式的限制，但人们认为硼酸盐结合到二核苷酸的这些顺式羟基上，通过在相信的不稳定的键的这些羟基会阻止亲核的作用，这种亲核作用可引起该分子降解到单核苷酸上。
按照本发明，采用丙二醇使水和还原吡啶鎓化合物之间的互相作用减至最小，并借此使氧化作用减至最小。人们认为通过降低该溶液的电介质常数可以提供更稳定的NADH。
采用Bicine缓冲液可使该溶液的pH保持在约8-11之间，NADH在高pH时，特别是pH8.0以上更稳定，Lowry等人生物化学杂志，236 2756-2759(1961)和Wu等人临床化学，32 314-319(1986)，通常认为高pH能维持二核苷酸的还原态并防止硼酸盐的损失，用硼氢化钠处理约200毫克/升的丙醇过夜，这种处理将使溶液中的氧化作用降到最小值，当反应时，就生成了水、硼酸和氢气，虽然，目前获优选的是硼氢化钠，但是预先处理其它的硼氢盐类，由于硼氢盐类分解而生成很有用的硼酸。
用4埃分子筛净化丙二醇，以除去丙二醇中的水、氧化剂，如醛和过氧化物和其他污染物。
在下列实施例中，将更详细地说明本发明。在实施例1中，处理罐装的、疑有金属污染的丙二醇以改进其性能，并将该性能与瓶装的丙二醇的性能相比较，也将纯丙二醇组成与实施例1中的水溶液比较。按照本发明的实施例2，提供了在不同的pH值下，NADH组合物的比较以及确定NADH溶液稳定性的最佳pH值。在实施例3中，验证了本发明目前优选实施的贮藏期限。在实施例4和5中，分别叙述了本发明的NADH组合物与血脲氮(BUN)试剂结合或与甘油三酯化验试剂结合时的稳定性。实施例6，涉及用按照本发明的稳定组合物在各种物质中的混合试剂来测定血氨。在实施例7中，验证本发明的稳定组合物在BUN自动化验中的适用性。在实施例8中，考虑把本发明的二核苷酸应用在丙氨酸转氨酶化验中。实施例9叙述了本发明稳定组合物在天冬酶氨基转移酶化验中的应用，实施例10，涉及本发明NADPH溶液的应用。
实施例1为了研究不同pH的影响，比较使用去除各种污染物经处理的丙二醇与未经处理的丙二醇以及比较使用“纯”丙二醇与使用含水混合物的影响，进行了下列诸实验。
八个不同实验条件分为三组第一组，未处理的丙二醇;第二组，经处理的丙二醇;和第三组，50%丙二醇溶液。
在第一组中，有四个试样(1)取自金属罐的丙二醇和22毫克/毫升NADH;(2)pH8.4的瓶装丙二醇和22毫克/毫升NADH;(3)pH10.3的瓶装的丙二醇和22毫克/毫升NADH;和(4)pH11.8的瓶装的丙二醇和22毫克/毫升NADH。
在第二组中，有三个试样(5)取自上述第一组的编号(2)和硼氢化钠加上22毫克/毫升NADH一起处理;(6)取自上述第一组的编号(2)和硼氢化钠和Chelex树脂5%重量/体积(西格马药品公司St.Louis，Missouri)加上22毫克/毫升NADH一起处理;和(7)取自上述第一组的编号(2)只与分子筛3%重量/体积，8-12目(Davison Chemical Division，Baltimore，Maryland)一起处理。
在第三组中，有一个试样，即(8)，它包含50%瓶装丙二醇、100毫摩尔Bicine、和pH8.4的50毫摩尔硼酸;以及11毫克/毫升的NADH。
可将NADH溶液用作含有四唑鎓盐心肌黄酶的反应混合物的试样，在取样间隔时间结束时所剩余的NADH的量是与由下列反应而生成的甲
-INT的量成比例的。
即在试验溶液中，所存在的NADH越多，反应结果所生成的甲-INT就越多。
所有NADH试样均被贮藏在45℃，取样间隔时间等于图1和图2所示的天数。
该实验反应结果的根据，如图1和图2所示，已测出罐装的丙二醇试样是十分不稳定的，也已测出pH8.4时的溶液要比pH10.3时的溶液更不稳定，pH10.3的溶液要比PH11.8的溶液更不稳定，虽然在这些条件下，NADH溶液，在14天后，至多只有75%稳定。也已推断出，污染的丙二醇和硼氢化钠以及分子筛一起处理，可以增加污染的丙二醇的稳定性，而Chelex树脂就无所帮助。
实施例2该实验是研究NADH在不同的pH值下，在50%体积/体积(溶液/水)中的稳定性与上述“纯”丙二醇的反应结果的比较，采用实施例1中的试验程序。
图3所示的反应结果说明，在下同pH值下，当pH为8.3或以下时，如图3上面三条线所示的“纯”丙二醇组合物要比由图3下面三条线所示的50%溶液更稳定。
实施例3优选的二核苷酸稳定溶液是由丙二醇和4%重量/体积的4埃分子筛一起处理并加入2毫克/毫升硼氢化钠而配制的，该溶液贮藏在排气系统中过夜或至少8小时，配制pH9时的200毫摩尔Bicine和100毫摩尔硼酸蒸馏水溶液，该溶液以1∶1与丙二醇混合，以使最终浓度为50%丙二醇、50毫尔硼酸、和100毫摩尔Bicine，用氢氧化钠将pH调至10，慢慢地加入约11毫克/毫升的NADH，该溶液在下文称为二核苷酸溶液，在2-8℃下，贮藏的未混合的该溶液至少约一年是稳定的，标准的稳定性为在-20℃下，约一年;在2-8℃下，约一年;在室温下，2个月;在37℃下，1个月;在45℃下，2周，测定临床分析物时，该溶液可与酶溶液混合。
如图4所示，优选的、二核苷酸溶液的稳定性试验是在45℃高温至模拟在低温下延长贮藏的作用而进行的。如图4所示的结果指出，在使用前，贮藏的按照本发明溶液的pH约10为最佳。
按照该实施例，目前较优选的二核苷酸溶液的成分包括Bicine(＃B-3876从西格马药品公司St.Louis.Missouri得到);NADH(＃N-8129从西格马药品公司得到);硼氢化钠(＃S-9125从酉格马药品公司得到);丙二醇(食品级，从美国密歇根州中部Dow药品公司得到)和硼酸(从Baker药公司得到)。
实施例4当将实施例3的二核苷酸溶液与20单位/毫升脲酶溶液及与在pH8.3时，在15毫摩尔三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的0.2毫克/毫升α-酮戊二酸以1∶80稀释的谷氨酸脱氢酶混合时，实施例3的二核苷酸溶液可用于测定BUN的试样，如该溶液含有0.1%叠氮化钠，该混合试剂在三个月内可用于测定BUN浓度，在三个月后，这种混合的化验试剂系统仅损失原线性权利要求
的150毫克/升的15%。
实施例5当实施例3的二核苷酸溶液与含有100单位/毫升脂肪酶、5单位/毫升丙三醇激酶、2单位/毫升丙酮酸激酶、1单位/毫升乳酸脱氢酶的缓冲液;0.7毫摩尔磷酸烯醇丙酮酸;0.05毫摩尔三磷酸腺苷(ATP)及10毫摩尔氯化镁以1∶80混合时，实施例3的二核苷酸溶液可用于测定在试样中的甘油三酯的浓度，当该溶液混合时，该溶液在一个月内可用于测定试样中的甘油三酯。
实施例6血清的氨测定在毒理学上是重要的，大多数医院每个月都要进行几次氨试验，然而，由于对这个试验要求有时间间隔期限，因此必须有相对稳定的试剂，实施例3的二核苷酸可在pH8.5时在三羟甲基氨基甲烷缓冲液中，与含有10单位/毫升谷氨酸脱氢酶和0.5毫克/毫升α-酮戊二酸的无氨溶液以1∶80混合，快速地用于测定血清中的氨水平，未混合的这种溶液至少稳定约一年之久，当混合时，混合溶液至少稳定1个月。
实施例7BUN也可以通过采用辐射衰减化验的试剂进行荧光测定，它是本文收入参考的美国专利号4，495，293通常所特有的内容，该试剂可分为3瓶，这种试剂可由三瓶物质来配制，第一瓶含有NADH溶液;第二瓶含有1600单位/毫升脲酶、16毫克/毫升α-酮戊二酸和在pH7时，在磷酸缓冲液中的400单位/毫升谷氨酸脱氢酶以及25%丙三醇加5×10毫克/升荧光素钠;第三瓶含有0.5毫克/毫升medola蓝、thiazoyl蓝和pH2.5柠檬酸盐缓冲剂。
当第一瓶和第二瓶与pH7.5的100毫摩尔磷酸缓冲液以1∶1∶40相混合时，血液试样被水解，产生的氨在谷氨酸中被吸收与在NADH中伴随的损失相比是减少了，剩余的NADH在第二反应中可与用上述缓冲液以1∶40稀释的第三瓶反应催化生成MTT-甲
，所产生的MTT-甲
的量是与在原试样中BUN的量成比例的，该试剂系统独特地产生的CVs小于临床试样的6%，第一瓶、第二瓶和第三瓶的混合液可用于检测试样中的BUN，至少约一年。
实施例8丙氨酸转氨酶(ALT)也可以通过用实施例3的二核苷酸溶液、500毫摩尔L-丙氨酸、15毫摩尔α-酮戊二酸，0.10毫摩尔吡哆醛-5-磷酸(任意的)、及600单位/升乳酸脱氢酶来测定，当该混合物混合时，至少稳定一个月，可用于定量地测定血清或血浆中的ALT。
实施例9天冬氨酸氨基转移酶(AST)可通过采用实施例3的二核苷酸溶液与240毫摩尔L-天冬氨酸、12毫摩尔α-酮戊二酸、0.10毫摩尔吡哆醛-5-磷酸、420单位/升苹果酸脱氢酶及600单位/升乳酸脱氢酶混合来测定，该混合物至少稳定一个月，可用于定量地测定血清或血浆中的AST。
实施例10在实施例3的二核苷酸溶液中，可用NADPH代替NADH，在诊断试验中的某些酶可用NADPH代替NADH，由Proteus SP.纯化的谷氨酸脱氢酶只能用NADH，这种酶可用于代替实施例2中的谷氨酸脱氢酶用以测定BUN。
虽然在优选的实施例中已描述了本发明，但要理解本发明的改进和提高，对本领域技术熟练的人们来说将会存在，如本发明主要是通过NADH的稳定溶液、按照本发明可被稳定的其他二核苷酸溶液来举例例证的，又如考虑到，按照本发明，NADPH、还原的3-乙酰吡啶腺膘呤二核苷酸、还原的3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸酯、还原的硫逐亭酰胺腺嘌呤二核苷酸、还原的硫逐亭酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酯及还原的烟酰胺次黄嘌呤二核苷酸也可被稳定。
同样，虽然在上述实施例中采用了Bicine缓冲液，但也考虑了采用在优选的pH范围内能维持二核苷酸溶液的pKa和具有充分缓冲容量的任何缓冲液，如其他适宜的缓冲液包括Tris〔三羟甲基氨基甲烷〕;Hepes〔4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸〕;三乙醇胺;MOPS〔4-吗啉丙烷磺酸〕;CHES〔2-环己基氨基)乙烷磺酸〕;以及CAPS〔3-环己基氨基-1-丙烷磺酸〕。
按照本发明，在其他化验分析中，有用的辅酶组合物包括涉及乳酸脱氢酸丙酮酸化验分析乳酸〔即LDH(P到L)〕以及脲酸。
此外，本发明还考虑到采用与水混溶的其他稳定的有机溶剂来代替丙二醇，只要这些有机溶剂不与还原的二核苷酸反应，形成氢键除外。具有2到4个羟基和2到10个碳原子的液态多羟基化合物是优选的，这些优选的多羟基化合物包括丙三醇和1，2-丙二醇。
也考虑到按照本发明的辅酶组合物可以制成浓溶液和稀溶液使用。
因此，如本发明包含的所有变化，可用以包括在本发明的权利要求
范围内。
权利要求
1.一种稳定的辅酶组合物，它包括一种碱性的水溶液；一种在上述水溶液中的在第一浓度下的还原的二核苷酸；一种在上述水溶液中的多羟基烷基溶剂；及在上述水溶液中的在第二浓度下的硼酸盐顺式羟基键联化合物，上述第二浓度约等于或大于上述第一浓度。
2.根据权利要求
1所述的辅酶组合物，其中所述多羟基烷基溶剂是在第一浓度下，在上述水溶液约20%(体积/体积)至90%(体积/体积)的范围内。
3.根据权利要求
2所述的辅酶组合物，其中所述水溶液包括能有效地维持上述水溶液pH大于8.0的缓冲液。
4.根据权利要求
3所述的辅酶组合物，其中所述硼酸盐顺式羟基键联化合物是从一组包括硼酸、硼酸盐、硼酸的硼酸盐衍生物以及硼酸的硼酸盐衍生物的盐中选择的。
5.根据权利要求
4所述的组合物，其中所述多羟基烷基溶剂是丙二醇。
6.根据权利要求
5所述的组合物，其中所说上述水溶液的pH是在约8和约11之间。
7.根据权利要求
6所述的组合物，其中上述第二浓度是在约10和约50毫摩尔之间。
8.根据权利要求
7所述的组合物，其中所说上述多羟基烷基溶剂的浓度约等于上述水溶液的50%(体积/体积)。
9.根据权利要求
8所述的辅酶组合物，其中所述还原的二核苷酸是从一组包括还原的吡啶二核苷酸和还原的吡啶二核苷酸磷酸盐中选择的。
10.根据权利要9所述的辅酶组合物，其中所述还原的二核苷酸是NADH，其中所述第一浓度是介于约0.001毫摩尔-50毫摩尔之间。
11.一种稳定还原的二核苷酸溶液的方法，包括以不几个步骤将第一浓度的还原的二核苷酸溶解在一种碱性水溶液中;将水溶液缓冲至pH介于约8.0和约11.0之间;在约等于或大于第一浓度的第二浓度下，使该还原的二核苷酸受到硼酸盐顺式羟基键联化合物的作用;以及通过用多羟基烷基溶剂配制约20%(体积/体积)-90%(体积/体积)的水溶液，以还原暴露于水中的该还原的二核苷酸。
专利摘要
一种还原的二核苷酸，最好是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)被稳定在含有丙二醇、硼酸和能在pH8-11范围内缓冲的缓冲液的碱性水溶液中，稳定液含有50％(体积/体积)以上的水，剩余体积的稳定液含有除去了各种氧化剂经化学处理的丙二醇。可将该试剂本身或该试剂与鉴定试剂系统一起用于临床化验室中。
文档编号C12Q1/00GK87100939SQ87100939
公开日1987年11月4日 申请日期1987年2月23日
发明者戴维·A·约斯特 申请人:艾博特公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan